Cette étude optimise le test d'amplification isotermique par boucle (LAMP) en utilisant du charbon actif et de la bentonite pour détecter des espèces pathogènes de Vibrio dans les produits de la mer. Ce traitement préalable élimine efficacement les inhibiteurs de réaction, offrant des diagnostics nettement plus rapides, plus sensibles et plus rentables par rapport aux méthodes conventionnelles.
Article de recherche
Augmentation de la sensibilité de l'amplification en boucle à l'aide de charbon actif et de bentonite pour la détection de Vibrio spp. dans les produits de la pêche
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le Vibrio le genre compte plus de 100 espèces, dont 12 sont considérées comme pathogènes pour l'homme ; les espèces les plus fréquemment isolées dans les aliments sont V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, et V. alginolyticus. Le principal problème lié à leur identification par des méthodes microbiologiques conventionnelles réside dans les coûts élevés et le temps long du diagnostic. L'amplification isotermique par boucle (LAMP) a été utilisée pour l'identification de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, et V. alginolyticus. Du charbon actif avec de la bentonite (ACB) a été utilisé pour éliminer les inhibiteurs, améliorant ainsi la sensibilité du test ; les pH 6, 7 et 9 ont été testés, ainsi que différentes durées de contact entre l'échantillon et l'ACB. La méthode LAMP a vu sa sensibilité améliorée lorsque le charbon actif et la bentonite ont été utilisés pour éliminer les inhibiteurs de réaction dans des échantillons de crevettes, de poissons et d'huîtres. La sensibilité de la méthode LAMP, la valeur prédictive négative, la valeur prédictive positive et la spécificité de la méthode LAMP étaient égales ou supérieures à 90 % pour tous les échantillons testés. La méthode LAMP pourrait constituer une alternative pour identifier V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, et V. alginolyticus dans les produits de la pêche en raison d'une application plus rapide, d'une sensibilité plus élevée et de coûts inférieurs par rapport à la méthode standard.
Introduction
Espèces du Vibrio le genre est largement réparti dans les environnements marins et peut être associé aux poissons, mollusques ou crustacés de manière pathogène ou commensale. Il a été rapporté que 12 espèces peuvent être pathogènes pour l'homme, avec Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, et V. alginolyticus révélant une fréquence plus élevée d'isolement dans les produits de la pêche. Aux États-Unis, les autorités sanitaires estiment que Vibrio spp. provoquent plus de 80 000 infections par an1,2,3,4,5L'isolement des Vibrio spp. est réalisé par des méthodes classiques impliquant une pré-enrichissement, une culture sur milieux sélectifs et une confirmation par des tests biochimiques et sérologiques.6,7. Ces méthodes classiques sont limitées par le temps prolongé nécessaire à l'isolement de l'agent pathogène (jusqu'à 5 jours) et par leur faible pouvoir de résolution, qui échoue souvent à différencier avec précision des espèces étroitement apparentées au sein du Vibrio genre en raison de profils phénotypiques et biochimiques similaires6,7,8.
Alternativement, l'amplification isotermique en boucle (LAMP) a été décrite comme une technique moléculaire rapide, précise et peu coûteuse pour l'identification des agents pathogènes9,10. Cette méthode est nettement plus économique et plus rapide que la PCR classique, car elle ne nécessite pas d'équipement sophistiqué tel que des thermocycleurs9. La méthode LAMP permet, en une seule étape, la détection du gène cible en observant la turbidité dans le tube de réaction, provoquée par la précipitation du pyrophosphate de magnésium, qui constitue un produit réactionnel stable à 65 °C, température utilisée dans la technique LAMP, de sorte que l'augmentation de la turbidité correle à la quantité d'ADN synthétisée, évitant ainsi le recours aux gels d'agarose et aux transilluminateurs11,12,13,14,15.
La détection de la sensibilité à ces agents pathogènes peut être améliorée par l'élimination des inhibiteurs de réaction, tels que les protéases, les ions calcium, le glycogène et les lipides, qui peuvent inhiber la polymérase Bst ou se lier à la cible d'ADN, empêchant ainsi l'amplification13,16,17,18,19,20. Il a été rapporté que la combinaison de charbon activé avec de la bentonite (ACB) présente une efficacité élevée pour éliminer les inhibiteurs d'amplification, augmentant par conséquent la sensibilité de la détection d'Escherichia coli dans des échantillons d'huîtres, tout en réduisant les coûts, car l'ACB est moins coûteux que l'utilisation de kits commerciaux21.
Dans ce travail, nous proposons d'optimiser la méthode LAMP en utilisant du charbon actif et de la bentonite afin d'augmenter la sensibilité pour l'identification de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus et V. alginolyticus directement à partir de produits de la pêche. Cette méthode optimisée fournit des orientations pratiques pour la surveillance de routine et le contrôle qualité dans l'industrie alimentaire, étant particulièrement adaptée au diagnostic rapide de pathogènes, tout en évitant les étapes longues de pré-enrichissement. En ce qui concerne ses performances attendues, la méthode démontre une excellente sensibilité (supérieure à 98 %) et une spécificité de 100 % dans des matrices telles que le poisson et la crevette. Toutefois, une limitation importante à prendre en compte est que, dans des échantillons fortement contaminés à l'origine, comme les huîtres, le système ACB ne parvient pas à éliminer complètement toutes les matières organiques interférentes, ce qui peut légèrement réduire la sensibilité du test (94 % à 98 %).
Protocole
Cette étude n'a pas impliqué de sujets humains ou d'animaux vertébrés ; par conséquent, une approbation éthique institutionnelle n'était pas requise. Les réactifs et l'équipement utilisés sont listés dans le Tableau des matériaux.
1. Souches bactériennes utilisées et extraction de l'ADN
Les souches Vibrio cholerae non O1 CECT 55, V. parahaemolyticus ATCC 17802, V. vulnificus ATCC 29037 et V. alginolyticus ATCC 17749 ont été cultivées dans un bouillon d'infusion cerveau-cœur (BHI) contenant 2 % de NaCl à 37 °C pendant 24 heures. Les souches Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 et Salmonella Typhimurium ATCC 14028 ont été cultivées dans du bouillon BHI sans chlorure de sodium à 37 °C pendant 24 heures afin d'être utilisées comme témoins négatifs dans les tests. Pour l'extraction de l'ADN, une culture de 24 heures a été centrifugée à 16 000 x g pendant 6 minutes à 25 °C dans une centrifugeuse. Le surnageant a été soigneusement décanté afin de ne pas perturber le culot cellulaire, puis le culot a été bien resuspendu par pipetage dans 500 μL de solution tampon TAE (Tris-acide acétique-EDTA, pH 8). La suspension a été portée à ébullition pendant 6 minutes afin de lyser les cellules, puis immédiatement refroidie sur de la glace pendant 5 minutes. Une dernière centrifugation a été effectuée pour récupérer les débris cellulaires sous forme de culot, produisant un surnageant limpide contenant l'ADN extrait, qui a ensuite été utilisé comme matrice pour l'amplification par LAMP22,23.
2. Procédure LAMP
Les amorces utilisées dans le LAMP (Tableau 1) ont été testés afin de confirmer la spécificité de l'identification de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, et V. alginolyticus. L'identification de chacun Vibrio espèce utilisant la LAMP a été réalisée dans des tubes à réaction en préparant un volume final de 25 μL du mélange contenant : 1.6 μM de chacun des amorces, 1,4 mM d'un mélange de dNTP, 6 mM de MgSO4, 800 mM de bétaïne, 8 U de Bst polymérase ADN, et 5 μL d'ADN matrice. Le mélange réactionnel a été doucement homogénéisé et incubé dans un bain-marie à 65 °C pendant 60 min. Après le temps d'incubation, les produits d'amplification ont été séparés sur un gel d'agarose à 1,5 %. Les produits d'amplification ont ensuite été colorés en utilisant 1 μL d'un colorant fluorescent de l'ADN dilué au 1/100 et révélé à l'aide d'un transilluminateur à lumière bleue. Une autre technique permettant de déterminer si le test était positif lors de l'identification de l'agent pathogène consistait à ajouter 4 μL de bleu d'hydroxynaphtol (HNB, 125 μM) dans les tubes à réaction et en observant le changement de couleur à l'œil nu. Un test positif était indiqué par l'apparition d'une couleur bleue, et un test négatif par une couleur violette.24. Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594, et Salmonella Typhimurium ATCC 14028 ont été utilisés comme témoins négatifs pour la méthode LAMP. Les amplifications obtenues en LAMP ont été séparées sur gel d'agarose et observées à l'aide d'un transilluminateur. Les images résultantes ont été acquises et numérisées à l'aide du logiciel MS 1D Analysis Software.
3. Traitement des échantillons d'huîtres, de crevettes et de poissons en vue de l'élimination des Vibrio spp. naturellement présents dans les échantillons
Dix échantillons d'huîtres, dix échantillons de crevettes et dix échantillons de poisson, pesant environ 200 g chacun, ont été obtenus. Pour éliminer les cellules de Vibrio naturellement présentes, la méthodologie publiée précédemment21 a été suivie. Cinquante grammes (50 g) de chaque échantillon ont été pesés et homogénéisés mécaniquement dans un mélangeur à palette à 260 tr/min pendant 1 minute, produisant une suspension tissulaire homogène, puis stockée à -70 °C pendant 72 heures. Par la suite, les échantillons ont été complètement décongelés à l’aide d’un bain-marie à 40 °C, puis lavés avec 300 mL de solution tampon saline phosphate (0,85 % NaCl, pH 9). Afin de s’assurer que la procédure précédente avait correctement éliminé les Vibrio des échantillons, la méthodologie de pré-enrichissement indiquée au chapitre 9 du Bacteriological Analytical Manual de la Food and Drug Administration7 a été réalisée. La solution saline contenant l’échantillon a été remplacée par 450 mL d’eau peptonée alcaline (APW, pH 9). Des dilutions sériées ont ensuite été soigneusement préparées dans l’APW jusqu’à une dilution de 10⁻3 et incubées pendant 24 heures. Enfin, un aliquot de chaque tube a été ensemencé en surface sur un milieu sélectif d’agar thiosulfate-citrate-bile-sucrose (TCBS) et incubé pendant 24 heures à 37 °C afin de confirmer visuellement l’absence de colonies typiques de Vibrio. Tous les tests ont été effectués en triplicata.
4. Préparation du charbon actif avec de la bentonite (ACB) et évaluation de la récupération cellulaire
Afin de déterminer les conditions dans lesquelles le charbon actif-bentonite (ACB) absorbe de manière optimale les inhibiteurs présents dans les échantillons de produits de la pêche tout en maintenant une absorption minimale des cellules cibles, la méthodologie publiée21 a été suivie pour établir le pH optimal et le temps de contact entre l'ACB et les échantillons alimentaires. Le charbon actif a été soigneusement lavé à l’eau distillée puis séché à 55 °C. Ensuite, 32,6 g de charbon actif ont été mélangés avec 3,04 g de bentonite, agités en continu à 150 tr/min pendant 24 h afin d’assurer une distribution homogène, séchés à 55 °C et stérilisés, produisant ainsi une poudre fine et homogène d’ACB. Pour évaluer la récupération cellulaire après mélange des cellules de Vibrio avec le mélange de charbon actif-bentonite (ACB), les souches ont été cultivées séparément dans un bouillon BHI contenant 2 % de NaCl jusqu’à l’obtention d’une densité cellulaire de 1,5 × 104 UFC/mL. Ensuite, 1 mL de chaque souche de Vibrio a été inoculé séparément dans 100 mL de tampon phosphate (PBS, 0,85 % de NaCl), ajusté à pH 4, 6 et 9. La suspension bactérienne a ensuite été mélangée avec 4,6 g d’ACB préparé au préalable et agitée à 150 tr/min pendant 15, 30 et 60 min afin de favoriser le contact. Après chaque temps de contact défini, un aliquot de 0,1 mL a été prélevé soigneusement, étalé sur gélose TCBS, puis incubé à 37 °C pendant 24 h avant le dénombrement des colonies.
5. Évaluation de la limite de détection de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus et V. alginolyticus dans des échantillons d'huîtres, de crevettes et de poisson traités au charbon actif et à la bentonite
Chacune des espèces de Vibrio utilisées dans cette étude a été cultivée dans un bouillon BHI, et leurs densités cellulaires ont été précisément ajustées à 1,5 x 104, 7,5 x 103, 3,8 x 103, 1,5 x 103, 7,5 x 102, 3 x 102, 1,5 x 102 et 76 UFC/mL (A600 nm ~0,25), mesurées à l’aide d’un spectrophotomètre. Ensuite, 1 mL de chaque culture de Vibrio a été utilisé pour inoculer 50 g de chaque échantillon (huîtres, poissons, crevettes) préalablement traités pour éliminer toute présence de Vibrio. Les échantillons inoculés ont été homogénéisés dans un mélangeur à palette à 360 tr/min pendant 30 s, puis dilués avec 450 mL de APW (pH 6). Le mélange a ensuite été centrifugé à 260 x g pendant 5 min à 4 °C afin de séparer les gros débris. Le surnageant obtenu a été versé dans des flacons contenant 23 g de ACB, agité à 150 tr/min pendant 15 min pour absorber les inhibiteurs, puis filtré à l’aide de papier filtre, produisant un éluat clair dépourvu de particules grossières. Cet éluat a ensuite été centrifugé à 16 000 x g pendant 10 min à 4 °C, ce qui a permis d’obtenir un culot cellulaire visible au fond du tube, utilisé par la suite pour l’extraction de l’ADN. Chaque espèce de Vibrio a été identifiée par la méthode LAMP. Les témoins négatifs étaient constitués d’échantillons inoculés avec des souches d’Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 et Salmonella Typhimurium ATCC 14028. Le mélange réactionnel a été incubé dans un bain-marie à 65 °C pendant 60 min. Après le temps d’incubation, les produits d’amplification ont été séparés sur un gel d’agarose à 1,5 % et colorés avec un colorant fluorescent pour l’ADN. Les gels ont été visualisés sur un transilluminateur à lumière bleue. Enfin, 4 μL d’hydroxynaphtol bleu (125 μM) ont été ajoutés à chaque tube pour une détection à l’œil nu24.
6. Détermination de la valeur prédictive positive, de la valeur prédictive négative, de la spécificité et de la sensibilité de la méthode LAMP
La sensibilité, la spécificité et les valeurs prédictives de la méthode LAMP ont été déterminées à l’aide de 30 échantillons (10 d’écrevisses, 10 d’huîtres et 10 de poissons). Chaque échantillon a été inoculé avec la concentration minimale détectable établie pour chaque espèce de Vibrio. Pour déterminer le pourcentage de sensibilité et de spécificité ainsi que la valeur prédictive négative (VPN) et la valeur prédictive positive25, un tableau de contingence a été utilisé afin de résumer les vrais positifs (VP), les vrais négatifs (VN), les faux positifs (FP) et les faux négatifs (FN) obtenus au cours des expériences. (Tableau 2). À partir de ces données, les formules suivantes ont été appliquées :
Résultats
Souches bactériennes utilisées et l'extraction de l'ADN
L'ADN a été extrait avec succès à partir de toutes les souches pathogènes et des souches témoins négatives afin d'être utilisé comme matrice pour les tests LAMP en aval.
Procédure LAMP
Les amorces utilisées dans ce travail étaient spécifiques de l'amplification de la cible moléculaire de chaque espèce de Vibrio. Les produits d'amplification obtenus par LAMP lorsqu'on utilisait des souches de Vibrio ont démontré que chaque amorce était spécifique de l'amplification du gène cible de chaque espèce de Vibrio (Figure 1).
Traitement d'échantillons d'huîtres, de crevettes et de poissons en vue de l'élimination des Vibrio spp. naturellement présents dans les échantillons
Le traitement visant à éliminer les Vibrio spp. naturellement présents sur les échantillons s'est révélé adéquat, permettant une réduction complète de 100 % des Vibrio spp. Aucune croissance de Vibrio spp. n'a été observée lorsque la méthode BAM a été suivie7.
Préparation du charbon actif avec de la bentonite (ACB) et évaluation de la récupération cellulaire
L'élimination des inhibiteurs de réaction à l'aide du charbon actif-bentonite a permis d'augmenter la sensibilité de détection de l'agent pathogène par la méthode LAMP. Ceci est dû à la capacité du charbon actif-bentonite à absorber les substances inhibitrices pouvant affecter la polymérase lors de la procédure d'amplification, en plus de la faible rétention des cellules bactériennes (Figure 2). Le pourcentage de récupération de Vibrio selon différents pH et durées de contact a montré une meilleure récupération cellulaire (93,4 % ± 2,9 %) lorsque le pH était de 6 avec une durée de contact de 15 minutes. Lorsque le pH 4 a été utilisé, aucune croissance de Vibrio n'a été observée, tandis qu'aux pH 7 et 9, les taux étaient respectivement de 33,4 % ± 7,6 % et de 67,2 % ± 5,8 %. Ce travail suggère l'utilisation d'un pH de 6 pour améliorer la sensibilité de détection de la méthode.
Évaluation de la limite de détection de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus et V. alginolyticus dans des échantillons d'huîtres, de crevettes et de poisson traités au charbon actif et à la bentonite
Dans les échantillons d'huîtres, la limite de détection pour V. cholerae était de 150 UFU/g, pour V. alginolyticus, V. vulnificus et V. parahaemolyticus de 3 × 102 UFU/g ; dans les échantillons de crevettes et de poisson, V. cholerae a été détecté à une concentration minimale de 150 UFU/g, tandis que pour V. alginolyticus, V. vulnificus et V. parahaemolyticus elle était de 76 UFU/g. Les résultats obtenus par la méthode LAMP ont révélé que l'utilisation d'hydroxy naphtol bleu améliore la sensibilité du test LAMP en éliminant les inhibiteurs de la réaction dans les échantillons non traités au ACB (Figure 3). Nous avons observé que la sensibilité du test LAMP était plus élevée lorsque les échantillons étaient traités au ACB.
Détermination de la valeur prédictive positive, de la valeur prédictive négative, de la spécificité et de la sensibilité de la méthode LAMP
La performance diagnostique de la méthode optimisée d'amplification isotermique par amorce en boucle (LAMP), avec et sans prétraitement par charbon actif-bentonite (ACB), a été évaluée systématiquement sur 150 essais afin d'apprécier sa robustesse (Tableau 3). L'élimination des inhibiteurs naturels présents dans les aliments à l'aide du système ACB a significativement amélioré tous les paramètres diagnostiques (sensibilité, spécificité, valeur prédictive positive (VPP) et valeur prédictive négative (VPN)), atteignant des valeurs égales ou supérieures à 90 % pour toutes les matrices, par rapport aux échantillons non traités.
Dans les échantillons de poisson et de crevette traités au ACB, le test a démontré des performances diagnostiques maximales, atteignant une sensibilité, une spécificité, une valeur prédictive positive (VPP) et une valeur prédictive négative (VPN) de 100 % (Figure 4). En revanche, dans les échantillons non traités de poisson et de crevette, la présence d'inhibiteurs d'origine matricielle a fortement compromis le test, réduisant la sensibilité de détection à 62,5 % et 52,5 %, respectivement. Pour la matrice fortement complexe de l'huître, le traitement au ACB a efficacement atténué les interférences majeures, offrant une sensibilité globale élevée de 95,0 % et une VPN de 71,4 % (Figure 5). En revanche, les échantillons d'huîtres non traités ont présenté une chute critique de la sensibilité de détection à 32,5 % et une VPN de 15,6 %, en raison de la forte présence de composés organiques tels que le glycogène et les lipides qui inhibent la polymérase.
La spécificité diagnostique de la méthode LAMP est restée à 100 % au cours des 150 essais, quel que soit le type de matrice ou le prétraitement, sans aucun résultat faussement positif enregistré. Cette spécificité absolue est attribuée à la conception hautement sélective des jeux d'amorces ciblant des gènes spécifiques aux espèces (gyrB pour V. alginolyticus, ompW pour V. cholerae, tlh pour V. parahaemolyticus et vvhA pour V. vulnificus). Ces résultats statistiques démontrent que la méthode ACB-LAMP optimisée constitue un outil hautement fiable et robuste pour la détection rapide, sans culture, d'espèces pathogènes de Vibrio dans divers produits de la pêche.
Enfin, nous considérons que l'utilisation de la méthode LAMP en combinaison avec un traitement préalable permettant d'éliminer les inhibiteurs de réaction peut augmenter la sensibilité de détection des agents pathogènes dans les aliments par la méthode LAMP. Par conséquent, cette technique appliquée à la recherche de V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, et V. vulnificus devrait être utile dans la surveillance visant à prévenir les infections causées par ces microorganismes.
DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :
Toutes les données brutes soutenant les résultats de cette étude, y compris les comptages numériques des colonies bactériennes récupérées (UFC/g) selon différentes valeurs de pH et durées de contact, ainsi que les résultats complets des performances diagnostiques pour les 150 essais de validation, sont accessibles publiquement dans le dépôt Zenodo à l'adresse suivante : https://doi.org/10.5281/zenodo.21799272. Le jeu de données associé contient le fichier complet du tableur (Fichier Supplémentaire 1).
Figure 1 : Analyse de la spécificité des produits amplifiés par LAMP sur un gel d'agarose à 1,5 %. Piste M, marqueur de taille moléculaire de 100 pb ; Piste 1, témoin négatif (Escherichia coli ATCC 25922) ; Piste 2, témoin négatif (Listeria monocytogenes ATCC 49594) ; Piste 3, V. alginolyticus ATCC 17749 ; Piste 4, V. cholerae non O1 CECT 557 ; Piste 5, V. parahaemolyticus ATCC 7802 ; Piste 6, V. vulnificus ATCC 29037. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Pourcentage de récupération des souches de Vibrio utilisant différentes conditions de pH et durées de contact avec le mélange de charbon actif et de bentonite (ACB). La récupération cellulaire (%) a été déterminée après inoculation des souches de Vibrio à 1,5 × 104 UFC/mL dans du PBS ajusté à pH 4,0, 6,0, 7,0 et 9,0, puis traitement avec 4,6 g d'ACB pendant 15 min, 30 min et 60 min. Le point de données à pH 6,0 et 15 min de contact montre une récupération cellulaire optimale (93,4 % ± 2,9 %), indiquant qu'une courte durée de contact suffit à récupérer les cellules cibles tout en maintenant une forte efficacité de retrait des inhibiteurs. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Limite de détection des produits amplifiés par LAMP dans des échantillons de fruits de mer artificiellement contaminés. Résultats d'amplification dans des échantillons de (A) huîtres, (B) crevettes et (C) poissons contaminés avec des dilutions sérielles d'espèces de Vibrio et prétraités avec ACB. Tubes : (1) Témoin négatif ; (2) V. alginolyticus ; (3) V. parahaemolyticus ; (4) V. vulnificus ; (5) V. cholerae non O1 ; et (6) V. mimicus (utilisé comme témoin cible). Panneau supérieur : détection colorimétrique visuelle à l’aide de 4 µL de bleu d’hydroxynaphtol (HNB, 125 µM) observée à l’œil nu, les réactions positives apparaissant en bleu et les réactions négatives restant violets. Panneau inférieur : détection par fluorescence à l’aide du colorant Midori Green Advanced (MGA), visualisée sous un transilluminateur à lumière bleue. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Paramètres comparatifs de performance diagnostique de la méthode LAMP avec et sans élimination des inhibiteurs. Comparaison de la sensibilité globale, de la spécificité, de la valeur prédictive positive (VPP) et de la valeur prédictive négative (VPN) sur des échantillons de poisson, crevettes et huîtres contaminés aux limites minimales détectables (n = 10 essais par combinaison espèce/matrice, pour un total de 150 essais). Les barres comparent les échantillons prétraités avec le mélange optimisé de charbon actif et de bentonite (ACB) à des témoins non traités (pas d’élimination des inhibiteurs). Les niveaux de contamination ont été fixés à 150 UFC/g pour V. cholerae dans toutes les matrices ; 300 UFC/g pour V. parahaemolyticus, V. alginolyticus et V. vulnificus dans l’huître ; et 76 UFC/g dans le poisson et la crevette. Le prétraitement avec l’ACB a permis de rétablir tous les paramètres diagnostiques à ≥90 % dans l’ensemble des matrices. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Sensibilité et spécificité ciblées de la méthode ACB-LAMP optimisée dans différentes matrices de produits de la mer. Performance diagnostique individuelle de V. alginolyticus, V. cholerae, V. parahaemolyticus et V. vulnificus dans des échantillons de poisson, de crevette et d'huître (n = 10 tests par combinaison cible/aliment) prétraités avec ACB. La spécificité a atteint 100 % pour toutes les cibles en raison de la conception d'amorces spécifiques aux espèces ciblant les gènes gyrB, ompW, tlh et vvhA. La sensibilité a atteint 100 % dans les matrices de poisson et de crevette, avec une légère diminution à 90 % observée dans les huîtres en raison de la forte complexité initiale de la matrice organique, qui interfère avec la réaction. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Amorces utilisées dans les tests d'amplification isotherme en boucle (LAMP). Description des amorces internes sens et antisens (FIP, BIP), des amorces externes (F3, B3) et des amorces en boucle (LF, LB) conçues pour cibler de manière spécifique les espèces V. alginolyticus (gyrB), V. parahaemolyticus (tlh), V. vulnificus (vvhA) et V. cholerae (ompW). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Tableau de contingence pour évaluer les paramètres de performance diagnostique de la méthode LAMP. Configuration matricielle standard 2x2 utilisée pour classer et résumer les vrais positifs (VP), les vrais négatifs (VN), les faux positifs (FP) et les faux négatifs (FN), afin de calculer la sensibilité, la spécificité, la valeur prédictive positive (VPP) et la valeur prédictive négative (VPN) dans les échantillons de produits de la mer enrichis et non enrichis. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Fichier supplémentaire 1 : Jeux de données bruts soutenant les résultats de cette étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Cette étude établit des conditions optimisées pour améliorer la sensibilité de l'amplification isotermique par boucle (LAMP) afin de détecter V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus et V. vulnificus dans des échantillons de produits de la mer contaminés. En contournant l'étape traditionnelle de pré-enrichissement, le temps de diagnostic est considérablement réduit, offrant une approche hautement efficace et rapide pour identifier directement les agents pathogènes présents dans les produits de la pêche.
Une amélioration méthodologique essentielle dans cette étude est l'optimisation de l'étape de retrait de l'inhibiteur. Les méthodologies antérieures utilisaient un pH de 4 avant l'amplification.21; toutefois, cela a entraîné une récupération nulle de souches de Vibrio, principalement en raison de Vibrio les espèces sont très sensibles aux environnements acides26. Pour remédier à cela, les conditions ont été modifiées systématiquement afin d'améliorer simultanément la récupération cellulaire et d'éliminer les inhibiteurs naturellement présents dans la réaction. La suspension du charbon actif avec de la bentonite (ACB) dans une solution tampon à pH 6, suivie d'une agitation de 15 minutes avec l'échantillon, s'est révélée être la condition optimale. Cette modification maximise la répulsion électrostatique entre les bactéries et l'ACB en se rapprochant du point isoélectrique de la membrane bactérienne.21,27,28, réduisant ainsi la perte de cellules cibles. Par conséquent, cette amélioration méthodologique a permis une sensibilité de détection 2 à 50 fois supérieure à celle des échantillons traités sans traitement par ACB.
Contrairement à ces améliorations méthodologiques, la mise en œuvre réussie de ce protocole peut nécessiter un dépannage explicite en cas de problèmes courants. Un problème fréquent rencontré lors de la mise en œuvre est l'élimination incomplète de la matière organique, ce qui peut interférer avec la polymérase et réduire la sensibilité du test LAMP, en particulier dans des matrices fortement contaminées. En cas d'échec de l'amplification ou de baisse de sensibilité, le dépannage doit d'abord consister à vérifier le pH du mélange échantillon-ACB ; des écarts par rapport à un pH de 6 peuvent entraîner la mort cellulaire (si trop acide) ou une absorption insuffisante des inhibiteurs. De plus, si des faux négatifs apparaissent malgré un traitement correct par l'ACB, les chercheurs doivent s'assurer que le temps de contact ne dépasse pas 15 minutes, car une exposition prolongée peut conduire à une rétention involontaire des cellules cibles par la matrice. Pour la détection à l'œil nu, des changements de couleur ambigus peuvent être corrigés en veillant à l'élimination complète des ions calcium de la matrice, qui pourraient autrement interférer avec la précipitation du pyrophosphate de magnésium dans le test LAMP.
Ce travail rapporte, pour la première fois, l'identification de Vibrio spp. dans des échantillons de poisson en utilisant la méthode LAMP combinée à un traitement préalable par ACB. Cette recherche fait progresser le domaine scientifique en établissant une méthode d'identification rapide, fiable et rentable pour les produits de la pêche13,19,23,29. Bien que la PCR classique constitue une approche alternative pour tester cette hypothèse, la spécificité robuste et les valeurs prédictives obtenues ici démontrent que le test ACB-LAMP est une option supérieure. Un avantage méthodologique essentiel de cette technique réside dans son indépendance par rapport à des équipements sophistiqués et coûteux, tels que les thermocycleurs, les chambres d'électrophorèse et les transilluminateurs9,30. En outre, la détection visuelle des résultats via le bleu d'hydroxynaphtol simplifie considérablement l'interprétation des données.
Malgré la haute sensibilité et spécificité obtenues, une limitation notable de l'étude est observée dans les matrices présentant une contamination de base élevée, comme les échantillons d'huîtres. Dans ces cas, le système ACB ne parvient pas à éliminer complètement toutes les matières organiques interférentes, ce qui diminue légèrement la sensibilité du test par rapport aux échantillons de poisson ou de crevette. Enfin, les applications potentielles de cette méthode soulignent son utilité pour la surveillance de routine à haut débit dans l'industrie alimentaire afin de prévenir les infections liées aux Vibrio. Les recherches futures devraient privilégier l'automatisation de l'extraction de l'ADN et de l'élimination des inhibiteurs par le système ACB. L'automatisation de ces étapes méthodologiques clés constitue un avantage crucial qui réduira considérablement le temps de manipulation, minimisera les erreurs humaines et standardisera les paramètres de dépannage, facilitant ainsi l'application à grande échelle de cette technique dans les laboratoires industriels de contrôle qualité.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt concurrent.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Carbone actif | Sigma-Aldrich | C2764 | |
| Bentonite | Sigma-Aldrich | 682659 | |
| Bétaïne | Sigma-Aldrich | B0300 | |
| Transilluminateur Bio-Image systems | Bio-Image systems | MBE-CP-01 | |
| Polymérase Bst de l'ADN | New England Biolabs | M0374 | |
| Centrifugeuse (modèle J2-HS) | Beckman Coulter | https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri | |
| Cronobacter sakazakii | ATCC | 12868 | |
| Mélange de dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0241 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Bleu d'hydroxynaphtol | Sigma-Aldrich | 219916 | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 49594 | |
| Midori Green Advanced | Nippon Genetics | MG01 | |
| Logiciel d'analyse MS 1D | Major Science | MBE-IMG-SW | |
| Salmonella Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| Spectrophotomètre (modèle 6300) | Jenway | 630531 | |
| Stomacher Circulator (modèle 400) | Seward | 0400/000/AJ | |
| Vibrio alginolyticus | ATCC | 17749 | |
| Vibrio cholerae non O1 | CECT | 55 | |
| Vibrio parahaemolyticus | ATCC | 17802 | |
| Vibrio vulnificus | ATCC | 29037 | |
| Papier Whatman | Whatman | 1001-055 |
Références
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