Article de méthode

Une plateforme microfluidique pour étudier les rôles de la compression mécanique dans les interactions entre cellules tumorales et immunitaires au sein d'une matrice extracellulaire 3D

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DOI :

10.3791/72929

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28 août 2026

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1Department of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Department of Biological and Environmental Engineering, Cornell University, 3Translational Science and Therapeutics Division, Fred Hutchinson Cancer Center, 4Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole utilisant une plateforme microfluidique pour modéliser les interactions tumeur-immunité dans un environnement tridimensionnel (3D). Nos résultats ont révélé que les cellules Natural Killer (NK) conservaient leur activité anti-tumorale sous compression mécanique.

Résumé

Les forces mécaniques influencent fortement la capacité des cellules immunitaires à tuer les cellules tumorales dans le contexte de l'immunothérapie cellulaire. Pour détruire les cellules tumorales, les cellules immunitaires doivent exercer des forces sur la cellule cible et former une synapse immunitaire, par laquelle des molécules cytotoxiques — notamment la granzyme B — sont délivrées. Malgré leur importance, la manière dont les indices mécaniques peuvent être exploités pour renforcer la destruction médiée par le système immunitaire reste mal comprise. Ce manque de connaissances est en partie dû à l'absence d'outils capables d'appliquer un stress mécanique bien contrôlé aux cultures cellulaires dans un environnement physiologiquement réaliste. Ici, nous décrivons un dispositif de compression microfluidique permettant d'appliquer une compression statique ou dynamique à des sphéroïdes tumoraux intégrés dans une matrice extracellulaire (ECM), tout en permettant une imagerie en temps réel des interactions entre tumeur et système immunitaire par microscopie optique.

La plateforme microfluidique est composée de 12 compartiments (6 de contrôle et 6 fonctionnels). Chaque compartiment contient une chambre à cellules positionnée directement sous l'unité de contrôle de pression. Des sphéroïdes inclus dans une matrice extracellulaire sont placés dans la chambre à cellules. À l'aide de cette plateforme, nous avons étudié l'efficacité de destruction des cellules Natural Killer (NK) contre des sphéroïdes tumoraux du sein (MCF-7) soumis à une compression mécanique définie. Les résultats ont montré que les cellules NK restaient les principaux facteurs de mort des sphéroïdes tumoraux, indépendamment de la compression mécanique dans un collagène à 1,5 mg/mL. Par conséquent, cela suggère que les cellules NK peuvent conserver leur activité anti-tumorale sous contrainte compressive. Ces résultats démontrent l'utilité de cette plateforme pour étudier le rôle des forces mécaniques dans les interactions tumeur-immunité. Des études en cours visent à identifier les mécanismes moléculaires permettant aux cellules immunitaires de s'adapter à la contrainte compressive. Les connaissances acquises grâce à ces études pourraient révéler une voie thérapeutique prometteuse.

Introduction

L'immunothérapie anticancéreuse basée sur les cellules est une approche thérapeutique qui utilise des cellules immunitaires pour cibler les cellules cancéreuses1. Cette stratégie a démontré un succès remarquable dans le traitement des cancers sanguins2,3,4. Toutefois, le niveau de succès observé dans les cancers sanguins n'a pas encore été pleinement transposé au traitement des tumeurs solides5,6,7. L'une des principales raisons de cette limitation est le microenvironnement tumoral immunosuppresseur (TME), spécifique aux tumeurs solides.

Le microenvironnement tumoral (TME) est caractérisé par des signaux mécaniques spécifiques capables de réguler le comportement cellulaire. La destruction efficace des cellules tumorales par les cellules immunitaires nécessite qu'elles exercent des forces sur les cellules cibles et établissent une synapse immunitaire par laquelle des molécules cytotoxiques sont délivrées8. Par conséquent, comprendre comment les forces mécaniques influencent la fonction des cellules immunitaires pourrait révéler de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant d'améliorer l'efficacité des immunothérapies cellulaires contre les tumeurs solides.

Une caractéristique mécanique fondamentale du microenvironnement tumoral (TME) solide est la contrainte de compression que ce microenvironnement impose à la tumeur en croissance9,10. Jusqu'à présent, la plupart des études sur la compression se sont concentrées sur ses effets sur le comportement des cellules tumorales10,11. Ce n'est que récemment que l'attention s'est tournée vers la compréhension de la manière dont la compression influence les cellules immunitaires présentes dans le TME12. En conséquence, les mécanismes par lesquels la contrainte de compression affecte la migration des cellules Natural Killer (NK), la formation de la synapse immunitaire et l'activité cytotoxique restent mal compris et insuffisamment quantifiés. Ce manque de connaissances constitue une limitation critique dans notre compréhension de la façon dont les signaux mécaniques présents dans le TME peuvent être exploités pour améliorer le ciblage immunitaire des tumeurs solides.

Un obstacle majeur à la résolution de cette question est l'absence de plates-formes expérimentales capables d'appliquer une compression contrôlée et quantifiable dans des microenvironnements tridimensionnels physiologiquement pertinents, tout en permettant une imagerie en temps réel des interactions tumeur-immunité. Les premières approches expérimentales pour étudier les contraintes de compression consistaient à incorporer des sphéroïdes dans des gels d'agarose13. Bien que cette méthode ait efficacement reproduit le confinement physique, elle supprimait les interactions natives entre la matrice extracellulaire (ECM) et les cellules. Dolega et al. ont appliqué une pression osmotique pour induire un stress compressif ; toutefois, les sphéroïdes étaient en suspension dans le milieu de culture et restaient donc dépourvus d'interactions avec la matrice extracellulaire9. Pandey et al. ont utilisé un insert de transwell et des poids pour comprimer des sphéroïdes incorporés dans du collagène, ce qui préservait les interactions matrice-cellule, mais limitait l'imagerie haute résolution nécessaire pour quantifier la motilité des cellules immunitaires et leur activité cytotoxique14. Prises ensemble, ces limitations soulignent le besoin de plates-formes expérimentales permettant l'imagerie en temps réel des réponses morphologiques des cellules à la compression au sein du microenvironnement tumoral (TME).

Ici, nous présentons un protocole pour un dispositif de compression microfluidique15 qui permet d'appliquer de manière contrôlée une contrainte de compression tout en préservant les interactions physiologiquement pertinentes entre la matrice extracellulaire et les cellules, et en permettant une imagerie en temps réel à haute résolution des dynamiques entre cellules immunitaires et tumeur. Le protocole comprend la préparation des composants du dispositif (section 1), l'assemblage du dispositif (section 2) et l'imagerie des interactions entre tumeur et système immunitaire (section 3). Nous illustrons le déroulement du protocole à l’aide d’un test de lyse par cellules Natural Killer (NK) dirigé contre des sphéroïdes tumoraux marqués par la protéine verte fluorescente (GFP). Au-delà de cette application, la plateforme peut être facilement adaptée pour étudier les effets des forces mécaniques sur un large éventail de types cellulaires et d’interactions cellulaires dans des microenvironnements tridimensionnels.

Protocole

1. Préparation des composants du dispositif

  1. Activation de la surface de la chambre de chargement de l'échantillon
    1. Placer un masque sur la chambre de chargement de l'échantillon (couche 1, L1) de sorte que seuls les puits soient exposés.
    2. Exposer la couche 1 masquée au plasma d'oxygène pendant 15 s en utilisant le réglage de haute puissance (45 W).
    3. Placer la couche 1 dans une boîte de Pétri, puis poursuivre les étapes suivantes dans une cabine de sécurité biologique.
    4. Traiter chaque puits avec 10 µL de 1 % de polyéthylèneimine (PEI) pendant 10 min.
    5. Retirer le PEI des puits par aspiration sous vide à partir des quatre coins de chaque puits afin d'éviter de rayer la surface en verre.
    6. Laver les puits avec 10 µL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis éliminer le lavage par aspiration sous vide sur le côté.
    7. Traiter les puits avec 10 µL de glutaraldéhyde à 0,1 % pendant 30 min, puis éliminer le glutaraldéhyde par aspiration sous vide en partant des coins.
    8. Laver les puits avec du PBS trois fois, en éliminant la solution de lavage des coins après chaque lavage.
    9. Envelopper la boîte de Pétri contenant la couche 1 dans du papier d'aluminium et la laisser toute la nuit dans l'enceinte de sécurité biologique.
  2. Stérilisation du cadre métallique
    1. Immerger le 38 mm × Cadre métallique de 88 mm et les douze vis à tête cylindrique M2,5 dans de l'éthanol à 70 % pendant toute la nuit.
  3. Amorçage de l'unité de contrôle de pression
    1. Exposer l'unité de contrôle de pression au plasma d'oxygène pendant 30 s en utilisant le réglage de haute puissance (45 W).
    2. Plonger l'unité de contrôle de pression, avec les caractéristiques orientées vers le bas, dans de l'eau déionisée (DI) pendant toute une nuit afin de remplir les canaux et les chambres de l'unité de contrôle de pression.
    3. Le lendemain, retirer l'unité de contrôle de pression de l'eau distillée dans laquelle elle était immergée.
    4. Remplir un réservoir microfluidique avec 50 mL d'eau désionisée.
      REMARQUE : Le réservoir microfluidique est constitué d'un tube conique de 50 mL équipé d'un bouchon personnalisé comportant deux raccords pour tubulures : une ligne de tubulure pneumatique et une ligne de tubulure pour l'acheminement du fluide.
    5. Connecter une seringue remplie d'air à la ligne de tubulure pneumatique.
    6. Appuyez lentement sur le piston de la seringue pour pressuriser le réservoir et faire circuler de l'eau désionisée à travers le tube d'acheminement du fluide jusqu'à ce que le tube soit rempli et que l'eau commence à goutter du tube.
    7. Connecter le tube de distribution de fluide pré-rempli et gouttant à travers le collecteur en polycarbonate, puis à l'orifice d'entrée de 1,5 mm situé à l'arrière de l'unité de contrôle de pression.
    8. Laisser sécher à l'air l'unité de contrôle de pression et l'ensemble du collecteur pendant 2 h. Une fois complètement secs, l'unité de contrôle de pression et l'ensemble du collecteur sont prêts pour l'étape suivante.

2. Assemblage du dispositif

  1. Préparation de collagène avec cellules incluses
    1. Retirer et sécher le cadre métallique et les vis de l'éthanol à 70 %.
    2. Dans la cabine de sécurité biologique, placer trois 600 µL microtubes sur de la glace. Étiqueter les tubes comme suit : "N" (neutralisation) "sp" (Microagrégats MCF-7), et "sp+NK" (Sphéroïdes MCF-7 avec cellules NK)
    3. Préparer le mélange de neutralisation en ajoutant 10× le volume requis de milieu 199 (M199) et d'hydroxyde de sodium (NaOH) au "N" tube
    4. Transférer le volume approprié du mélange M199:NaOH vers le "sp" et "sp+NK" tubes pour obtenir un final 1× concentration
    5. Récolter les sphéroïdes tumoraux et centrifuger à 141 × g pendant 3 min afin de permettre aux sphéroïdes de se déposer au fond du tube.
      REMARQUE : Les sphéroïdes tumoraux d'environ 200 µm de diamètre ont été générés à l'aide d'une plateforme de micropuits en agarose décrite précédemment16. Brièvement, 3 × 106 Les cellules MCF-7 ont été semées dans une 36 × 36 micropuits en agarose disposés en réseau composé de puits 200 µm de diamètre et 200 µm en profondeur, puis cultivées pendant 7 jours afin de produire les sphéroïdes tumoraux utilisés dans les expériences.
    6. Retirer soigneusement le surnageant et resuspendre les sphéroïdes dans 200 µL de milieu complet MCF-7/NK 50:50 (Tableau 1 et Tableau 2).
    7. Recueillir les cellules NK dans un tube conique de 50 mL, centrifuger à 141 × g pendant 4 min, puis compter les cellules.
      REMARQUE : La viabilité des cellules NK doit être >85 % le jour de l'expérience.
    8. Resuspendre le culot obtenu dans 200 µL de milieu NK complet.
    9. Ajouter le volume approprié de solution mère de collagène dans chaque tube de microcentrifugation.
    10. Ajouter le volume approprié de suspension cellulaire à chaque tube afin d'obtenir un volume final de 200 µL contenant 1,5 mg/mL de collagène.
      REMARQUE : Le "sp" la suspension contient uniquement des sphéroïdes tumoraux, tandis que le "sp+NK" la suspension contient des sphéroïdes tumoraux et 1,5 × 106 Cellules NK.
    11. Mélanger délicatement par pipetage afin d'assurer une répartition homogène des cellules et du collagène tout en minimisant la formation de bulles.
  2. Assemblage du dispositif et chargement des cellules
    1. Placer la couche 1 à l'intérieur du cadre métallique sec.
    2. Charger 9 µL du mélange de collagène dans chaque puits.
    3. Aligner l'unité de contrôle de pression et l'ensemble de collecteur avec les chambres cellulaires sur la couche 1 à l'aide d'un microscope.
    4. Insérez les vis sèches à travers le collecteur et dans le cadre métallique, en fixant ainsi l'unité de contrôle de pression et la couche 1 entre le collecteur et le cadre métallique.
    5. Placer le dispositif assemblé dans un 37 °C, 5 % CO₂₂ incuber pendant 45 min pour permettre la polymérisation du collagène.
    6. Ajouter 50:50 de milieu de culture cellulaire complet MCF-7/NK par les quatre orifices d'entrée du milieu.

3. Imagerie des interactions tumeur-immunité

  1. Placer le dispositif assemblé à l'intérieur de l'incubateur de plateau monté sur un microscope épifluorescent inversé pour l'imagerie de cellules vivantes.
    NOTE : L'incubateur de plateau maintient une température de 37 °C et une humidité d'environ 50 % pendant toute la durée de l'imagerie.
  2. Placer une boîte d'enveloppe secondaire au-dessus du dispositif assemblé afin de maintenir l'environnement interne à 37 °C, 100 % d'humidité et 5 % de CO₂ pendant toute la période d'imagerie.
  3. Connecter le dispositif au contrôleur de pression à l'aide du tube pneumatique.
  4. Acquérir des images en champ clair et en GFP des sphéroïdes tumoraux avant d'appliquer une compression, afin d'évaluer la déformation des sphéroïdes après compression.
  5. Appliquer une pression constante de 120 mbar pendant toute la durée de l'imagerie.
    NOTE : Le logiciel du contrôleur de pression permet à l'utilisateur de définir le profil et l'intensité de la pression appliquée durant l'expérience. La figure supplémentaire 1 présente un schéma du système de contrôle de pression.
  6. Commencer l'imagerie en laps de temps en acquérant des images en champ clair et en GFP toutes les 10 minutes pendant 18 heures.
    NOTE : Les images ont été acquises au plan Z central de chaque sphéroïde tumoral à l'aide d'un objectif 20× sur un microscope épifluorescent inversé. Les images en champ clair et en fluorescence GFP ont été capturées avec des temps d'exposition respectifs de 200,1 ms et 298,9 ms.

Résultats

Pour les expériences suivantes, un dispositif microfluidique de compression15 a été utilisé afin de modéliser les interactions tumeur-immunité dans un microenvironnement tridimensionnel physiologiquement pertinent, tout en permettant d'appliquer des compressions statiques et dynamiques à des sphéroïdes tumoraux (Figure 1). Les composants du dispositif (Figure 1A1) ainsi que leur ordre d'assemblage (Figure 1A2) sont illustrés dans la Figure 1A. Le cadre métallique sert de base au dispositif, la couche de chambre à cellules (L1) étant positionnée à l'intérieur du cadre. L'unité de contrôle de pression, constituée des couches L2 et L3 liées par plasma, est placée au-dessus de L1, suivie du collecteur (Figure 1A2). Ensemble, L1 et l'unité de contrôle de pression forment le dispositif microfluidique fonctionnel, qui est serré entre le cadre métallique et le collecteur à l'aide de vis. Le collecteur comporte des orifices d'entrée pour les tubulures fluidiques permettant d'appliquer une pression au dispositif, ainsi que des réservoirs de milieu qui facilitent les expériences d'imagerie en temps réel sur cellules vivantes à long terme.

Composants du dispositif microfluidique et schéma ; compression de la chambre à cellules ; résultats de l'expérience avec des cellules GFP.
Figure 1 : Dispositif de compression microfluidique pour l'étude des interactions entre cellules immunitaires et sphéroïdes tumoraux sous compression mécanique. (A1) Photographie des composants nécessaires à l'assemblage du dispositif, présentés de gauche à droite : collecteur, unité de contrôle de pression (L2 + L3), couche de la chambre à cellules (L1) et cadre métallique. (A2) Schéma 3D des composants du dispositif, présentés du haut vers le bas : collecteur, unité de contrôle de pression (L2 + L3), couche de la chambre à cellules (L1) et cadre métallique. Les couches en PDMS L2 et L3 sont liées par plasma pour former l'unité de contrôle de pression, qui est placée au-dessus de la chambre à cellules. Le collecteur et le cadre métallique maintiennent le dispositif assemblé. (B1) Schéma en coupe transversale d'une unité de compression avant et après compression. Des sphéroïdes tumoraux inclus dans une matrice extracellulaire (ECM) et des cellules NK sont placés dans la chambre à cellules. La distance initiale entre le fond de L1 et le fond de L2 avant compression est notée h. Lorsqu'une pression est appliquée à l'unité de contrôle de pression, L2 fléchit vers le bas, provoquant la compression du sphéroïde tumoral par le piston en PDMS. Le déplacement vers le bas de L2 après compression est noté Δh. (B2) Images superposées en champ clair et en GFP d'un sphéroïde tumoral MCF-7 avec des cellules NK avant (à gauche) et après (à droite) compression. Les cellules MCF-7 sont marquées au GFP, tandis que les cellules NK ne sont pas marquées. Des cellules NK représentatives sont entourées en bleu, tandis que les contours jaunes indiquent les périphéries des sphéroïdes tumoraux. Échelle = 50 µm. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Une fois assemblé, le dispositif de compression microfluidique peut être utilisé pour comprimer des sphéroïdes tumoraux comme illustré dans la Figure 1B. Ici, les sphéroïdes tumoraux inclus dans le collagène et associés à des cellules NK sont introduits dans la chambre à cellules (L1). Lorsqu'une pression est appliquée à la chambre de pression (L3), la couche membraneuse déformable (L2) s'infléchit vers le bas, provoquant la transmission des forces de compression au sphéroïde par le piston en polydiméthylsiloxane (PDMS). La chambre de pression est contrôlée par une source de pression externe. Des détails supplémentaires concernant la conception, la fabrication et la caractérisation du dispositif de compression microfluidique ont déjà été publiés dans une autre étude15.

Nous définissons la distance entre le fond de la chambre à cellules (L1) et le fond de la membrane déformable (L2) comme étant h (Figure 1B1, panneau gauche). Avant la compression, cette distance est de 200 µm. Lors de l'application d'une pression fluide à l'unité de contrôle de pression, la membrane déformable fléchit vers le bas, réduisant la distance h de Δh (Δh ; Figure 1B1, panneau droit), comprimant ainsi le sphéroïde tumoral inclus dans le collagène. Dans ce système, la déformation en compression est définie comme Δh/h, où h correspond à la distance initiale entre L1 et L2 avant compression, et Δh représente le déplacement vers le bas de L2 après compression. Le déplacement de la membrane a été précédemment étalonné en visualisant des billes fluorescentes fixées au fond de L2. Une description détaillée de la procédure d'étalonnage et des calculs de déformation en compression est disponible dans une étude antérieure17. Un exemple de courbe d'étalonnage est présenté dans la Figure supplémentaire 2.

Figure 1B2 montre des images représentatives superposées en champ clair et en GFP d'un sphéroïde MCF-7 avec des cellules NK incluses dans du collagène à 1,5 mg/mL avant (panneau gauche) et après compression (panneau droit). Les limites du sphéroïde tumoral ont été délimitées en jaune. Après compression, le sphéroïde a présenté une augmentation de sa surface projetée, indiquant une déformation en réponse à l'application réussie d'une contrainte mécanique. Pour toutes les expériences présentées dans cet article, nous avons utilisé une déformation par compression de Δh/h = 50 %. Nous notons que le diamètre des sphéroïdes varie de 140 µm à 200 µmCela signifie que la déformation de compression réelle subie par le sphéroïde est légèrement inférieure à 50 %. Vidéo supplémentaire 1 et Vidéo supplémentaire 2 montrent des z-stacks représentatifs X-Y acquis dans le canal de fluorescence GFP d'un sphéroïde MCF-7 inclus dans du collagène à 1,5 mg/mL avant et après l'application d'une déformation compressive de 50 %, respectivement.

Le dispositif de compression microfluidique a été utilisé pour étudier les effets des cellules NK, de la compression et de leur combinaison sur la mort des sphéroïdes tumoraux (Figure 2). Cette approche est rendue possible grâce au design du dispositif, qui comprend 12 puits de culture. Parmi ces puits, six peuvent être soumis à une compression, tandis que les six restants servent de témoins non comprimés. Cette configuration permet quatre conditions expérimentales (Figure 2A) : sphéroïdes seuls sans compression (sp), sphéroïdes avec des cellules NK mais sans compression (+NK), sphéroïdes soumis à une compression (+comp), et sphéroïdes exposés à la fois à la compression et aux cellules NK (+comp+NK).

Microscopie en lapso de temps de l'intensité de la GFP ; graphique, nuage de points avec analyse normalisée des données de GFP.
Figure 2 : La compression mécanique module la destruction des sphéroïdes tumoraux par les cellules NK. (A) Images en fluorescence en lapso de temps de sphéroïdes MCF-7 inclus dans du collagène à 1,5 mg/mL dans quatre conditions : témoin sphéroïde seul (sp), sphéroïdes avec cellules NK (+NK), sphéroïdes avec compression (+comp) et sphéroïdes avec à la fois compression et cellules NK (+comp+NK). La fluorescence GFP marque les cellules tumorales MCF-7 viables. Le contour jaune indique la région d’intérêt (ROI), définie à partir de l’image à 18 h et appliquée à tous les points temporels pour la quantification de la fluorescence. L’intensité totale de fluorescence GFP à l’intérieur de la ROI a été mesurée et utilisée pour les analyses ultérieures. Échelle = 50 µm. (B) Intensité totale de fluorescence GFP d’un sphéroïde au cours du temps dans les quatre conditions. Chaque ligne de couleur représente l’intensité de fluorescence totale d’un sphéroïde unique, normalisée par rapport à son intensité initiale à t = 0. La ligne noire correspond à l’ajustement polynomial du second ordre des données d’intensité de fluorescence regroupées à partir de 7 sphéroïdes cultivés dans la condition témoin, utilisée comme référence pour le calcul de la perte de cellules tumorales en (C). (C) La perte normalisée de GFP pour les conditions +comp, +NK et +comp+NK a été calculée en soustrayant l’intensité de GFP à t = 18 h de chaque sphéroïde à la courbe de référence du témoin (sp). Ainsi, chaque point de données représente la perte normalisée de GFP d’un sphéroïde unique. Les barres d’erreur représentent l’erreur standard de la moyenne (SEM). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Les effets des cellules NK, de la compression et de leur combinaison sur les sphéroïdes tumoraux peuvent être visualisés sur les images représentatives des sphéroïdes MCF-7 dans du collagène à 1,5 mg/mL (Figure 2A). Étant donné que les cellules MCF-7 utilisées pour générer les sphéroïdes tumoraux étaient marquées par la GFP, la viabilité tumorale pouvait être suivie par les variations de la fluorescence GFP. Des images en GFP et en champ clair ont été acquises toutes les 10 minutes pendant 18 heures à l’aide d’un microscope épifluorescent inversé. Notamment, les sphéroïdes soumis à une compression présentaient une aire projetée plus grande que celle des sphéroïdes non comprimés, confirmant la transmission efficace de la charge mécanique depuis la membrane déformable jusqu’au sphéroïde tumoral. Au fil du temps, une perte progressive de la fluorescence GFP a été observée dans les conditions +NK et +comp+NK (Figure 2A), indiquant une destruction des cellules tumorales induite par les cellules NK.

Nous utilisons la perte de fluorescence GFP comme indicateur de la mort des cellules tumorales. Les cellules MCF-7 marquées par GFP utilisées dans cette étude ont été générées par transduction lentivirale. Brièvement, un vecteur lentiviral a permis d'introduire une cassette d'expression de la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) sous le contrôle du promoteur du facteur d'élongation-1α (EF1α), ainsi qu'un gène de résistance à la puromycine sous le contrôle du promoteur du virus du sarcome de Rous (RSV). Après infection, les cassettes d'expression lentivirales se sont intégrées dans l'ADN génomique des cellules MCF-7, entraînant une expression stable de GFP. Une sélection à la puromycine a ensuite été utilisée pour éliminer les cellules non transduites. Le marquage GFP des cellules MCF-7 a permis de quantifier la viabilité des cellules tumorales en surveillant l'évolution de l'intensité de fluorescence GFP au fil du temps (Figure 2B). Une forte corrélation entre la perte de fluorescence GFP et des marqueurs établis de mort cellulaire, notamment le marqueur viabilité/non viabilité iodure de propidium (PI) et le marqueur d'apoptose annexine-V, a déjà été démontrée18, validant ainsi la perte de fluorescence GFP comme mesure indirecte de la mort des cellules tumorales.

Afin de quantifier les effets des quatre conditions expérimentales sur la viabilité tumorale, l'intensité totale de fluorescence GFP de chaque sphéroïde tumoral a été mesurée à chaque point temporel, soustraite du fond et normalisée par rapport à sa valeur initiale (Figure 2B). La fluorescence totale du sphéroïde a été calculée au sein d'une région d'intérêt prédéfinie (ROI). Cette ROI a été obtenue en délimitant manuellement la bordure du sphéroïde tumoral sur l'image à 18 h (contour jaune sur le panneau 18 h, Fig. 2A) à l'aide d'un script MATLAB maison. L'intensité totale de fluorescence au sein de cette ROI a ensuite été calculée pour chaque point temporel et corrigée en soustrayant la fluorescence de fond moyenne mesurée à partir d'une ROI distincte sélectionnée ailleurs dans l'image. Les valeurs de fluorescence corrigées du fond ont ensuite été normalisées par rapport à l'intensité de fluorescence initiale du sphéroïde.

Chaque courbe colorée représente l'intensité normalisée de la GFP d'un sphéroïde individuel dans une condition expérimentale spécifique de la Figure 2B. La courbe est obtenue par un ajustement polynomial du second ordre aux données expérimentales. Les courbes violettes représentent les sphéroïdes soumis uniquement à une compression (+comp, Figure 2B), les courbes rouges représentent les sphéroïdes avec des cellules NK (+NK, Figure 2B), et les courbes bleues représentent les sphéroïdes exposés à la fois à une compression et à des cellules NK (+comp+NK, Figure 2B). En revanche, la courbe noire correspond à l'ajustement polynomial du second ordre réalisé à partir des données de sept sphéroïdes cultivés dans la condition témoin « sphéroïde seul » (sp, Figure 2B). Dans la Figure 2B, seules les données ajustées par le polynôme, et non les points de données expérimentaux, sont présentées pour plus de clarté. Notamment, l'intensité de fluorescence de la GFP dans les conditions « sphéroïde seul » (sp) et « sphéroïde + compression » (+comp) montre une tendance générale à la hausse au fil du temps (Figure 2B), ce qui est compatible avec une croissance tumorale continue ou le maintien de la viabilité. En revanche, les conditions +NK et +comp+NK montrent une diminution progressive de l'intensité de fluorescence de la GFP (Figure 2B), indiquant une mort des cellules tumorales.

La perte cumulative de cellules tumorales a été quantifiée en soustrayant l'intensité de fluorescence GFP normalisée ajustée de chaque sphéroïde dans une condition donnée (+comp, +NK ou +comp+NK) à celle de la condition témoin à 18 h (Figure 2C). Ainsi, chaque point de données représente la perte normalisée de GFP d'un sphéroïde individuel par rapport au témoin composé uniquement de sphéroïdes (Figure 2C). Par conséquent, la condition +comp reflète la perte de GFP due uniquement à la compression (violet, Figure 2C), la condition +NK reflète la perte de GFP due uniquement aux cellules NK (rouge, Figure 2C), et la condition +comp+NK reflète la perte de GFP résultant des effets combinés de la compression et des cellules NK (bleu, Figure 2C). La condition +comp a montré le degré le plus faible de perte de GFP (Figure 2C), suggérant que la compression seule a un effet minimal sur la viabilité des sphéroïdes. En revanche, les conditions +NK et +comp+NK ont montré une perte de GFP significativement plus importante que la condition +comp (Figure 2C), indiquant que les cellules NK sont les principaux facteurs responsables de la mort des cellules tumorales. Bien que la condition +comp+NK ait présenté une perte moyenne de GFP supérieure à celle de la condition +NK, cette différence n'a pas atteint un seuil de significativité statistique (Figure 2C). Ces résultats suggèrent que la compression n'altère pas la capacité des cellules NK à tuer les cellules tumorales. Dans leur ensemble, ces résultats démontrent que le dispositif microfluidique de compression peut être utilisé avec succès pour quantifier les effets indépendants et combinés de la compression et des cellules NK sur la viabilité des sphéroïdes tumoraux dans un environnement tridimensionnel physiologiquement pertinent.

En revanche, des résultats sous-optimaux peuvent survenir lorsque (1) les sphéroïdes se trouvent en dehors de la limite du piston, (2) les sphéroïdes sont positionnés trop près de la limite du piston, et (3) plusieurs sphéroïdes sont situés à une distance inférieure au diamètre d'un sphéroïde l'un de l'autre (Figure 3). Dans ces cas, les champs correspondants doivent être exclus de l'analyse.

Effet de compression cellulaire ; champ clair, fluorescence GFP ; avant et après ; résultats de la microscopie en lapse de temps de 18 h.
Figure 3 : Exemple représentatif d'une séquence d'images de sphéroïdes exclus de l'analyse. Des images en champ clair (BF), en fluorescence GFP et des images fusionnées de sphéroïdes MCF-7 avec des cellules NK dans du collagène à 1,5 mg/mL avant (colonne de gauche) et après compression (deux colonnes de droite) sont présentées. Les images pré-compression ont été acquises 20 min avant l'application de la pression et 10 min avant le début de l'acquisition en lapse de temps. Les images ont ensuite été collectées toutes les 10 min pendant 18 h, le temps 0 h correspondant à la première image prise immédiatement après la compression, et 18 h marquant la fin de l'expérience. La flèche bleue indique le bord du piston en PDMS (L2). Ce champ d'observation a été exclu de l'analyse car deux sphéroïdes étaient présents dans la zone de compression et se trouvaient trop proches de la limite du piston. En conséquence, la déformation des sphéroïdes et l'intensité de la fluorescence GFP n'ont pas pu être quantifiées de manière fiable pendant la compression. Échelle = 50 µm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

(1) Les sphéroïdes situés à l'extérieur de la limite du piston ne subissent aucune compression, car la pression n'est appliquée que dans la zone du piston. Ces sphéroïdes doivent donc être exclus des conditions comprimées comme des conditions témoins. (2) Les sphéroïdes positionnés sur ou près de la limite du pistonFigure 3, le sphéroïde supérieur) doivent être exclus, car le sphéroïde subit une charge mécanique non uniforme. (3) Les sphéroïdes situés à une distance inférieure au diamètre d'un sphéroïde par rapport à des sphéroïdes voisins doivent être exclus (Figure 3). La proximité entre les sphéroïdes complique la quantification de l'intensité de fluorescence de la GFP, car la région d'intérêt (ROI) est définie à partir du dernier point temporel. Avec le temps, les limites des sphéroïdes peuvent devenir indistinctes, rendant difficile la délimitation d'une ROI englobant précisément un seul sphéroïde. Ces problèmes peuvent être minimisés en veillant à ce que les sphéroïdes soient centrés dans la zone de compression lors du chargement du dispositif. Une attention particulière portée à la distribution et au positionnement des sphéroïdes ainsi qu'à la configuration du dispositif est essentielle pour assurer une compression uniforme et obtenir des résultats expérimentaux fiables et reproductibles.

ComposantsConcentration
milieu α-MEM
sérum de veau fœtal (FBS)10 %
penicilline/streptomycine1 %

Tableau 1 : Milieu complet pour MCF-7.

ComposantsConcentration
milieu α-MEM
Myo-inositol0.2 mM
2-mercaptoéthanol0.1 mM
Sérum de veau fœtal (FBS)12,50 %
Acide folique0,02 mM
Sérum de cheval (HS)12,50 %
Pénicilline/streptomycine1 %

Tableau 2 : Milieu complet pour cellules NK.

Figure supplémentaire 1 : Schéma du système de contrôle de pression. Un compresseur d'air fournit de l'air comprimé (jusqu'à 20 psi) au régulateur de pression. Le régulateur de pression ajuste la pression d'air envoyée au réservoir de pression en fonction des paramètres définis par l'utilisateur. Le régulateur a une pression de fonctionnement maximale de 200 mbar, une stabilité de pression de 0,005 % de la pleine échelle (FS), une résolution de pression de 0,003 % FS et un temps de réponse de 9 ms, permettant un contrôle de pression précis et reproductible. Le régulateur est connecté à un ordinateur via un bus série universel (USB), ce qui permet à l'utilisateur de programmer l'amplitude et le profil de la pression appliquée à l'aide du logiciel fourni. Le logiciel prend en charge plusieurs formes d'onde de compression, notamment une pression constante, sinusoïdale, triangulaire et périodique. Sur ce schéma, la pression est réglée à 120 mbar, et l'air comprimé à cette pression est acheminé vers le réservoir pressurisé par le tube pneumatique. Le réservoir pressurisé contient 50 mL d'eau déionisée (DI) et sert à convertir la pression pneumatique en pression hydraulique. Une fois sous pression, le réservoir pousse le fluide à travers un tube d'acheminement vers l'unité de contrôle de pression du dispositif microfluidique de compression (voir Figure 1 pour plus de détails sur le dispositif), où la pression hydraulique est utilisée pour comprimer le sphéroïde tumoral. Remarquez que la pression fluide est utilisée afin d'éviter la formation de bulles d'air dans le dispositif en PDMS. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Courbe d'étalonnage pour le dispositif de compression microfluidique montrant la relation entre le déplacement du piston (, µm) et la pression appliquée à la chambre de contrôle de pression (KPa). Les mesures expérimentales sont représentées par des points, tandis que la ligne continue correspond à la simulation COMSOL. Les barres d'erreur indiquent l'erreur type de la moyenne (ETM) provenant de huit mesures expérimentales indépendantes, mais sont trop petites pour être visibles. Cette figure est reproduite de Suh et al.15 avec la permission de la Royal Society of Chemistry. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 1 : Coupes en z en mode X-Y d'un sphéroïde MCF-7 marqué par la GFP avant compression. Le sphéroïde a été inclus dans du collagène à 1,5 mg/mL à l'intérieur du dispositif de compression microfluidique et observé à l'aide du canal de fluorescence GFP avec un pas en z de 1 µm. Ensuite, le logiciel ImageJ a été utilisé pour améliorer le contraste. Échelle = 50 µm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire 2 : Une déformation compressive de 50 % (Δh/h = 50 %) a ensuite été appliquée au sphéroïde MCF-7 marqué par la GFP, inclus dans du collagène à 1,5 mg/mL. Après compression, un empilement en X–Y en coupe Z a été acquis dans le canal de fluorescence GFP avec un pas de 1 µm, puis traité sous ImageJ afin d'améliorer le contraste. Échelle = 50 µm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Cette méthode décrit l'utilisation d'un dispositif microfluidique de compression pour étudier les effets du stress compressif sur les interactions tumeur-immunité. Ce système permet d'appliquer une compression mécanique contrôlée à des sphéroïdes tumoraux intégrés dans une matrice de collagène tridimensionnelle. Le substrat en verre qui constitue la base de la chambre à cellules (L1) permet une imagerie en temps réel à haute résolution, ce qui rend la plateforme particulièrement adaptée aux études visant à quantifier la motilité, l'infiltration et l'activité cytotoxique des cellules immunitaires. De manière importante, le système préserve les interactions cellule-cellule et cellule-matrice tout en offrant un contrôle précis de l'environnement mécanique. En revanche, de nombreuses approches expérimentales existantes pour étudier le stress compressif nécessitent un compromis entre les interactions cellulaires médiées par la matrice extracellulaire9,13 et l'imagerie à haute résolution14.

Dans la présente étude, les cellules NK et les sphéroïdes de tumeur mammaire MCF-7 ont été utilisés comme système modèle. Toutefois, le dispositif microfluidique de compression n'est pas limité à ces types cellulaires. À ce jour, la plateforme a été appliquée avec succès à plusieurs modèles cellulaires du sein, notamment les sphéroïdes de tumeur mammaire MDA-MB-231 et les sphéroïdes mammaires MCF-10A15,17. La plateforme peut être facilement adaptée pour étudier les interactions tumeur-immunité dans divers autres modèles de tumeurs, y compris les sphéroïdes de tumeurs cérébrales et pulmonaires. De même, la plateforme est compatible avec un large éventail de populations de cellules immunitaires autres que les cellules NK, permettant d'explorer diverses interactions tumeur-immunité sous compression mécanique. En outre, le dispositif n'est pas restreint aux études basées sur les sphéroïdes et peut être adapté pour des expériences sur cellules uniques. L'ensemble de ces caractéristiques fait de la plateforme un outil polyvalent pour examiner la manière dont les forces mécaniques régulent le comportement cellulaire dans un large éventail de contextes biologiques et pathologiques.

Un autre avantage de ce système réside dans le contrôle précis de l'ampleur et du motif de la compression appliquée aux échantillons. Dans la présente étude, une déformation compressive statique de 50 % a été appliquée pendant toute la durée de l'expérience. Toutefois, le niveau de déformation peut être facilement modifié selon l'objectif expérimental. En outre, une compression dynamique aux formes d'onde variées, notamment des ondes carrées et sinusoïdales, peut être appliquée aux sphéroïdes à l'aide du système de régulation de pression externe. La compression en onde carrée implique des intervalles alternés de compression et de relâchement17, tandis que la compression sinusoïdale implique des augmentations et diminutions progressives de la compression dans le temps15. Ces capacités, combinées à l'imagerie quantitative et à la modélisation prédictive, peuvent être utilisées pour étudier l'influence de la compression dynamique sur l'efficacité de la destruction immunitaire.

Nous notons que ce dispositif de compression a été initialement développé pour caractériser les propriétés mécaniques des tumeurs17. En intégrant un capteur de force in situ et une couche de gel de polyacrylamide (PAA) sous le sphéroïde tumoral, les propriétés mécaniques du sphéroïde, telles que la rigidité et la viscoélasticité, peuvent être caractérisées de manière quantitative15,17. Cette modification élargit l'utilité de la plateforme au-delà de la modélisation du stress compressif, en incluant la mesure directe du comportement mécanique de la tumeur.

Dans l'ensemble, le dispositif de compression microfluidique offre un large éventail d'applications, allant de la mesure des propriétés mécaniques des sphéroïdes à l'étude des interactions tumeur-immunité dans un environnement à modulation mécanique. Toutefois, plusieurs étapes critiques sont nécessaires pour un fonctionnement réussi du dispositif. Les sphéroïdes tumoraux doivent être positionnés près du centre de chaque puits afin d'assurer une compression uniforme. L'unité de contrôle de pression doit être correctement alignée avec la couche de chambre à cellules (L1) pour garantir une transmission précise de la pression. Des bulles d'air peuvent être introduites lorsque l'unité de contrôle de pression est placée au-dessus de L1, ce qui peut nuire à la qualité d'imagerie et aux résultats expérimentaux. Pour éviter ce problème, il convient de manipuler avec précaution afin de ne pas introduire de bulles lors du chargement du mélange de collagène, et d'ajouter 8 µL de mélange de collagène dans chaque puits afin de légèrement surremplir la chambre avant la mise en place de l'unité de contrôle de pression. Cela permet d'assurer un contact complet entre les couches et réduit la probabilité de piéger de l'air.

En conclusion, ce dispositif permet une modélisation contrôlée du stress compressif au sein d'une matrice de collagène tridimensionnelle, physiologiquement pertinente, qui soutient les interactions tumeur-immunité. Cette plateforme offre un outil pour étudier la manière dont les forces mécaniques statiques et dynamiques régulent la destruction immunitaire et le comportement tumoral au sein du microenvironnement tumoral. Actuellement, nous identifions le mécanisme moléculaire sous-jacent à la modulation mécanique de la destruction immunitaire des cellules tumorales. Ces études pourraient conduire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques médicamenteuses potentielles.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail est soutenu par une subvention du National Cancer Institute (subvention R01CA221346), par la bourse Lance R. Collins décernée par le College of Engineering de l'Université Cornell à FM, et par le Fonds du recteur de Cornell pour la résilience de la recherche attribué à FM. Ce travail a été réalisé en partie à la Cornell NanoScale Facility, membre de la National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI), qui est soutenue par la National Science Foundation (subvention NNCI-2025233).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 N NaOHSigma-Aldrich797247 µL
Milieu M199 10×Sigma-AldrichM0650200 µL
2-mercaptoéthanolThermoFisher313500100
Compresseur d'airElveflowCompresseur Jun-Air modèle 3
Plateau microscope automatisé X-YApplied Scientific InstrumentationMS-2000
Caméra CCDHamamatsu PhotonicsORCA-R2
Sérum de veau fœtal (FBS)GeminiBioS11150
Tuyau de distribution de fluideEleveflowRouleau de rechange en tuyau PTFEDiamètre extérieur de 1/16 po
Source lumineuse à fluorescenceExcelitas Technologies Unité X-Cite série 120 PC
Acide foliqueSigmaF7876
GlutaraldéhydeEM Sciences 160190,10 %
Nettoyeur à plasma HarrickHarrick PlasmaPDC-001-HPRéglage haute puissance (45 W)
Sérum de cheval (HS)ThermoFisher16050-122
Microscope inversé à épifluorescenceOlympusIX81Objectif 20x (NA = 0,25), utilisé avec le logiciel Olympus CellSens
MasqueArtusFeuille d'aluminium de 10 feuillesÉpaisseur de 0,0125 po (0,75 mm)
Ligne cellulaire stable MCF-7/GFP (Purogénine)GenTarget IncSC050-G
Châssis métalliquePersonnalisé Personnalisé 
Réservoir microfluidiqueEleveflowRéservoir microfluidique de 50 mL 
Microscope OlympusCKX41Objectif 4x              (NA = 0,1)
Myo-inositolSigmaI7508
NK-92 MIATCCCRL-2407
Pénicilline/streptomycineGibco 15140122
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ThermoFisher 10010072
Tuyau pneumatiqueEleveflowTuyau transparent en polyéther PUR, entréeDiamètre extérieur de 4 mm
Polyéthylènimine (PEI)Sigma-AldrichP31431 %
Contrôleur de pressionElveflowOB1 NK4Fonctionne avec le logiciel Elveflow Smart Interface
Collagène de type I de queue de rat Corning35424931,3 µL de collagène stock à 9,6 mg/mL
VisPhillipsTête plate M2,512 vis
Incubateur de plateauPrecision PlasticPersonnalisé
SeringueBecton Dickinson303134Associée à un raccord mâle Luer à verrouillage intégral de 3/32 po OD Barb d'Eleveflow
Milieu α-MEMThermoFisher12561056

Références

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