Cette étude optimise le test d'amplification isotermique par boucle (LAMP) en utilisant du charbon actif et de la bentonite pour détecter des espèces pathogènes de Vibrio dans les produits de la mer. Ce traitement préalable élimine efficacement les inhibiteurs de réaction, offrant des diagnostics nettement plus rapides, plus sensibles et plus rentables par rapport aux méthodes conventionnelles.
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Article de recherche
Augmentation de la sensibilité de l'amplification en boucle à l'aide de charbon actif et de bentonite pour la détection de Vibrio spp. dans les produits de la pêche
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le Vibrio le genre compte plus de 100 espèces, dont 12 sont considérées comme pathogènes pour l'homme ; les espèces les plus fréquemment isolées dans les aliments sont V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, et V. alginolyticus. Le principal problème lié à leur identification par des méthodes microbiologiques conventionnelles réside dans les coûts élevés et le temps long du diagnostic. L'amplification isotermique par boucle (LAMP) a été utilisée pour l'identification de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, et V. alginolyticus. Du charbon actif avec de la bentonite (ACB) a été utilisé pour éliminer les inhibiteurs, améliorant ainsi la sensibilité du test ; les pH 6, 7 et 9 ont été testés, ainsi que différentes durées de contact entre l'échantillon et l'ACB. La méthode LAMP a vu sa sensibilité améliorée lorsque le charbon actif et la bentonite ont été utilisés pour éliminer les inhibiteurs de réaction dans des échantillons de crevettes, de poissons et d'huîtres. La sensibilité de la méthode LAMP, la valeur prédictive négative, la valeur prédictive positive et la spécificité de la méthode LAMP étaient égales ou supérieures à 90 % pour tous les échantillons testés. La méthode LAMP pourrait constituer une alternative pour identifier V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, et V. alginolyticus dans les produits de la pêche en raison d'une application plus rapide, d'une sensibilité plus élevée et de coûts inférieurs par rapport à la méthode standard.
Introduction
Espèces du Vibrio le genre est largement réparti dans les environnements marins et peut être associé aux poissons, mollusques ou crustacés de manière pathogène ou commensale. Il a été rapporté que 12 espèces peuvent être pathogènes pour l'homme, avec Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, et V. alginolyticus révélant une fréquence plus élevée d'isolement dans les produits de la pêche. Aux États-Unis, les autorités sanitaires estiment que Vibrio spp. provoquent plus de 80 000 infections par an1,2,3,4,5L'isolement des Vibrio spp. est réalisé par des méthodes classiques impliquant une pré-enrichissement, une culture sur milieux sélectifs et une confirmation par des tests biochimiques et sérologiques.6,7. Ces méthodes classiques sont limitées par le temps prolongé nécessaire à l'isolement de l'agent pathogène (jusqu'à 5 jours) et par leur faible pouvoir de résolution, qui échoue souvent à différencier avec précision des espèces étroitement apparentées au sein du Vibrio genre en raison de profils phénotypiques et biochimiques similaires6,7,8.
Alternativement, l'amplification isotermique en boucle (LAMP) a été décrite comme une technique moléculaire rapide, précise et peu coûteuse pour l'identification des agents pathogènes9,10. Cette méthode est nettement plus économique et plus rapide que la PCR classique, car elle ne nécessite pas d'équipement sophistiqué tel que des thermocycleurs9. La méthode LAMP permet, en une seule étape, la détection du gène cible en observant la turbidité dans le tube de réaction, provoquée par la précipitation du pyrophosphate de magnésium, qui constitue un produit réactionnel stable à 65 °C, température utilisée dans la technique LAMP, de sorte que l'augmentation de la turbidité correle à la quantité d'ADN synthétisée, évitant ainsi le recours aux gels d'agarose et aux transilluminateurs11,12,13,14,15.
La détection de la sensibilité à ces agents pathogènes peut être améliorée par l'élimination des inhibiteurs de réaction, tels que les protéases, les ions calcium, le glycogène et les lipides, qui peuvent inhiber la polymérase Bst ou se lier à la cible d'ADN, empêchant ainsi l'amplification13,16,17,18,19,20. Il a été rapporté que la combinaison de charbon activé avec de la bentonite (ACB) présente une efficacité élevée pour éliminer les inhibiteurs d'amplification, augmentant par conséquent la sensibilité de la détection d'Escherichia coli dans des échantillons d'huîtres, tout en réduisant les coûts, car l'ACB est moins coûteux que l'utilisation de kits commerciaux21.
Dans ce travail, nous proposons d'optimiser la méthode LAMP en utilisant du charbon actif et de la bentonite afin d'augmenter la sensibilité pour l'identification de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus et V. alginolyticus directement à partir de produits de la pêche. Cette méthode optimisée fournit des orientations pratiques pour la surveillance de routine et le contrôle qualité dans l'industrie alimentaire, étant particulièrement adaptée au diagnostic rapide de pathogènes, tout en évitant les étapes longues de pré-enrichissement. En ce qui concerne ses performances attendues, la méthode démontre une excellente sensibilité (supérieure à 98 %) et une spécificité de 100 % dans des matrices telles que le poisson et la crevette. Toutefois, une limitation importante à prendre en compte est que, dans des échantillons fortement contaminés à l'origine, comme les huîtres, le système ACB ne parvient pas à éliminer complètement toutes les matières organiques interférentes, ce qui peut légèrement réduire la sensibilité du test (94 % à 98 %).
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Protocole
Cette étude n'a pas impliqué de sujets humains ou d'animaux vertébrés ; par conséquent, une approbation éthique institutionnelle n'était pas requise. Les réactifs et l'équipement utilisés sont listés dans le Tableau des matériaux.
1. Souches bactériennes utilisées et extraction de l'ADN
Les souches Vibrio cholerae non O1 CECT 55, V. parahaemolyticus ATCC 17802, V. vulnificus ATCC 29037 et V. alginolyticus ATCC 17749 ont été cultivées dans un bouillon d'infusion cerveau-cœur (BHI) contenant 2 % de NaCl à 37 °C pendant 24 heures. Les souches Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 et Salmonella Typhimurium ATCC 14028 ont été cultivées dans du bouillon BHI sans chlorure de sodium à 37 °C pendant 24 heures afin d'être utilisées comme témoins négatifs dans les tests. Pour l'extraction de l'ADN, une culture de 24 heures a été centrifugée à 16 000 x g pendant 6 minutes à 25 °C dans une centrifugeuse. Le surnageant a été soigneusement décanté afin de ne pas perturber le culot cellulaire, puis le culot a été bien resuspendu par pipetage dans 500 μL de solution tampon TAE (Tris-acide acétique-EDTA, pH 8). La suspension a été portée à ébullition pendant 6 minutes afin de lyser les cellules, puis immédiatement refroidie sur de la glace pendant 5 minutes. Une dernière centrifugation a été effectuée pour récupérer les débris cellulaires sous forme de culot, produisant un surnageant limpide contenant l'ADN extrait, qui a ensuite été utilisé comme matrice pour l'amplification par LAMP22,23.
2. Procédure LAMP
Les amorces utilisées dans le LAMP (Tableau 1) ont été testés afin de confirmer la spécificité de l'identification de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, et V. alginolyticus. L'identification de chacun Vibrio espèce utilisant la LAMP a été réalisée dans des tubes à réaction en préparant un volume final de 25 μL du mélange contenant : 1.6 μM de chacun des amorces, 1,4 mM d'un mélange de dNTP, 6 mM de MgSO4, 800 mM de bétaïne, 8 U de Bst polymérase ADN, et 5 μL d'ADN matrice. Le mélange réactionnel a été doucement homogénéisé et incubé dans un bain-marie à 65 °C pendant 60 min. Après le temps d'incubation, les produits d'amplification ont été séparés sur un gel d'agarose à 1,5 %. Les produits d'amplification ont ensuite été colorés en utilisant 1 μL d'un colorant fluorescent de l'ADN dilué au 1/100 et révélé à l'aide d'un transilluminateur à lumière bleue. Une autre technique permettant de déterminer si le test était positif lors de l'identification de l'agent pathogène consistait à ajouter 4 μL de bleu d'hydroxynaphtol (HNB, 125 μM) dans les tubes à réaction et en observant le changement de couleur à l'œil nu. Un test positif était indiqué par l'apparition d'une couleur bleue, et un test négatif par une couleur violette.24. Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594, et Salmonella Typhimurium ATCC 14028 ont été utilisés comme témoins négatifs pour la méthode LAMP. Les amplifications obtenues en LAMP ont été séparées sur gel d'agarose et observées à l'aide d'un transilluminateur. Les images résultantes ont été acquises et numérisées à l'aide du logiciel MS 1D Analysis Software.
3. Traitement des échantillons d'huîtres, de crevettes et de poissons en vue de l'élimination des Vibrio spp. naturellement présents dans les échantillons
Dix échantillons d'huîtres, dix échantillons de crevettes et dix échantillons de poisson, pesant environ 200 g chacun, ont été obtenus. Pour éliminer les cellules de Vibrio naturellement présentes, la méthodologie publiée précédemment21 a été suivie. Cinquante grammes (50 g) de chaque échantillon ont été pesés et homogénéisés mécaniquement dans un mélangeur à palette à 260 tr/min pendant 1 minute, produisant une suspension tissulaire homogène, puis stockée à -70 °C pendant 72 heures. Par la suite, les échantillons ont été complètement décongelés à l’aide d’un bain-marie à 40 °C, puis lavés avec 300 mL de solution tampon saline phosphate (0,85 % NaCl, pH 9). Afin de s’assurer que la procédure précédente avait correctement éliminé les Vibrio des échantillons, la méthodologie de pré-enrichissement indiquée au chapitre 9 du Bacteriological Analytical Manual de la Food and Drug Administration7 a été réalisée. La solution saline contenant l’échantillon a été remplacée par 450 mL d’eau peptonée alcaline (APW, pH 9). Des dilutions sériées ont ensuite été soigneusement préparées dans l’APW jusqu’à une dilution de 10⁻3 et incubées pendant 24 heures. Enfin, un aliquot de chaque tube a été ensemencé en surface sur un milieu sélectif d’agar thiosulfate-citrate-bile-sucrose (TCBS) et incubé pendant 24 heures à 37 °C afin de confirmer visuellement l’absence de colonies typiques de Vibrio. Tous les tests ont été effectués en triplicata.
4. Préparation du charbon actif avec de la bentonite (ACB) et évaluation de la récupération cellulaire
Afin de déterminer les conditions dans lesquelles le charbon actif-bentonite (ACB) absorbe de manière optimale les inhibiteurs présents dans les échantillons de produits de la pêche tout en maintenant une absorption minimale des cellules cibles, la méthodologie publiée21 a été suivie pour établir le pH optimal et le temps de contact entre l'ACB et les échantillons alimentaires. Le charbon actif a été soigneusement lavé à l’eau distillée puis séché à 55 °C. Ensuite, 32,6 g de charbon actif ont été mélangés avec 3,04 g de bentonite, agités en continu à 150 tr/min pendant 24 h afin d’assurer une distribution homogène, séchés à 55 °C et stérilisés, produisant ainsi une poudre fine et homogène d’ACB. Pour évaluer la récupération cellulaire après mélange des cellules de Vibrio avec le mélange de charbon actif-bentonite (ACB), les souches ont été cultivées séparément dans un bouillon BHI contenant 2 % de NaCl jusqu’à l’obtention d’une densité cellulaire de 1,5 × 104 UFC/mL. Ensuite, 1 mL de chaque souche de Vibrio a été inoculé séparément dans 100 mL de tampon phosphate (PBS, 0,85 % de NaCl), ajusté à pH 4, 6 et 9. La suspension bactérienne a ensuite été mélangée avec 4,6 g d’ACB préparé au préalable et agitée à 150 tr/min pendant 15, 30 et 60 min afin de favoriser le contact. Après chaque temps de contact défini, un aliquot de 0,1 mL a été prélevé soigneusement, étalé sur gélose TCBS, puis incubé à 37 °C pendant 24 h avant le dénombrement des colonies.
5. Évaluation de la limite de détection de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus et V. alginolyticus dans des échantillons d'huîtres, de crevettes et de poisson traités au charbon actif et à la bentonite
Chacune des espèces de Vibrio utilisées dans cette étude a été cultivée dans un bouillon BHI, et leurs densités cellulaires ont été précisément ajustées à 1,5 x 104, 7,5 x 103, 3,8 x 103, 1,5 x 103, 7,5 x 102, 3 x 102, 1,5 x 102 et 76 UFC/mL (A600 nm ~0,25), mesurées à l’aide d’un spectrophotomètre. Ensuite, 1 mL de chaque culture de Vibrio a été utilisé pour inoculer 50 g de chaque échantillon (huîtres, poissons, crevettes) préalablement traités pour éliminer toute présence de Vibrio. Les échantillons inoculés ont été homogénéisés dans un mélangeur à palette à 360 tr/min pendant 30 s, puis dilués avec 450 mL de APW (pH 6). Le mélange a ensuite été centrifugé à 260 x g pendant 5 min à 4 °C afin de séparer les gros débris. Le surnageant obtenu a été versé dans des flacons contenant 23 g de ACB, agité à 150 tr/min pendant 15 min pour absorber les inhibiteurs, puis filtré à l’aide de papier filtre, produisant un éluat clair dépourvu de particules grossières. Cet éluat a ensuite été centrifugé à 16 000 x g pendant 10 min à 4 °C, ce qui a permis d’obtenir un culot cellulaire visible au fond du tube, utilisé par la suite pour l’extraction de l’ADN. Chaque espèce de Vibrio a été identifiée par la méthode LAMP. Les témoins négatifs étaient constitués d’échantillons inoculés avec des souches d’Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 et Salmonella Typhimurium ATCC 14028. Le mélange réactionnel a été incubé dans un bain-marie à 65 °C pendant 60 min. Après le temps d’incubation, les produits d’amplification ont été séparés sur un gel d’agarose à 1,5 % et colorés avec un colorant fluorescent pour l’ADN. Les gels ont été visualisés sur un transilluminateur à lumière bleue. Enfin, 4 μL d’hydroxynaphtol bleu (125 μM) ont été ajoutés à chaque tube pour une détection à l’œil nu24.
6. Détermination de la valeur prédictive positive, de la valeur prédictive négative, de la spécificité et de la sensibilité de la méthode LAMP
La sensibilité, la spécificité et les valeurs prédictives de la méthode LAMP ont été déterminées à l’aide de 30 échantillons (10 d’écrevisses, 10 d’huîtres et 10 de poissons). Chaque échantillon a été inoculé avec la concentration minimale détectable établie pour chaque espèce de Vibrio. Pour déterminer le pourcentage de sensibilité et de spécificité ainsi que la valeur prédictive négative (VPN) et la valeur prédictive positive25, un tableau de contingence a été utilisé afin de résumer les vrais positifs (VP), les vrais négatifs (VN), les faux positifs (FP) et les faux négatifs (FN) obtenus au cours des expériences. (Tableau 2). À partir de ces données, les formules suivantes ont été appliquées :
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Résultats
Souches bactériennes utilisées et l'extraction de l'ADN
L'ADN a été extrait avec succès à partir de toutes les souches pathogènes et des souches témoins négatives afin d'être utilisé comme matrice pour les tests LAMP en aval.
Procédure LAMP
Les amorces utilisées dans ce travail étaient spécifiques de l'amplification de la cible moléculaire de chaque espèce de Vibrio. Les produits d'amplification obtenus par LAMP lorsqu'on utilisait des souches...
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Discussion
Cette étude établit des conditions optimisées pour améliorer la sensibilité de l'amplification isotermique par boucle (LAMP) afin de détecter V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus et V. vulnificus dans des échantillons de produits de la mer contaminés. En contournant l'étape traditionnelle de pré-enrichissement, le temps de diagnostic est considérablement réduit, offrant une approche hautement efficace et rapide pour identifier directement les agents pathogènes présents da...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt concurrent.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Carbone actif | Sigma-Aldrich | C2764 | |
| Bentonite | Sigma-Aldrich | 682659 | |
| Bétaïne | Sigma-Aldrich | B0300 | |
| Transilluminateur Bio-Image systems | Bio-Image systems | MBE-CP-01 | |
| Polymérase Bst de l'ADN | New England Biolabs | M0374 | |
| Centrifugeuse (modèle J2-HS) | Beckman Coulter | https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri | |
| Cronobacter sakazakii | ATCC | 12868 | |
| Mélange de dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0241 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Bleu d'hydroxynaphtol | Sigma-Aldrich | 219916 | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 49594 | |
| Midori Green Advanced | Nippon Genetics | MG01 | |
| Logiciel d'analyse MS 1D | Major Science | MBE-IMG-SW | |
| Salmonella Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| Spectrophotomètre (modèle 6300) | Jenway | 630531 | |
| Stomacher Circulator (modèle 400) | Seward | 0400/000/AJ | |
| Vibrio alginolyticus | ATCC | 17749 | |
| Vibrio cholerae non O1 | CECT | 55 | |
| Vibrio parahaemolyticus | ATCC | 17802 | |
| Vibrio vulnificus | ATCC | 29037 | |
| Papier Whatman | Whatman | 1001-055 |
Références
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