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Article de méthode

Évaluation guidée par réseau du β-sitostérol dans des modèles de cellules mésangiales inflammatoires et profibrotiques pertinents pour la glomérulonéphrite chronique

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DOI :

10.3791/73000

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28 août 2026

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1Hemodialysis Room, Hospital of Traditional Chinese Medicine of Qiqihar, 2Department of Nephrology, Ezhou Central Hospital, 3Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, The First Hospital of Qiqihar, 4Department of Nephrology, Shanghai Minhang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cette étude intègre la pharmacologie des réseaux, l'alignement moléculaire validé et des expériences in vitro afin d'évaluer les relations candidates entre composés et cibles entre les constituants du Cordyceps sinensis et les processus liés à la glomérulonéphrite chronique. Le β-sitostérol a été sélectionné pour la validation au niveau du composé et s'est révélé atténuer l'activation inflammatoire et profibrotique dans des modèles de cellules mésangiales.

Résumé

La glomérulonéphrite chronique (GNC) se caractérise par une lésion inflammatoire persistante et un remodelage fibrotique progressif, mais les relations composé-cible sous-jacentes aux interventions basées sur des produits naturels restent incomplètement définies. Cette étude a combiné la pharmacologie en réseau, un dockage moléculaire validé et des expériences in vitro afin d'évaluer les constituants candidats du Cordyceps sinensis (C. sinensis) dans les processus pathologiques liés à la GNC. Les constituants candidats du C. sinensis ont été sélectionnés, et les cibles associées aux composés provenant de la base de données et plateforme d'analyse de la pharmacologie systémique de la médecine traditionnelle chinoise ont été croisées avec les gènes associés à la GNC. Des analyses d'enrichissement fonctionnel et d'interaction protéine-protéine ont permis de hiérarchiser les processus biologiques et les cibles centrales. Le gène PTGS2 a été identifié comme une cible centrale commune. Un dockage moléculaire a été réalisé à l'aide d'une structure de COX-2 liée au célécoxib. Le redockage du ligand cocrystallisé, le célécoxib, a reproduit la conformation cristallographique avec une RMSD de 0,876 Å, validant ainsi le protocole de dockage. Le β-sitostérol et l'acétate de linoléyle ont montré une compatibilité prévue avec la région de dockage de la COX-2, avec des affinités de liaison respectives de −7,2 et −7,5 kcal/mol. Le β-sitostérol a été sélectionné pour une validation au niveau du composé dans des cellules mésangiales glomérulaires de rat HBZY-1. À des concentrations de 0,5 à 10 µM, le β-sitostérol n'a pas notablement réduit la viabilité cellulaire. Dans des cellules stimulées par le lipopolysaccharide (LPS), le β-sitostérol a réduit l'expression de Tnf, Il6 et Ptgs2, diminué la production de prostaglandine E2 (PGE2) et abaissé l'abondance protéique de la cyclooxygénase-2 (COX-2). Dans des cellules traitées par le facteur de croissance transformant β1 (TGF-β1), le β-sitostérol a réduit l'expression de Col1a1 et Acta2 et diminué l'abondance protéique de l'actine alpha lisse (α-SMA). Ces résultats fournissent des éléments suggérant que le β-sitostérol module l'activation inflammatoire et profibrotique dans des modèles de cellules mésangiales, sans toutefois établir une inhibition enzymatique directe de la COX-2 ou une efficacité thérapeutique dans la GNC.

Introduction

La glomérulonéphrite chronique (CGN) regroupe un ensemble hétérogène de troubles glomérulaires pouvant évoluer vers une maladie rénale chronique et une insuffisance rénale terminale1. Elle se caractérise par une lésion glomérulaire persistante, une activation inflammatoire et une remodélisation fibreuse progressive2,3. Bien que les corticostéroïdes et les agents immunosuppresseurs soient utilisés chez certains patients, un contrôle durable de la maladie reste difficile dans de nombreux cas, et les effets indésirables liés au traitement sont fréquents1,4,5. L'évolution de la CGN implique des processus pathologiques interconnectés, notamment l'activation immunitaire, une dysfonction endothéliale, un stress oxydatif et l'accumulation de la matrice extracellulaire3,6,7. Par conséquent, l'identification de nœuds moléculaires reliant les réponses inflammatoires et profibrotiques pourrait permettre d'élaborer des hypothèses testables concernant des stratégies thérapeutiques pertinentes pour la maladie.

Cordyceps sinensis (C. sinensis) a été utilisé dans des contextes cliniques et expérimentaux liés aux reins et s'est révélé exercer des effets anti-inflammatoires, anti-apoptotiques et cytoprotecteurs dans plusieurs modèles de maladies8,9,10. Toutefois, la base moléculaire selon laquelle ses constituants candidats pourraient interagir avec des cibles pertinentes pour la glomérulonéphrite reste insuffisamment définie11. Compte tenu de la nature multi-composants de C. sinensis et de l'hétérogénéité mécanistique de la NGC, la pharmacologie en réseau fournit un cadre utile pour hiérarchiser les relations composés candidats-cibles-voies12,13.

Dans cette étude, le criblage de composés, la récupération de cibles, l'analyse d'intersection gène-maladie, l'enrichissement fonctionnel, l'analyse du réseau d'interactions protéine-protéine, le dockage moléculaire et une validation in vitro ont été combinés afin d'explorer les relations moléculaires potentielles entre les constituants candidats de C. sinensis et les processus pathologiques liés à la CGN. La prostaglandine-endoperoxyde synthase 2 (PTGS2) a été identifiée comme une cible centrale dans le réseau composé-maladie et a été évaluée par dockage moléculaire à l'aide d'une structure de la cyclooxygénase-2 (COX-2) liée au célécoxib, avec une validation par redockage. Sur la base des résultats du réseau, de l'analyse de dockage et des données antérieures concernant l'activité anti-inflammatoire et anti-fibrosante, le β-sitostérol a été sélectionné comme composé candidat représentatif pour la validation en aval14,15,16. Des cellules mésangiales stimulées par le lipopolysaccharide (LPS) ont été utilisées pour évaluer l'activation inflammatoire et la réponse associée à la COX-2/prostaglandine E2 (PGE2), tandis qu'un modèle induit par le facteur de croissance transformant β1 (TGF-β1) a été inclus pour évaluer l'expression des marqueurs profibrosants.

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Protocole

Les analyses de pharmacologie en réseau et de bio-informatique étaient basées sur des bases de données publiquement accessibles et n'ont pas impliqué de participants humains ni d'animaux. Les expériences in vitro ont été réalisées à l'aide d'une lignée cellulaire établie et n'ont pas nécessité d'approbation éthique selon les exigences institutionnelles.

Recherche de constituants candidats et récupération de cibles

Les constituants candidats et leurs cibles correspondantes ont été récupérés à partir de la base de données et plateforme d'analyse Pharmacologie des Systèmes de la Médecine Traditionnelle Chinoise (TCMSP) en utilisant le terme de recherche « dongchongxiacao » le 13 juillet 2025. Les composés présentant une biodisponibilité orale prédite d'au moins 30 % et une similarité aux médicaments d'au moins 0,18 ont été retenus. Sept constituants candidats ont satisfait aux deux critères de sélection. Le poids moléculaire, la biodisponibilité orale, la similarité aux médicaments et d'autres descripteurs pharmacocinétiques disponibles ont été enregistrés à partir de TCMSP pour une comparaison descriptive.

Les informations composé-cible associées aux constituants conservés ont été téléchargées directement à partir de TCMSP. Les entrées cibles en double ont été supprimées manuellement lors de la construction du jeu de cibles non redondant, tandis que les relations originales composé-cible ont été conservées pour la construction ultérieure du réseau. Étant donné que TCMSP fournissait les noms des cibles sous leur forme complète plutôt que sous forme de symboles génétiques normalisés, chaque cible a été recherchée dans la base de données UniProt (consultée le 14 juillet 2025). L'entrée humaine correspondante a été sélectionnée, et le nom de la cible a été converti en son symbole génétique officiel. Le jeu de données composé-cible normalisé a été utilisé pour l'analyse de l'intersection cible-maladie et du réseau composé-cible.

Collecte de gènes associés à la glomérulonéphrite et intersection des cibles

Les gènes associés à la maladie ont été extraits de GeneCards, DisGeNET, PharmGKB et de la Therapeutic Target Database en utilisant le terme de recherche « glomerulonephritis » le 14 juillet 2025. Pour GeneCards, seules les entrées dont le score de pertinence était supérieur au score médian de 10 ont été conservées. Les entrées admissibles provenant des autres bases de données ont été incluses selon leurs annotations curatées entre maladie et cible. Les noms des gènes ont été normalisés selon les symboles officiels des gènes humains, et les doublons ont été supprimés. Cette procédure a permis d'obtenir 1 134 gènes uniques associés à la glomérulonéphrite. Étant donné que la recherche utilisait le terme plus général « glomerulonephritis », l'ensemble de données obtenu a été considéré comme pertinent pour les processus moléculaires associés à la glomérulonéphrite chronique, plutôt que spécifique à un seul sous-type histopathologique.

Les cibles associées aux composés dérivés de TCMSP ont été croisées avec le jeu de gènes associés à la maladie à l'aide de R. Vingt-trois cibles communes ont été identifiées. Les diagrammes de Venn ont été générés à l'aide du package R venn, et le réseau cible commun-composé a été construit et visualisé à l'aide de Cytoscape. Les relations entre les constituants candidats et les cibles communes sont résumées dans Tableau 1.

Analyses d'enrichissement fonctionnel et d'interactions entre protéines

Des analyses d'enrichissement de la Gene Ontology (GO) et de la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ont été réalisées dans R à l'aide des packages clusterProfiler et org.Hs.eg.db. Les termes de la Gene Ontology ont été analysés selon les catégories processus biologique, composant cellulaire et fonction moléculaire. Les valeurs de p ont été ajustées pour les tests multiples selon la méthode de Benjamini-Hochberg, et les termes ou voies présentant des valeurs de p ajustées inférieures à 0,05 ont été conservés. Les termes et voies enrichis ont été représentés à l'aide de graphiques en barres et de diagrammes en points générés indépendamment.

Les 23 cibles chevauchantes ont été soumises à STRING, avec Homo sapiens sélectionné comme organisme et un score d'interaction minimal supérieur à 0,4. Le réseau d'interactions protéine-protéine résultant a été importé dans Cytoscape. La topologie du réseau a été évaluée à l'aide de CytoNCA selon les paramètres suivants : degré, centralité d'intermédiarité, centralité de proximité, centralité vectorielle, connectivité moyenne locale et centralité du réseau. Les cibles centrales ont été définies comme les nœuds dont les valeurs de degré, de centralité d'intermédiarité, de centralité de proximité, de centralité vectorielle, de connectivité moyenne locale et de centralité du réseau étaient toutes supérieures aux valeurs médianes correspondantes du réseau. Cette analyse a permis de hiérarchiser neuf cibles centrales pour l'interprétation ultérieure.

Validation du dockage moléculaire et du redockage

Le dockage moléculaire a été réalisé à l'aide de la structure de la cyclooxygénase-2 liée au célécoxib, d'identifiant PDB 3LN1. La chaîne A et son groupe hème associé ont été conservées comme récepteur, tandis que les molécules d'eau cristallographiques et le ligand célécoxib co-cristallisé ont été supprimés lors de la préparation du récepteur. La conformation native du célécoxib a été extraite séparément de la chaîne A afin de valider le redockage. Des atomes d'hydrogène polaires et des charges de Gasteiger ont été ajoutés à l'aide d'AutoDockTools, puis le récepteur a été enregistré au format PDBQT. L'identifiant PDB 3LN1 correspond à une structure de COX-2 murin liée au célécoxib, résolue à 2,40 Å. Les structures du β-sitostérol et de l'acétate de linoléyle ont été obtenues à partir de PubChem et préparées à l'aide d'Open Babel. Des atomes d'hydrogène et des charges partielles de Gasteiger ont été ajoutés, les liaisons rotatables ont été définies, puis chaque ligand a été converti au format PDBQT. Le célécoxib, le β-sitostérol et l'acétate de linoléyle ont été dockés à l'aide d'AutoDock Vina en utilisant le même récepteur et les mêmes paramètres de recherche.

La boîte de docking a été centrée sur la région native de fixation de la célécoxib en utilisant les coordonnées suivantes : center_x = 30,9886, center_y = -22,2836, center_z = -16,5072, size_x = 26 Å, size_y = 26 Å, size_z = 26 Å. La valeur d'exhaustivité a été fixée à 16, le nombre de modes de sortie à 10, et la plage d'énergie à 3 kcal/mol. La pose classée en tête, basée sur l'énergie de liaison prédite la plus faible, a été conservée pour la visualisation. Pour la validation du protocole, la célécoxib native a été redockée dans les mêmes conditions, et l'écart quadratique moyen des atomes lourds entre les poses cristallographique et redockée a été calculé à l'aide de PyMOL. Un écart quadratique moyen inférieur à 2 Å a été considéré comme une reproduction acceptable de la pose de référence. Les résidus situés à moins de 4 Å de chaque ligand docké ont été identifiés dans PyMOL. Les scores de docking et les poses ont été interprétés comme des estimations de la compatibilité structurale et non comme une preuve directe de liaison à la cible ou d'inhibition enzymatique.

Culture cellulaire et préparation des composés

Les cellules mésangiales glomérulaires de rat HBZY-1 ont été cultivées dans un milieu de Dulbecco modifié (DMEM) à haute teneur en glucose, complété avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine, à 37 °C dans des conditions humidifiées avec 5 % de CO₂. Les cellules aux passages 2 à 7 ont été utilisées pour toutes les expériences, et l'absence de mycoplasmes a été vérifiée avant utilisation. Le β-sitostérol et la célécoxib ont été utilisés comme composés chimiquement définis. Le β-sitostérol a été dissous dans de l'éthanol absolu afin d'obtenir une solution mère de 10 mM (environ 4,15 mg/mL). Si nécessaire, une sonication brève et un réchauffage à 50–60 °C ont été effectués pour obtenir une solution limpide à l'œil nu. La célécoxib a été dissoute dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) pour préparer une solution mère de 10 mM (environ 3,81 mg/mL). Les solutions mères ont été aliquotées et stockées à −20 °C. Avant traitement, les solutions mères ont été diluées directement dans le milieu de culture préchauffé et immédiatement mélangées.

Les concentrations de véhicule ont été appariées au sein de chaque expérience. Dans le test de viabilité cellulaire, la concentration finale d'éthanol a été ajustée à 0,2 % (v/v) dans tous les groupes, car la concentration la plus élevée de β-sitostérol testée était de 20 µM. Dans l'expérience inflammatoire induite par le LPS, les concentrations finales d'éthanol et de diméthylsulfoxyde ont été ajustées respectivement à 0,1 % et 0,01 % (v/v) dans tous les groupes. Dans l'expérience profibrotique induite par le TGF-β1, la concentration finale d'éthanol a été ajustée à 0,1 % (v/v) dans tous les groupes. Des volumes équivalents des véhicules correspondants ont été ajoutés aux groupes Témoin, LPS et TGF-β1.

Dosage de la viabilité cellulaire

Les cellules ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits à une densité de 5 × 103 cellules par puits dans 100 µL de milieu complet et ont été laissées à s’adhérer pendant 24 h. Pour évaluer la gamme de concentrations du β-sitostérol, les cellules ont été incubées avec 0,5, 1, 5, 10 ou 20 µM de β-sitostérol pendant 24 h. Pour le test de viabilité cellulaire lié au LPS, les cellules ont été prétraitées avec du β-sitostérol à 1, 5 ou 10 µM pendant 2 h, puis exposées à 1 µg/mL de lipopolysaccharide pendant 24 h supplémentaires.

Les groupes de traitement étaient les suivants : témoin, β-sitostérol à 0,5 µM, β-sitostérol à 1 µM, β-sitostérol à 5 µM, β-sitostérol à 10 µM, β-sitostérol à 20 µM, LPS, LPS plus β-sitostérol à 1 µM, LPS plus β-sitostérol à 5 µM, et LPS plus β-sitostérol à 10 µM. Le réactif du kit de comptage cellulaire Cell Counting Kit-8 a été ajouté à raison de 10 µL par puits, puis les plaques ont été incubées pendant 2 h. L'absorbance a ensuite été mesurée à 450 nm. La viabilité cellulaire a été déterminée après soustraction du témoin sans cellules et exprimée par rapport au groupe témoin. Chaque condition comprenait six puits techniques pour chacune des six expériences biologiques indépendantes. Les valeurs des puits techniques de chaque expérience ont été moyennées afin d'obtenir une valeur par réplicat biologique pour l'analyse statistique.

Activation inflammatoire induite par le LPS

Pour les expériences d'activation inflammatoire, les cellules HBZY-1 ont été cultivées dans des plaques de 6 puits à une densité de 2 × 105 cellules par puits et traitées après avoir atteint une confluence d'environ 70 à 80 %. Les cellules ont été maintenues dans un milieu supplémenté avec 1 % de sérum de veau fœtal pendant 12 heures avant le traitement. Le β-sitostérol ou la célécoxib ont été administrés 2 heures avant la stimulation par le LPS. Par la suite, les cellules ont été exposées à 1 µg/mL de LPS pendant 24 heures.

Les groupes expérimentaux étaient les suivants : contrôle, β-sitostérol à 10 µM, LPS, LPS plus β-sitostérol à 1 µM, LPS plus β-sitostérol à 5 µM, LPS plus β-sitostérol à 10 µM, et LPS plus célécoxib à 1 µM. Le célécoxib a été inclus comme témoin positif fonctionnel d'inhibition de la production de prostaglandines dépendante de la COX-2. À la fin du traitement, les surnageants de culture ont été recueillis pour la mesure du PGE2. Les cellules ont été recueillies séparément pour une analyse par PCR quantitative en temps réel des gènes Tnf, Il6 et Ptgs2, ainsi que pour une analyse par immunoblotting de la COX-2.

Activation profibrotique induite par le TGF-β1

Un modèle distinct induit par le TGF-β1 a été utilisé pour évaluer l'activation profibrotique. Les cellules HBZY-1 ont été ensemencées dans des plaques de 6 puits à une densité de 2 × 105 cellules par puits et maintenues dans un milieu supplémenté avec 1 % de sérum de veau fœtal pendant 12 h avant le traitement. Les cellules ont été prétraitées avec du β-sitostérol pendant 2 h, puis stimulées avec 10 ng/mL de TGF-β1 recombinant pendant 48 h.

Les groupes de traitement comprenaient le témoin, le β-sitostérol (10 µM), le TGF-β1, le TGF-β1 + β-sitostérol (5 µM) et le TGF-β1 + β-sitostérol (10 µM). À la fin de la période de traitement, les cellules ont été récoltées pour une analyse par PCR quantitative en temps réel de Col1a1 et de Acta2, ainsi que pour une analyse par immunobuvardage de l'actine alpha du muscle lisse (α-SMA).

PCR quantitative en temps réel

L'ARN total a été isolé à partir de cellules traitées à l'aide d'un réactif d'extraction de l'ARN à base de phénol-guanidinium, selon le protocole du fabricant. La concentration et la pureté de l'ARN ont été déterminées à l'aide d'un spectrophotomètre. Seuls les échantillons présentant un rapport A260/A280 compris entre 1,8 et 2,0 ont été utilisés pour la transcription inverse. Pour chaque échantillon, 1 µg d'ARN total a été transcrit en ADN complémentaire dans un volume réactionnel final de 20 µL. L'ADN complémentaire obtenu a été dilué au cinquième avec de l'eau sans nucléase avant la PCR quantitative. La PCR quantitative a été réalisée dans un volume total de 20 µL contenant 10 µL de mix maître SYBR Green 2×, 0,4 µL de chacun des amorces avant et arrière à 10 µM, 2 µL d'ADN complémentaire dilué et 7,2 µL d'eau sans nucléase. Les conditions d'amplification comprenaient une étape initiale de dénaturation à 95 °C pendant 30 s, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 5 s et d'hybridation-élongation à 60 °C pendant 30 s. Une analyse de la courbe de fusion a ensuite été réalisée de 65 °C à 95 °C afin de vérifier la spécificité de l'amplification.

Les gènes mesurés étaient Tnf, Il6, Ptgs2, Col1a1, Acta2 et Gapdh. Le gène Gapdh a servi de gène de référence interne. L'expression relative des gènes a été déterminée à l'aide de la méthode 2−ΔΔCt, le groupe témoin étant utilisé comme calibrateur. Les séquences des amorces sont indiquées dans le Tableau supplémentaire 1. Chaque échantillon a été analysé en triplets techniques, et six expériences biologiques indépendantes ont été réalisées. Les valeurs obtenues à partir des réplicats techniques ont été moyennées avant l'analyse statistique.

Mesure du PGE2 par dosage immunoenzymatique

Les surnageants de culture ont été recueillis après 24 h de stimulation par le LPS et centrifugés à 1 000 ×g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires. Les concentrations de PGE2 ont été déterminées à l’aide d’un kit de dosage immunoenzymatique disponible commercialement, conformément aux instructions du fabricant.

Les étalons et les échantillons ont été chargés en double sur la plaque d'analyse. Après la liaison des anticorps et les étapes de développement de la couleur, l'absorbance a été mesurée à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques. Les concentrations de PGE2 ont été déterminées à partir d'une courbe standard logistique à quatre paramètres et exprimées en pg/mL. Les surnageants de six expériences cellulaires indépendantes ont été analysés. Les mesures en double de chaque échantillon biologique ont été moyennées avant l'analyse statistique.

Immunotransfert

Les cellules traitées ont été lysées dans un tampon d'essai d'immunoprécipitation radio-immunologique complété par un mélange d'inhibiteurs de protéases. Les lysats ont été incubés sur de la glace pendant 30 min et centrifugés à 12 000 × g pendant 15 min à 4 °C. Les concentrations protéiques dans les surnageants ont été déterminées à l'aide d'un dosage protéique à l'acide bicinchoninique. Des quantités équivalentes de protéines (30 µg par puits) ont été mélangées au tampon de charge et dénaturées à 95 °C pendant 5 min. Les protéines provenant des expériences avec le LPS ont été séparées sur des gels de polyacrylamide à 10 % contenant du dodécylsulfate de sodium, tandis que celles des expériences avec le TGF-β1 ont été séparées sur des gels à 12 %. Les protéines séparées ont ensuite été transférées sur des membranes de fluorure de polyvinylidène.

Les membranes ont été bloquées avec du lait écrémé à 5 % dans une solution saline tamponnée au Tris contenant 0,1 % de Tween 20 pendant 1 h à température ambiante, puis incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires dirigés contre COX-2 (1:1000), α-SMA (1:1000) et GAPDH (1:5000). L'analyse de COX-2 a été réalisée sur des échantillons provenant de l'expérience avec le LPS, tandis que celle de α-SMA a été effectuée sur des échantillons issus de l'expérience avec le TGF-β1. Après lavage, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (1:5000) pendant 1 h à température ambiante. Les bandes protéiques ont été visualisées à l'aide d'un substrat de chimiluminescence amplifiée et capturées à l'aide d'un système d'imagerie par chimiluminescence. Les temps d'exposition étaient d'environ 10 s pour COX-2, 10 s pour α-SMA et 2 s pour GAPDH.

Les intensités des bandes ont été quantifiées à l'aide d'ImageJ. Les signaux de COX-2 et d'α-SMA ont été normalisés par rapport au signal correspondant de GAPDH. Le western blot a été réalisé à partir d'échantillons protéiques obtenus lors de six expériences indépendantes de culture cellulaire et de traitement.

Analyse statistique

Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide de GraphPad Prism. Les données sont présentées sous la forme de la moyenne ± l'écart type. Six expériences indépendantes de culture cellulaire et de traitement ont été effectuées pour chaque analyse quantitative, chaque expérience indépendante représentant un réplicat biologique. Les mesures issues des réplicats techniques obtenus à partir de la même expérience biologique ont été moyennées avant l'analyse statistique et n'ont pas été considérées comme des observations indépendantes.

Pour le test de viabilité cellulaire, chaque expérience biologique comprenait six puits techniques par condition. Les réactions de PCR quantitative ont été réalisées en triple technique pour chaque échantillon biologique, et les mesures de PGE2 ont été effectuées en double. La quantification par immunotransfert était basée sur six échantillons protéiques préparés indépendamment. Ainsi, chaque barre quantitative contient six valeurs issues de réplicats biologiques individuels.

Les différences entre plusieurs groupes ont été analysées à l'aide d'une analyse de la variance à un facteur suivie du test de comparaison multiple de Tukey. Une valeur P bilatérale < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Les valeurs individuelles des réplicats biologiques ont été représentées conjointement avec la moyenne et l'écart type.

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Résultats

Écranage des constituants candidats, récupération des cibles et intersection des cibles

Le flux de travail pour l'identification des cibles communes aux composés candidats et aux maladies est résumé dans la Figure 1A. Sept composés candidats de C. sinensis ont satisfait aux critères prédéfinis de criblage, soit une biodisponibilité orale (OB) ≥30 % et une similarité de structure (DL) ≥0,18, notamment l'acide arachidonique, l'acétate de li...

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Discussion

Cette étude a combiné la pharmacologie en réseau, le dockage moléculaire validé par ligand de référence et des expériences au niveau des composés afin d'évaluer une hypothèse associée à PTGS2, dérivée de constituants candidats de C. sinensis. Sept constituants ont satisfait aux critères prédéfinis de criblage TCMSP, et 23 cibles présentaient un recoupement avec le jeu de gènes associés à la glomérulonéphrite. L'analyse d'interaction protéique a permis de hiérarchiser neuf cibles centrales, parmi lesquel...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas avoir d'intérêts concurrents. Des outils basés sur l'intelligence artificielle (ChatGPT, OpenAI) ont été utilisés pour aider à la révision linguistique et à la conception préliminaire de schémas. Une intelligence artificielle générative a été utilisée pour aider à la préparation de brouillons graphiques préliminaires des figures 1A et 7, qui ont ensuite été examinés et révisés par les auteurs afin d'assurer leur cohérence avec les méthodes et résultats rapportés. Toutes les productions assistées par l'IA ont été évaluées de manière critique et approuvées par les auteurs. Les auteurs ont vérifié le contenu final des figures et assument l'entière responsabilité de l'intégrité et de l'exactitude du manuscrit.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par la spécialité caractéristique en néphropathie intégrant la médecine traditionnelle chinoise et la médecine occidentale (ZYTSZK2-3) et par l'étude sur la stratégie d'intervention de la médecine traditionnelle chinoise dans la maladie rénale chronique du point de vue de la gestion des maladies chroniques (202240169).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Éthanol absoluSigma-Aldrich/MerckE7023Éthanol non dénaturé de qualité biologie moléculaire à 200 degrés, solvant pour la solution mère de β-sitostérol.
AutoDock VinaScripps ResearchVersion 1.1.2Simulation de docking moléculaire
Enceinte de sécurité biologiqueThermo Fisher Scientific1300 Series A2Opérations stériles de culture cellulaire
CélécoxibMedChemExpressHY-14398Inhibiteur sélectif de la COX-2 utilisé comme contrôle positif ; solution mère à 10 mM dans le DMSO. 
Kit de comptage cellulaire-8Dojindo Molecular Technologies, Inc.CK04Dosage colorimétrique WST-8 pour la viabilité cellulaire ; mesure de l'absorbance à 450 nm.
Système d'imagerie par chimiluminescenceBio-Rad LaboratoriesChemiDoc MPAcquisition d'images de western blot
Pack R clusterProfilerBioconductorVersion 4.10.0Analyse d'enrichissement GO et KEGG
Incubateur de culture cellulaire au CO2Thermo Fisher ScientificForma Series II 3111Incubation des cultures cellulaires à 37 °C et 5 % de CO2
Anticorps monoclonal de lapin COX-2 (D5H5)Cell Signaling Technology12282Validé par western blot pour la COX-2 humaine, murine et rat ; utilisé à une dilution de 1:1 000.
Module complémentaire CytoNCABoutique d'applications CytoscapeVersion 2.1.6Analyse topologique des cibles centrales
Logiciel CytoscapeConsortium CytoscapeVersion 3.8.0Visualisation et analyse de réseaux
DiméthylsulfoxydeSigma-Aldrich/MerckD2650Réactif biologique filtré stérile, ≥99,7 % ; solvant pour la solution mère de célécoxib.
Base de données DisGeNETGroupe d'informatique biomédicale intégrativeNon applicableExtraction de gènes associés à la glomérulonéphrite
Milieu de culture de Dulbecco modifié (DMEM)Gibco/Thermo Fisher ScientificC11995500BTMilieu de base pour la culture cellulaire HBZY-1
Substrat chimiluminescent amélioréBeyotime BiotechnologyP0018SVisualisation des bandes de western blot
Sérum de veau fœtalGibco/Thermo Fisher Scientific10099-141CComplément sérique pour la culture cellulaire
Anticorps monoclonal de lapin GAPDH (D16H11)Cell Signaling Technology5174Témoin de chargement en western blot ; réactif avec le GAPDH humain, murin et rat ; utilisé à une dilution de 1:5 000 après optimisation interne.
Base de données GeneCardsInstitut Weizmann des sciencesNAExtraction de gènes associés à la glomérulonéphrite
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0.0.121Analyse statistique des données expérimentales in vitro
Anticorps secondaire IgG de chèvre anti-lapin conjugué à la HRPProteintech GroupSA00001-2Anticorps secondaire pour les anticorps primaires de lapin
Logiciel ImageJNational Institutes of HealthVersion 1.54Analyse densitométrique de western blot
Microscope inversé à contraste de phaseOlympusCKX53Observation de la morphologie cellulaire
Pack R org.Hs.eg.dbBioconductorVersion 3.18.0Annotation des gènes humains pour l'analyse d'enrichissement
Solution de pénicilline-streptomycineGibco/Thermo Fisher Scientific15140122Complément antibiotique pour la culture cellulaire
Kit de dosage du paramètre PGE2R&D Systems, une marque Bio-TechneKGE004BELISA compétitif multi-espèces pour les surnageants de culture cellulaire ; plage de dosage de 39–2 500 pg/mL ; détection colorimétrique à 450 nm.
Base de données PharmGKBPharmacogenomics KnowledgebaseNAExtraction de cibles liées à la maladie
Base de données PubChemCentre national d'information biotechnologiqueNAExtraction des structures des ligands
Mébrane PVDFMillipore/MerckIPVH00010Mébrane de transfert protéique pour le western blot
Système graphique moléculaire PyMOLSchrödinger, LLCVersion 2.6.2Visualisation des poses de docking
Logiciel RFondation R pour l'informatique statistiqueVersion 4.3.2Analyse d'intersection et d'enrichissement des cibles
Ligne cellulaire de cellules mésangiales glomérulaires de rat (HBZY-1)Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0117Modèle de validation in vitro des cellules mésangiales
Base de données RCSB Protein Data BankCollaboratoire de recherche en bioinformatique structuralePDB ID : 3LN1Extraction de la structure cristalline de PTGS2/COX2
Protéine recombinante humaine TGF-β1PeproTech, une marque Thermo Fisher Scientific100-21-10UGTGF-β1 humain recombinant dérivé de HEK293 ; stimulation profibrotique à 10 ng/mL. 
Système d'électrophorèse SDS-PAGEBio-Rad LaboratoriesMini-PROTEAN TetraSéparation des protéines par SDS-PAGE
Base de données STRINGELIXIR/Consortium STRINGVersion 12.0Construction de réseau d'interactions protéine-protéine
Base de données TCMSPBase de données de pharmacologie systémique de la médecine traditionnelle chinoiseNAPrésélection des composés candidats de Cordyceps sinensis
Base de données des cibles thérapeutiquesGroupe de recherche sur les médicaments innovants et l'informatique biomédicaleNAExtraction de cibles thérapeutiques
Anticorps primaire α-SMAProteintech Group14395-1-APDétection de l'expression protéique de α-SMA
β-Sitostérol (pureté >98 %)MedChemExpressHY-N0171ACAS 83-46-5 ; composé défini utilisé pour le traitement cellulaire ; solution mère à 10 mM dans l'éthanol absolu. 

Références

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