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Article de recherche

L'extinction de LINC00707 atténue l'inflammation et le stress oxydatif dans les microglies BV2 stimulées par le LPS via l'axe miR-145-5p/TRAF6 dans la lésion médullaire

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11 septembre 2026

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1Department of Nursing, Zhangjiakou First Hospital, 2Department of Orthopedics, Zhangjiakou First Hospital, 3Department of Pediatrics, Zhangjiakou First Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

L'expression plasmatique de LINC00707 est augmentée dans les lésions de la moelle épinière et favorise l'inflammation et le stress oxydatif médiés par les microglies via l'axe de signalisation miR-145-5p/TRAF6. L'inhibition de LINC00707 atténue ces réponses pathologiques, soulignant son potentiel comme cible thérapeutique.

Résumé

La lésion de la moelle épinière (LME) provoque un handicap à vie, réduit considérablement le bien-être et impose un fardeau socio-économique important. Cette étude a examiné le rôle de LINC00707 dans la LME par la régulation de l'axe de signalisation miR-145-5p/TRAF6. Des échantillons de plasma provenant de 30 sujets sains et de 75 patients atteints de LME ont été analysés pour l'expression de LINC00707, de miR-145-5p et de TRAF6 à l'aide de la RT-qPCR. Les associations entre les niveaux plasmatiques de LINC00707 et les facteurs pro-inflammatoires ont été évaluées chez les patients atteints de LME. Des cellules microgliales BV2 ont été exposées à 100 ng/mL de LPS, et les facteurs liés à l'inflammation et au stress oxydatif ont été mesurés. Les interactions moléculaires ont été évaluées à l'aide d'un test rapporteur double luciférase. Une analyse de régression logistique a été utilisée pour identifier les facteurs associés à l'expression de LINC00707. Les niveaux plasmatiques de LINC00707 et de TRAF6 étaient augmentés chez les patients atteints de LME, tandis que les niveaux de miR-145-5p étaient réduits. Les niveaux plasmatiques de LINC00707 étaient positivement corrélés aux niveaux plasmatiques des facteurs inflammatoires. LINC00707 agissait comme une éponge moléculaire pour miR-145-5p, et TRAF6 était un gène cible de miR-145-5p. L'inhibition de LINC00707 a diminué les facteurs inflammatoires, les substances pro-stress oxydatif et les niveaux d'ARNm de TRAF6 dans les cellules BV2. L'inhibition de miR-145-5p a produit des effets opposés. Ces résultats suggèrent qu'une expression élevée de LINC00707 est associée à la gravité de la LME et qu'une diminution de l'expression de LINC00707 pourrait atténuer l'inflammation et le stress oxydatif médiés par les microglies en régulant l'axe de signalisation miR-145-5p/TRAF6.

Introduction

La lésion médullaire (SCI) est une affection traumatique qui endommage la moelle épinière, une composante essentielle du système nerveux central. La SCI perturbe directement les voies de conduction neuronale entre la moelle épinière et le cerveau, entraînant des troubles majeurs des fonctions motrices, sensorielles et autonomiques1,2. Des études épidémiologiques ont rapporté une incidence annuelle d’environ 5 cas pour 100 000 individus, la mortalité liée à la maladie atteignant jusqu’à 16,7 %3,4. Une enquête canadienne a estimé le coût de réadaptation à vie pour chaque patient atteint de SCI à hauteur de 336 000 dollars américains5. L’incidence élevée, la mortalité importante et les coûts substantiels associés au diagnostic, au traitement et à la réadaptation font de la SCI un défi clinique majeur nécessitant des stratégies thérapeutiques améliorées.

La progression pathologique de la lésion médullaire (SCI) comprend deux stades : une lésion primaire et une lésion secondaire. La lésion primaire résulte d'une compression mécanique traumatique ou d'une rupture du tissu médullaire, tandis que la lésion secondaire est induite par des processus pathologiques, notamment l'inflammation et le stress oxydatif6,7. Dans des conditions physiologiques, la neuroinflammation médiée par les microglies contribue à l'homéostasie du système nerveux central8,9,10. Toutefois, après une lésion médullaire, les microglies s'activent de manière excessive et libèrent de grandes quantités de médiateurs pro-inflammatoires11,12. Ces médiateurs provoquent une production excessive d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), entraînant des lésions neuronales, la mort cellulaire et l'aggravation de la lésion médullaire secondaire13,14. Par conséquent, la suppression de l'activation excessive des microglies et l'interruption de la cascade inflammatoire représentent des stratégies thérapeutiques prometteuses pour favoriser la récupération neurologique et améliorer les résultats après une lésion médullaire.

Les ARN non codants longs (lncARN) constituent une classe d'ARN non codants de plus de 200 nucléotides qui ne possèdent pas de potentiel de codage protéique15. Initialement considérés comme un « bruit » transcriptionnel, les lncARN sont désormais reconnus comme des régulateurs importants de divers processus physiologiques et pathologiques16. Des études récentes ont démontré que les lncARN jouent des rôles essentiels dans les lésions neuronales. L'ARN non codant intergénique long 707 (LINC00707) s'est imposé comme un régulateur important des troubles du système nerveux. Des études antérieures ont rapporté que LINC00707 aggrave les lésions cérébrales traumatiques en amplifiant l'inflammation médiée par les microglies17. De plus, Zhu et al. ont démontré que la suppression de LINC00707 atténuait de manière significative l'inflammation et l'apoptose induites par le lipopolysaccharide (LPS) dans les cellules PC1218. Ces résultats fournissent une base théorique préliminaire pour explorer le rôle de LINC00707 dans la lésion médullaire (SCI). Cependant, il reste à déterminer si LINC00707 régule l'inflammation médiée par les microglies durant la lésion médullaire (SCI).

Les ARNl agissent comme des éponges moléculaires par le biais du mécanisme d'ARN endogène compétitif (ceARN), piégeant les microARN (miARN) et régulant l'expression des gènes cibles en aval19. Ce mode de régulation est largement impliqué dans la pathogenèse de diverses maladies. Notamment, le miR-145-5p est significativement sous-régulé dans les tissus de lésion médullaire (SCI)20 et lors de lésions induites par le LPS21, et sa surexpression atténue efficacement les réponses inflammatoires et au stress oxydatif des microglies22. Le facteur associé au récepteur du facteur de nécrose tumorale 6 (TRAF6) joue également un rôle essentiel dans la pathologie de la lésion médullaire23,24,25. Cependant, il reste à déterminer si LINC00707, miR-145-5p et TRAF6 exercent des fonctions régulatrices coordonnées dans la lésion médullaire.

Dans la présente étude, l'expression de LINC00707 était significativement augmentée dans les cellules microgliales stimulées par le LPS. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que LINC00707 pourrait agir comme un régulateur pro-inflammatoire dans la microglie et que sa diminution pourrait atténuer la réponse neuroinflammatoire, améliorant ainsi la progression pathologique de la lésion médullaire (SCI). Cette étude a examiné si LINC00707 régule les réponses inflammatoires microgliales et contribue à la pathogenèse de la SCI.

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Protocole

Cette étude a été approuvée par le comité d'éthique de l'hôpital Zhangjiakou First (numéro d'approbation : 2024-KY-18). Tous les participants ont été informés des objectifs de l'étude et des risques éventuels, et ont donné leur consentement éclairé par écrit avant leur inclusion. Des échantillons de sang veineux ont été prélevés chez des sujets témoins sains lors d'examens médicaux de routine et chez des patients présentant une lésion médullaire (SCI) immédiatement après leur admission à l'hôpital. Les analyses en laboratoire ont été réalisées par le laboratoire clinique de l'hôpital. Les outils de recherche utilisés dans ce protocole sont énumérés dans la Table des matériels.

1. Sujets
Un total de 75 patients présentant une lésion médullaire ont été recrutés à l'hôpital Zhangjiakou First entre janvier 2023 et janvier 2025. Les critères d'inclusion étaient une lésion médullaire confirmée par tomodensitométrie (CT) ou imagerie par résonance magnétique (MRI), ainsi qu'un délai entre le traumatisme et l'admission à l'hôpital inférieur ou égal à 12 h. Les critères d'exclusion étaient un antécédent de traumatisme ou de chirurgie de la moelle épinière ou du cerveau au cours des 6 mois précédents, une maladie cardiovasculaire sévère incluant un infarctus du myocarde ou une arythmie, une grossesse ou une période de lactation, ainsi que la présence de tumeurs malignes, une atteinte hépatique ou rénale, une maladie cérébrovasculaire sévère ou des maladies infectieuses.

Selon les normes de classification neurologique de l'American Spinal Injury Association (ASIA)26, 75 patients présentant une lésion médullaire ont été classés en fonction de leur fonction neurologique normale (n = 21), lésion médullaire incomplète (n = 36) et lésion médullaire complète (n = 18). La répartition des sites de lésion était la suivante : cervical, 36,0 % ; thoracique, 30,7 % ; et lombaire, 33,3 %. Trente individus sains appariés à la population étudiée ont été recrutés aléatoirement pour constituer le groupe témoin. Des informations cliniques de base ont été recueillies pour tous les participants. Les critères d'inclusion pour les individus sains étaient l'absence d'antécédents de traumatisme médullaire ou cérébral, de chirurgie ou de troubles neurologiques ; l'absence d'antécédents de maladies inflammatoires chroniques, de troubles auto-immuns ou de malignités ; l'absence de maladie cardiovasculaire, hépatique ou rénale sévère ; l'absence d'infection aiguë ou chronique au cours des 4 semaines précédentes ; l'absence de grossesse ou d'allaitement ; et un appariement par âge et sexe avec le groupe présentant une lésion médullaire.

La mesure d'indépendance fonctionnelle (FIM) a été utilisée pour évaluer l'autonomie fonctionnelle dans les activités quotidiennes. Le score FIM maximal est de 126. Les scores de sensation tactile, d'acmésthésie et moteur ont été utilisés pour évaluer les fonctions sensorielle et motrice. Les scores maximaux de sensation tactile et d'acmésthésie étaient de 112, et le score moteur maximal était de 100. Des scores plus faibles indiquent un déficit neurologique plus sévère.

2. Culture cellulaire, construction du modèle et transfection
Les cellules microgliales murines immortalisées BV2 ont été obtenues auprès du Centre de ressources cellulaires de l'Institut de biotechnologie de Shanghai. Les cellules ont été cultivées dans un milieu de culture modifié d'Eagle (DMEM) à haute teneur en glucose, complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), de pénicilline (100 U/mL) et de streptomycine (100 U/mL). Les cellules ont été maintenues à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂.

Pour la construction du modèle, les cellules BV2 ont été stimulées avec 0, 10, 20, 50, 100, 150 ou 200 ng/mL de lipopolysaccharide (LPS) pendant 24 h. La concentration optimale de LPS a été sélectionnée en fonction des résultats expérimentaux.

Pour la transfection, les cellules BV2 ont été ensemencées dans des plaques de 6 puits et transfectées une fois qu'elles ont atteint la confluence appropriée. Un réactif de transfection a été utilisé à raison de 1,5 µL par puits selon les instructions du fabricant. Après 6 h, le milieu de culture a été remplacé par du milieu frais, et les cellules ont été cultivées pendant 24 h supplémentaires. Le construct de silençage de LINC00707, le contrôle négatif correspondant, l'oligonucléotide miR-145-5p et l'oligonucléotide contrôle correspondant ont chacun été utilisés à une concentration de 50 nM par puits. Toutes les expériences de transfection ont été répétées indépendamment au moins 5 fois, avec 3 réplicats parallèles par expérience indépendante. Les données ont été analysées statistiquement à l'aide des résultats d'au moins 5 expériences indépendantes.

3. ELISA
Les surnageants de culture de cellules BV2 transfectées et stimulées par le LPS ont été recueillis par centrifugation à 12 000 × g pendant 10 min, et les concentrations d'interleukine-1β (IL-1β), d'IL-6 et de facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) ont été mesurées à l'aide des kits ELISA correspondants. Brièvement, le test a été réalisé en incubant successivement avec un anticorps biotinylé, un conjugué streptavidine-HRP et un substrat TMB, conformément aux instructions du fabricant. L'absorbance a été mesurée à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques. Les concentrations en cytokines ont été déterminées à partir de courbes standards. Chaque échantillon a été mesuré en triplets, et six expériences indépendantes ont été réalisées.

4. Mesure des ERO
Les niveaux intracellulaires d'espèces réactives de l'oxygène (ERO) dans les cellules BV2 stimulées par le LPS ont été mesurés à l'aide d'un kit de dosage des espèces réactives de l'oxygène. Brièvement, les cellules ont été incubées avec 10 µmol/L de DCFH-DA à 37 °C pendant 20 min. Après l'incubation, le surnageant a été éliminé et les cellules ont été lavées 3 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) afin d'éliminer l'excès de sonde extracellulaire. L'intensité de fluorescence a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaque aux longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 488 nm et 525 nm, respectivement. Les niveaux relatifs d'ERO ont été calculés à partir de l'intensité de fluorescence. Tous les échantillons ont été analysés en triplicata, et l'ensemble de l'expérience a été répété de manière indépendante au moins 5 fois.

5. Détection du malondialdéhyde, de la superoxyde dismutase et du glutathion
Les cellules BV2 traitées ont été recueillies et des homogénats cellulaires ont été préparés. Les échantillons ont été centrifugés à 12 000 × g pendant 10 min à 4 °C afin d'obtenir le surnageant. Des kits de détection commerciaux pour le malondialdéhyde (MDA), la superoxyde dismutase (SOD) et le glutathion (GSH) ont été utilisés conformément aux instructions du fabricant afin de déterminer leurs concentrations dans les surnageants cellulaires. Tous les échantillons ont été analysés en triple, et l'ensemble de l'expérience a été répété de manière indépendante au moins 5 fois.

6. Essai rapporteur double luciférase
Des fragments de la région non traduite 3' (3' UTR) de LINC00707 et de TRAF6 contenant les sites de liaison prévus pour miR-145-5p, ainsi que les séquences mutantes correspondantes, ont été clonés dans le vecteur rapporteur luciférase pmirGLO afin de générer des constructions rapporteuses de type sauvage (WT-LINC00707 et WT-TRAF6) et mutantes (MUT-LINC00707 et MUT-TRAF6). Les cellules BV2 ont été co-transfectées avec les constructions rapporteuses et des oligonucléotides miR-145-5p, puis cultivées pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été récoltées, et les activités de la luciférase de luciole et de la luciférase Renilla ont été mesurées à l’aide d’un lecteur de microplaques.

7. RT-qPCR
L'ARN total a été extrait à l'aide d'un réactif d'extraction d'ARN. La qualité de l'ARN a été évaluée à partir du rapport OD₂₆₀/OD₂₈₀, les valeurs comprises entre 1,8 et 2,0 étant considérées comme acceptables. Environ 1 µg d'ARN total a été transcrit en ADN complémentaire (ADNc) à l'aide d'un kit de transcription inverse. L'expression génique a été quantifiée par RT-qPCR en utilisant un mélange maître PCR SYBR Green. La transcription inverse a été réalisée à 42 °C pendant 15 min, suivie d'une inactivation de la transcriptase inverse à 95 °C pendant 3 min. L'ADNc synthétisé a été stocké à −20 °C jusqu'à l'analyse. La PCR quantitative en temps réel a été effectuée avec une étape de pré-dénaturation à 95 °C pendant 1 min, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 5 s et d'hybridation et extension à 60 °C pendant 15 s. Les signaux de fluorescence ont été collectés à la fin de chaque étape d'hybridation et d'extension. Une analyse de la courbe de fusion a été réalisée à 95 °C pendant 15 s, suivie de 60 °C pendant 1 min. Les niveaux d'expression relatifs ont été calculés selon la méthode 2⁻ΔΔCt. GAPDH ou 5S a été utilisé comme référence interne pour la normalisation de l'expression génique. Les séquences des amorces étaient les suivantes : LINC00707, amorce sens 5'-CCAACAGGGTATCAGAATTCTC-3' et amorce antisens 5'-TGCTGACAATAGCCATTAGG-3' ; miR-145-5p, amorce sens 5'-GCCGAGGTCCAGTTTTCCCA-3' et amorce antisens 5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3' ; TRAF6, amorce sens 5'-ATTACAACTGAGGTGCTTCT-3' et amorce antisens 5'-GCATCTGGTTCTGTTATAGGA-3' ; GAPDH, amorce sens 5'-ATCCCATCACCATCTTCCAGG-3' et amorce antisens 5'-CGCCCCACTTGATTTTGG-3' ; et 5S, amorce sens 5'-TCGTCTGATCTCGGAAGCTAA-3' et amorce antisens 5'-AAGCCTACAGCACCCGGTAT-3'.

8. Analyse statistique
Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide d'un logiciel statistique. La normalité de la distribution des données a été évaluée à l'aide du test de Shapiro-Wilk, un seuil de P > 0,05 indiquant une distribution normale. Les données normalement distribuées ont été exprimées sous la forme moyenne ± écart-type (ET), tandis que les données non normalement distribuées ont été présentées sous la forme médiane (P25, P75). Pour les variables continues à distribution normale, les comparaisons entre deux groupes ont été effectuées à l'aide du test t de Student, et les comparaisons entre plusieurs groupes ont été réalisées à l'aide d'une ANOVA à un facteur suivie du test post hoc de Tukey. Pour les données non normalement distribuées, le test de Mann-Whitney U a été utilisé pour les comparaisons à deux groupes, et le test de Kruskal-Wallis a été utilisé pour les comparaisons entre plusieurs groupes. Le test du chi-deux a été employé pour analyser les variables catégorielles entre les groupes. Des analyses de régression logistique univariée et multivariée ont été utilisées afin d'évaluer les facteurs cliniques associés à l'expression de LINC00707. Les variables continues ont été dichotomisées selon la médiane de la cohorte (groupe à valeur élevée = 1 ; groupe à valeur basse = 0). Les variables présentant une valeur de P < 0,05 dans l'analyse de régression logistique univariée ont été intégrées dans l'analyse de régression logistique multivariée. Les résultats ont été exprimés sous forme de rapports de cotes (odds ratios, OR) avec des intervalles de confiance à 95 % (IC 95 %), un OR > 1 indiquant une association positive et un OR < 1 une association négative. Toutes les expériences sur les phénotypes cellulaires ont inclus au moins quatre réplicats biologiques indépendants, avec trois réplicats techniques par réplicat biologique. Une valeur de P < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

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Résultats

Les taux plasmatiques de LINC00707 étaient élevés chez les patients atteints de LS
Les caractéristiques cliniques de base de 30 sujets sains et de 75 patients atteints de LS ont été analysées. Par rapport aux sujets sains, les patients atteints de LS présentaient des scores nettement plus faibles en ce qui concerne la sensibilité tactile, l'acmésthésie, la motricité et la mesure d'indépendance fonctionnelle (FIM), indiquant une altération des fonctions sensorielle et motrice. De plus, les taux sériqu...

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Discussion

La lésion de la moelle épinière (LME) est un trouble traumatique grave du système nerveux central qui entraîne une altération ou une perte totale de la conduction nerveuse au niveau de la moelle épinière, provoquant des dysfonctionnements moteurs, sensoriels et autonomes permanents, ainsi que des conséquences physiologiques et psychologiques profondes29˒30. La gravité de ces atteintes augmente généralement avec l'importance de la LME. Dans la présente étude, l'expression pl...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt concurrentiel.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le projet de recherche en sciences médicales du Hebei (subvention no 20251479).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
tube microcentrifuge de 1,5 mLKIRGENKG2211Tube en polypropylène avec bouchon à visser, sans DNase/ni RNase, non pyrogène, force centrifuge maximale 20 000 × g, pour le stockage et la centrifugation des échantillons d'ARN/protéines.
Plaque de culture cellulaire à 6 puitsCorning3516Plaque en polystyrène traitée pour culture cellulaire, à fond plat, stérile et emballée individuellement ; volume de puits de 16,8 mL avec une surface de croissance de 9,5 cm²
Aiguille de prélèvement sanguinBecton, Dickinson and Company367283Aiguille jetable pour prélèvement sanguin BD Vacutainer. Conçue avec une aiguille double extrémité, dont une pour la ponction veineuse et l'autre pour la connexion au porte-tube et au tube sous vide afin de permettre la collecte multipoches. Enduite de silicone afin de minimiser le malaise du patient lors de l'insertion.
Tubes de prélèvement sanguinBecton, Dickinson and Company367605Tubes à vide de prélèvement sanguin BD Vacutainer. Des bouchons codés par différentes couleurs indiquent divers additifs, correspondant à des tests de laboratoire spécifiques.
Ligne cellulaire immortalisée de microglie murine BV2Centre de ressources cellulaires de l'Institut de biotechnologie de ShanghaiRRID : CVCL_0182Ligne cellulaire murine de microglie immortalisée exprimant de façon stable des marqueurs spécifiques de la microglie (Iba1, CD11b, F4/80). Après stimulation par le LPS, les cellules BV2 sécrètent des cytokines pro-inflammatoires (IL-1β, IL-6, TNF-αα) et accumulent des ERO intracellulaires, ainsi que du MDA, afin de mimétiser l'activation inflammatoire microgliale in vivo après une lésion de la moelle épinière. Les cellules sont cultivées dans un DMEM à haute teneur en glucose, complété avec 10 % de SFB et 1× pénicilline-streptomycine, maintenu à 37 °C avec 5 % de CO₂2 incubateur humidifié ; mis en culture lorsqu'il atteint 70 %–80 % de confluence pour éviter une surexcitation.
Kit d'essai de malondialdéhyde (MDA) cellulaireNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA003-4-2Kit colorimétrique basé sur une microplaque pour la détection quantitative du malondialdéhyde cellulaire, un marqueur de la peroxydation lipidique. Le MDA réagit avec l'acide thiobarbiturique (TBA) lors d'un chauffage pour former des adduits rouges ; l'absorbance est mesurée à 532 nm à l'aide d'un spectrophotomètre à microplaque. Optimisé pour les échantillons d'extraits cellulaires, fonctionne en mode haut débit sur 96 puits, avec une gamme linéaire de quantification couvrant des niveaux faibles à modérés d'oxydation lipidique dans les microglies.
CO2 incubateurThermo Scientific3111CO₂ humidifié à enceinte thermostatée par double enveloppe d'eau2 incubateur avec un volume intérieur de 184 L, CO₂ à infrarouge2 capteur, système de filtration de l'air HEPA pour minimiser la contamination microbienne. Maintient un environnement de culture stable à 37 °C, 5 % CO₂2 et une humidité saturée pour la culture prolongée de cellules adhérentes.
Kit d'essai du gène rapporteur luciférase doubleBeyotime BiotechnologyRG028Ce kit double luciférine permet la détection quantitative séquentielle de la luciférase de luciole et de la luciférase Renilla dans des lysats cellulaires. Le signal de la luciférase de luciole est d'abord mesuré à l'aide du substrat luciférine ; le réactif de détection subséquent de Renilla contient un inhibiteur puissant qui élimine >99,9 % de luminescence résiduelle de luciole, assurant une lecture de signal pur de Renilla avec le substrat coelentérazine. Le kit comprend un tampon de lyse cellulaire dédié pour la lyse de cellules adhérentes, compatible avec un luminomètre pour microplaque de 96 puits. Le réactif de luciole est un liquide pré-mélangé prêt à l'emploi ; les valeurs de luminescence de la luciole et de Renilla sont enregistrées séquentiellement afin de calculer l'activité luciférase relative normalisée (rapport luciole/Renilla) pour la validation de cibles ceRNA.
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11995065Le DMEM est un milieu de base largement utilisé pour soutenir la croissance de nombreuses cellules de mammifères. Cette formulation contient du glucose à concentration élevée, du L-glutamine, du rouge de phénol et du pyruvate de sodium. Il nécessite un supplément, généralement 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), et un taux de 5 % de CO₂–10 % CO2 environnement pour maintenir un pH physiologique.
Sérum fœtal bovinCHAQUE VERT13011-8611FCS de qualité supérieure, faible teneur en endotoxines, sans mycoplasmes & bactériophage négatif, supplémenté dans le DMEM à 10 % v/v pour favoriser la croissance cellulaire.
GraphPad Prism version 9GraphPad Software, San Diego, CA, États-UnisNALogiciel spécialisé en analyse statistique et en représentation graphique de données expérimentales cellulaires in vitro. Toutes les valeurs brutes de qPCR, de dosage ELISA, de stress oxydatif et de luminiscence absorbance du test luciférase double ont été importées dans Prism 9 afin de vérifier la normalité, effectuer des comparaisons paramétriques ou non paramétriques entre groupes, générer toutes les figures quantitatives et calculer les moyennes ± DT, valeurs exactes de P et IC à 95 %, et exporter des figures en haute résolution (300 ppp) conformes aux normes de publication des revues. Les fichiers sources originaux au format .prism de tous les graphiques sont déposés dans un référentiel public de données, comme requis.
IBM SPSS Statistics Version 26.0IBM Corporation, Armonk, NY, États-UnisNALogiciel statistique complet utilisé pour le tri des données de base des échantillons cliniques, le test de normalité (test de Shapiro-Wilk), le test t indépendant (non apparié), l'analyse de variance à un facteur (ANOVA) avec test de Tukey’correction pour comparaisons multiples, test non paramétrique de Mann-Whitney U, et calcul des valeurs exactes de P et des intervalles de confiance à 95 % pour tous les jeux de données quantitatifs humains et cellulaires. Toutes les données démographiques et de laboratoire des patients cliniques ont été traitées et analysées dans cette plateforme.
IL-1β Kit SimpleStep ELISAAbcamab255730Ce kit ELISA colorimétrique sandwich à un seul lavage utilise une technologie SimpleStep exclusive, permettant d'achever l'ensemble de la procédure de détection en 90 minutes. Il mesure de façon quantitative l'interleukine-1 de ratβ dans le surnageant de culture cellulaire, le sérum et les échantillons de plasma EDTA/citrate/héparine. La sensibilité de détection atteint 26,58 pg/mL, avec une gamme de quantification linéaire de 54,69–3500 pg/mL. Une microplaque pré-recouverte en bandelettes sécables de 8 puits est incluse. Les signaux d'absorbance sont détectés à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaque pour calculer l'IL-1β concentration
Kit ELISA SimpleStep pour l'IL-6Abcamab234570Un kit ELISA colorimétrique SimpleStep par sandwich optimisé pour la détection quantitative de l'interleukine-6 (IL-6) chez le rat dans des échantillons de surnageant de culture cellulaire, de sérum et de plasma citraté/EDTA/hépariné. Ce kit utilise une procédure en une seule étape d'incubation et un seul lavage, réduisant ainsi le temps total d'analyse à 90 minutes, avec une sensibilité de détection de 43 pg/mL et une gamme de quantification linéaire comprise entre 125 pg/mL et 8000 pg/mL. Un microplaque prérevêtue constituée de bandes détachables de 8 puits est incluse ; les valeurs d'absorbance sont lues à 450 nm à l'aide d'un spectrophotomètre pour microplaque afin de calculer la concentration finale en IL-6.
Plaque LightCycler Multiwell 96, blancheRoche LifeScience, Suisse4729692001Plaques de réaction blanches en polypropylène à 96 puits, demi-paroi, spécialement optimisées pour l'appareil de PCR en temps réel LightCycler 96. Les parois blanches des puits réduisent les interférences de fluorescence de fond et améliorent la réflexion du signal, ce qui augmente la sensibilité de détection des transcrits peu abondants. Un design à paroi mince uniforme assure une conductivité thermique constante dans tous les puits, compatible avec des volumes de réaction allant de 10 à 50 μL. Sans DNase/ RNase et sans pyrogènes pour les tests d'amplification de ADN complémentaire dérivé de ARN.
Réactif de transfection LipofectamineTM 3000Thermo Fisher ScientificL3000015Le réactif de transfection par nanoparticules lipidiques associé à l'amplificateur P3000 permet une transfection efficace d'ARNsi/plasmide dans les microglies BV2 avec une faible cytotoxicité.
Kit de synthèse de l'ADN complémentaire brin simple lnRcute lncARNTIANGENKR202-02Ce kit est spécialement optimisé pour la transcription inverse des ARN non codants longs (lncARN) peu abondants, présentant une teneur en GC variable et des structures secondaires complexes. Il contient un tampon de suppression de l'ADN génomique indépendant permettant d'éliminer la contamination par l'ADN génomique avant la transcription inverse, ainsi qu'un mélange d'amorces spécifiques lnR-RT destiné à enrichir les gabarits de lncARN en longueur complète. La transcriptase inverse modifiée permet une synthèse efficace d'ADN complémentaire longs brins à partir d'une quantité d'ARN total comprise entre 10 ng et 2 ng.
Kit de détection d'ARNl lnRcute (SYBR Green) pour PCRqTIANGENFP402Un mélange prêt à l'emploi pour PCR quantitative basé sur le SYBR Green, spécialement conçu pour la quantification des ARNl. La polymérase ADN à démarrage chaud médiée par anticorps assure une spécificité élevée d'amplification ; les composants H-compétiteur atténuent les interférences dues à la structure secondaire des matrices d'ARNl riches en GC. Compatible avec l'ADNc généré à partir du kit de transcription inverse lnRcute pour ARNl, et adapté à la quantification de l'expression relative des ARNl faiblement exprimés.
Oligonucléotides miR-145-5pGeneralbiol (Wuhan, Chine)NAMimique synthétique de miR-145-5p, inhibiteur et oligonucléotides négatifs correspondants utilisés pour moduler l'activité de miR-145-5p dans les cellules BV2. Utilisés dans les tests d'expression, inflammatoires, de stress oxydatif et de rapporteur luciférase double.
Kit miRcute Plus de l'ADNc de première chaîne d'ARNmiTIANGENKR211-02Adopte une réaction combinée en un seul tube de polyadénylation et de transcription inverse pour simplifier le protocole expérimental. Le mélange enzymatique contient une poly(A) polymérase d'E. coli, une transcriptase inverse dépourvue de RNase H et un inhibiteur de RNase, ciblant spécifiquement les miARN matures simples brins et évitant ainsi toute interférence amplificatrice provenant des pré-miARN possédant des structures en épingle à cheveux. Convient pour les miARN extraits de lysats cellulaires, de plasma et d'échantillons tissulaires.
Kit de détection miRcute Plus pour qPCR d'ARNm (SYBR Green)TIANGENFP411Pré-mélange SYBR Green optimisé pour la quantification des ARNmi matures, parfaitement compatible avec les produits de transcription inverse miRcute. Le système tampon améliore l'efficacité d'hybridation des amorces pour les courts amplicons d'ARNmi, offrant des signaux fluorescents stables et une haute sensibilité pour la détection des ARNmi faiblement exprimés. L'ARNsn U6 est couramment utilisé comme référence interne pour la normalisation.
Solution de pénicilline-streptomycine (100×)Beyotime BiotechnologyC0222Mélange filtré stérile contenant 10 000 U/mL de pénicilline et 10 mg/mL de streptomycine ; dilution d'emploi 1:100 dans le milieu de culture pour prévenir la contamination bactérienne.
Kit d'essai des espèces réactives de l'oxygène avec diluantBeyotime BiotechnologyS0034MCe kit utilise la sonde fluorescente DCFH-DA pour quantifier les espèces réactives de l'oxygène (ROS) intracellulaires. La DCFH-DA traverse la membrane cellulaire et est hydrolysée par les estérases intracellulaires en DCFH, qui est ensuite oxydée par les ROS pour produire la DCF fluorescente. Compatible avec les microplaques 96 puits et les lecteurs de microplaques à fluorescence pour une détection en haut débit (Ex = 488 nm, Em = 525 nm). Équipé d'un diluant spécifique pour la sonde et d'un réactif contrôle positif Rosup afin de stabiliser les signaux de marquage, il convient à la détection du stress oxydatif des microglies BV2 adhérentes sans lyse cellulaire.
Kit d'analyse du glutathion réduit (GSH)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA006-1-2Kit colorimétrique en microplaque pour la détection du glutathion réduit (GSH), l'antioxydant intracellulaire principal. Le GSH réagit avec l'acide dithiodinitrobenzoïque (DTNB) pour produire un composé chromogène jaune, dont l'absorbance est mesurée à 405 nm à l'aide d'un lecteur de microplaque. Ce kit adapte un protocole classique en tube à une détection en microplaque de 96 puits, permettant une analyse à haut débit des antioxydants dans des lysats cellulaires.
si-LINC00707GenePharma (Shanghai, Chine)NAARN interférent petit (siARN) conçu pour réduire l'expression de LINC00707 dans les cellules BV2. Utilisé dans des expériences de perte de fonction afin d'évaluer les effets de l'extinction de LINC00707 sur les réponses inflammatoires, le stress oxydatif, l'expression de miR-145-5p et l'expression de TRAF6.
si-LINC00707 NCGenePharma (Shanghai, Chine)NAARNi non ciblant utilisé comme contrôle négatif pour la transfection par si-LINC00707. Utilisé pour contrôler les effets non spécifiques liés à la procédure de transfection et à l'exposition aux ARN interférents.
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)TIANGEN4992777Prémélange universel de PCR quantitative en temps réel avec SYBR Green pour la quantification relative d'ARNm, contenant une ADN polymérase Taq à démarrage chaud, des dNTP, du SYBR Green I et un colorant de référence ROX pour la normalisation de la fluorescence. Amplification non spécifique faible, efficacité d'amplification stable, largement utilisé pour la quantification de gènes cibles d'ARNm (TRAF6, GAPDH, etc.).
Centrifugeuse de table petite taille Thermo Scientific™ Sorvall™ ST 8Thermo Scientific75200709Le choix classique pour les laboratoires cliniques, capable de traiter jusqu'à 24 × Des tubes de prélèvement sanguin de 5/7 mL à la fois. La série R est une version réfrigérée, qui permet une meilleure protection des échantillons nécessitant une centrifugation à basse température.
Kit de synthèse d'ADN complémentaire de premier brin TIANScript IITIANGENGKR107-02Conçu pour la transcription inverse d'ARNm en vue de la synthèse d'ADNc de grande taille, jusqu'à 12 kb. Équipé d'amorces Oligo (dT) 15 et d'amorces aléatoires hexamériques pour des stratégies d'amorçage flexibles. La transcriptase inverse M-MLV modifiée lit efficacement les régions riches en GC et les structures secondaires complexes des ARNm, avec une grande compatibilité pour l'amplification ultérieure par qPCR des ARNm.
TNF-α Kit SimpleStep ELISAAbcamab236712Un kit ELISA sandwich SimpleStep, rapide, à un seul lavage, optimisé pour la détection quantitative du facteur de nécrose tumorale du ratα (TNF-α) dans le surnageant de culture cellulaire, le sérum et divers échantillons de plasma. La durée totale du test est de 90 min, avec une sensibilité extrêmement élevée de 1,04 pg/mL et une gamme de détection linéaire comprise entre 15,63 pg/mL et 1000 pg/mL. Équipé d'un détachable 8×plaque pré-enrobée 12 puits ; les valeurs d'OD à 450 nm sont enregistrées pour le TNF finalα calcul quantitatif
Kit d'essai de la superoxyde dismutase totale (SOD-T)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-3-2Kit chromogénique pour microplaque WST-1 permettant la détection de l'activité enzymatique totale de la SOD. La SOD élimine les radicaux anion superoxyde et inhibe la réduction du WST-1. La mesure de l'absorbance à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques permet le calcul de l'activité. Convient pour les échantillons d'homogénat cellulaire, de sérum et de tissus, avec un développement colorimétrique stable et une haute répétabilité, destiné à l'évaluation de la capacité antioxydante.
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596018Réactif monophasique au phénol-guanidine isothiocyanate pour l'isolement en une étape de l'ARN total à partir de cellules de microglie en culture ; extrait simultanément l'ADN et les protéines à partir des mêmes échantillons.

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