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La capsule Yangjing atténue le dysfonctionnement spermatogénique chez la souris en inhibant la voie QKI-5/p38 MAPK via la régulation positive de l'incRNA NONMMUT031883.2

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DOI :

10.3791/73166

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28 août 2026

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1Department of Andrology, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine/Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine, 2Medical College of Qinghai University, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 4Anorectal Surgery, Jiangbei Branch of Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 5Department of Andrology, Shaanxi Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

Dans cet article

Résumé

Cette étude évalue les effets protecteurs de la capsule Yangjing sur le dysfonctionnement de la spermatogenèse induit par la cyclophosphamide chez la souris et examine le rôle de la voie de signalisation lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.

Résumé

Le dysfonctionnement de la spermatogenèse est une cause importante d'infertilité masculine, et le cyclophosphamide (CP) peut altérer la spermatogenèse en induisant une apoptose anormale des spermatogonies. La capsule Yangjing (YC) est utilisée pour améliorer la fonction reproductive, mais son mécanisme moléculaire sous-jacent reste mal compris. Cette étude a examiné les effets protecteurs de la YC dans un modèle murin de dysfonctionnement de la spermatogenèse induit par le CP et dans des cellules spermatogoniales GC-1. Le nombre et la mobilité des spermatozoïdes, la fertilité masculine, les taux sériques d'hormones sexuelles et les modifications histopathologiques des testicules et des épididymes ont été évalués. La viabilité cellulaire, la libération de lactate déshydrogénase, l'apoptose et les protéines liées à l'apoptose ont été analysées dans les cellules GC-1. La transcription inverse quantitative en chaîne par polymérase (RT-qPCR), les tests d'immunoprécipitation de l'ARN, l'immunofluorescence et le Western blot ont été utilisés pour examiner l'ARN long non codant NONMMUT031883.2, la protéine Quaking-5 (QKI-5) et la voie de signalisation de la protéine kinase activée par un stress mitogène p38 (p38 MAPK). La YC a amélioré de manière dépendante de la dose la qualité du sperme, les taux sériques d'hormones sexuelles, la morphologie des organes reproducteurs, l'histopathologie testiculaire et la fertilité chez les souris traitées au CP. Dans les cellules GC-1, la YC a augmenté la viabilité cellulaire et réduit les lésions cellulaires et l'apoptose. L'ARN long non codant NONMMUT031883.2 interagit physiquement avec QKI-5, et le traitement par YC a augmenté l'expression de l'ARN long non codant NONMMUT031883.2 tout en réduisant l'expression de QKI-5 et la phosphorylation de p38. Le traitement par YC a inhibé l'apoptose induite par l'extinction de l'ARN long non codant NONMMUT031883.2 dans les cellules GC-1, tandis qu'une surexpression de QKI-5 a atténué les effets anti-apoptotiques de la YC. Ces résultats suggèrent que la YC atténue le dysfonctionnement de la spermatogenèse induit par le CP et que ses effets protecteurs sont médiés par la régulation de la voie de signalisation lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.

Introduction

Le dysfonctionnement de la spermatogenèse désigne un trouble de la reproduction provoqué par des anomalies dans la production, la maturation ou la fonction des spermatozoïdes dans le système reproducteur masculin. Il se caractérise par une diminution du nombre et de la mobilité des spermatozoïdes, ainsi qu'une augmentation du taux de spermatozoïdes malformés.1,2La pathogenèse du dysfonctionnement de la spermatogenèse est complexe et associée à des facteurs génétiques, des troubles auto-immuns, des toxines environnementales, des lésions induites par la chimiothérapie et des atteintes des organes reproducteurs3-5. Des médicaments chimiothérapeutiques tels que la cyclophosphamide (CP) peuvent endommager directement les tubules séminifères testiculaires et induire l'apoptose des spermatogonies, contribuant ainsi au dysfonctionnement spermatogénique masculin.6,7La thérapie de remplacement hormonal, la supplémentation en antioxydants et les technologies de procréation médicalement assistée sont actuellement utilisées comme interventions cliniques. Toutefois, ces approches présentent une efficacité inconstante et des effets indésirables importants.8,9,10Par conséquent, l'identification d'interventions sûres et efficaces ainsi que la clarification de leurs cibles moléculaires revêtent une importance clinique pour améliorer les résultats en matière de fertilité chez les patients présentant un dysfonctionnement de la spermatogenèse.

La médecine traditionnelle chinoise a montré un potentiel dans la protection de la fonction reproductive masculine et le traitement des troubles de la spermatogenèse en raison de ses propriétés multitarget et de sa toxicité relativement faible11,12. La capsule Yangjing (YC) est un médicament breveté chinois composé de Rehmannia glutinosa, Epimedium, de placenta, de Polygonatum sibiricum, de Angelica sinensis et d'autres plantes médicinales chinoises. Elle est utilisée pour tonifier le rein et l'essence, nourrir le sang et la moelle, et réguler la fonction reproductive13. Des études antérieures ont montré que la YC peut réguler les niveaux d'hormones sexuelles chez les animaux mâles, améliorer la qualité du sperme, réparer les lésions tissulaires testiculaires et protéger contre les atteintes reproductrices induites par des agents chimiques14,15. Les cellules spermatogoniques constituent la base de la spermatogenèse, et une apoptose anormale des spermatogonies représente un événement central dans le développement des troubles de la spermatogenèse16. On a également signalé que la YC améliore la viabilité des spermatogonies, augmente la proportion de cellules en phase S et inhibe l'apoptose17. Toutefois, ses effets protecteurs et ses mécanismes moléculaires spécifiques dans les troubles de la spermatogenèse induits par le CP restent peu clairs.

Les ARN non codants longs (lncARN) sont des molécules d'ARN de plus de 200 nucléotides qui ne possèdent pas de capacité de codage protéique18. Les lncARN peuvent réguler l'expression des gènes par des mécanismes incluant le silence chromosomique, la modification de la chromatine, l'empreinte génomique et l'activation transcriptionnelle19,20. La protéine liant l'ARN Quaking-5 (QKI-5) participe à des processus physiologiques et pathologiques, notamment la prolifération cellulaire et l'apoptose, en régulant l'épissage alternatif de gènes en aval21. La voie de la protéine kinase activée par un stress mitogène p38 (MAPK) est impliquée dans la régulation de l'apoptose et joue également un rôle important dans la fertilité masculine et le développement testiculaire22,23. Une étude antérieure a montré qu'une surexpression de QKI-5 active la voie p38 MAPK dans les cellules de carcinome hépatocellulaire24. De plus, il a été démontré que le lncARN NONMMUT074098.2 interagit avec QKI-5 dans les spermatogonies, tandis qu'une inhibition de QKI-5 bloquait la voie p38 MAPK et réduisait l'apoptose spermatogoniale25. Cette étude a utilisé un modèle murin de dysfonction spermatogénique induite par le CP afin d'investiguer si le YC régule l'expression du lncARN NONMMUT031883.2 et l'axe de signalisation QKI-5/p38 MAPK, réduisant ainsi l'apoptose anormale des spermatogonies et atténuant la dysfonction spermatogénique induite par le CP (Figure 1). L'objectif était de préciser le mécanisme moléculaire sous-jacent aux effets protecteurs du YC sur la spermatogenèse et d'approfondir la compréhension de son rôle pharmacologique dans la protection de la fonction reproductive masculine.

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Figure 1 : Schéma du dispositif expérimental. Le panneau supérieur résume les expériences in vitro réalisées sur des cellules spermatogoniales GC-1. L'extinction de l'ARNl NONMMUT031883,2 a été utilisée pour induire l'apoptose et des lésions cellulaires, suivie de l'extinction de QKI-5 afin d'évaluer ses effets sur l'apoptose et les dommages cellulaires. Le panneau inférieur résume les expériences in vivo menées sur des modèles murins de dysfonctionnement spermatogénique induit par la cyclophosphamide (CP). Les souris ont reçu un traitement par la Yangjing Capsule et/ou une intervention ciblant l'ARNl NONMMUT031883,2 ou QKI-5. La fertilité, les taux hormonaux sériques, les tissus testiculaires et épididymaires, la suspension spermatique, les réserves de spermatozoïdes, la qualité du sperme et les lésions histopathologiques testiculaires ont ensuite été évalués. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément aux lignes directrices ARRIVE et au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Tous les protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par le comité d'éthique animal de l'Université du Sud-Est (numéro d'approbation : 20230216022).

1. Préparation du sérum contenant du YC
Deux gélules de Yangjing (YC ; 0,5 g/gélule) ont été ouvertes et 0,8 g de contenu a été pesé. Du sérum physiologique a été ajouté jusqu'à un volume final de 10 mL, puis le mélange a été homogénéisé vigoureusement au vortex afin de préparer une suspension à 80 mg/mL. Des souris mâles BALB/c spécifiques sans agents pathogènes, pesant 22–25 g et âgées de 8 semaines, ont été maintenues à 22 °C et une humidité de 55 à 60 %, sous un cycle lumière/obscurité de 12 h, avec fourniture de nourriture et d'eau ad libitumAprès une semaine d'acclimatation, les souris ont reçu du YC par gavage oral à une dose de 800 mg/kg de poids corporel dans un volume de 10 mL/kg, une fois par jour pendant 5 jours consécutifs. Deux heures après la dernière administration, les souris ont été anesthésiées par une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 1 %, et des échantillons de sang ont été recueillis afin de préparer un sérum contenant du YC. Le sérum a été inactivé à 56 °C pendant 30 min, filtré à travers un 0.22 µm membrane, et stockée à −80 °C jusqu'à l'utilisation.

2. Culture cellulaire et transfection
Les cellules spermatogoniales murines GC-1 ont été cultivées dans du DMEM contenant 1 % de pénicilline-streptomycine et 10 % de sérum bovin fœtal. Tous les cultures ont été maintenus à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % de CO₂ (v/v).

Des ARN interférents courts spécifiques aux ARNl (sh-ARNl), un plasmide d'expression surexprimant QKI-5 (OE-QKI-5), un ARN interférent petit (si-QKI-5) ciblant QKI-5, ainsi que leurs contrôles négatifs correspondants (sh-NC, OE-NC et si-NC) ont été synthétisés et construits. Les cellules GC-1 ont été transfectées avec sh-ARNl ou sh-NC, si-QKI-5 ou si-NC, ou OE-QKI-5 ou OE-NC selon les instructions du réactif de transfection. Après une incubation de 48 h, l'efficacité de transfection a été évaluée en mesurant l'expression de l'ARNl NONMMUT031883.2 ou de QKI-5.

Pour le groupe sh-lncARN + si-QKI-5 + étoposide, les cellules GC-1 ont été transfectées avec le sh-lncARN et le si-QKI-5, puis traitées avec 100 µM d'étoposide pendant 12 h26. Pour les tests ultérieurs de viabilité cellulaire, les cellules GC-1 ont été cultivées dans un milieu enrichi avec 5 %, 10 % ou 20 % de sérum contenant du YC, et ont été désignées respectivement comme les groupes YC à faible dose (L-YC), YC à dose moyenne (M-YC) et YC à forte dose (H-YC). Les concentrations de sérum contenant du YC (5 %, 10 % et 20 % YC) ont été déterminées en fonction des résultats d'expériences préliminaires de gradient de concentration. Pour les groupes sh-lncARN + H-YC + OE-NC et sh-lncARN + H-YC + OE-QKI-5, les cellules GC-1 ont été transfectées avec le sh-lncARN plus OE-NC ou le sh-lncARN plus OE-QKI-5 pendant 48 h, puis exposées à un sérum contenant 20 % de YC pendant 24 h.

3. Essai au kit Cell Counting Kit-8
Les cellules GC-1 ont été semées dans des plaques de 96 puits à raison de 5 × 103 cellules/puits et cultivées pendant 24 h. Après l’attachement des cellules, le milieu initial a été remplacé par 100 µL de milieu complet supplémenté en sérum contenant du YC, puis les cellules ont été incubées pendant 6, 12 ou 24 h. Après incubation, 10 µL du réactif du kit Cell Counting Kit-8 ont été ajoutés à chaque puits, et les cellules ont été incubées à 37 °C à l’abri de la lumière pendant 2 h. L’absorbance à 450 nm a été mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaques.

4. Dosage de la lactate déshydrogénase
Après 48 h de transfection avec sh-NC ou sh-lncARN, le milieu de culture des cellules GC-1 a été recueilli et le surnageant obtenu par centrifugation. Conformément aux instructions du kit de dosage de la lactate déshydrogénase, le surnageant a été doucement mélangé avec la solution de détection working solution et transféré dans une plaque de 96 puits. La plaque a été incubée à 25 °C à l’obscurité pendant 30 min. L’absorbance à 490 nm a été mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaque, et la libération de lactate déshydrogénase a été calculée afin d’évaluer les lésions cellulaires.

5. Coloration au Calcein AM/iodure de propidium
Après une transfection avec sh-NC ou sh-lncRNA pendant 48 h, la viabilité des cellules GC-1 a été évaluée par coloration au Calcein AM/iodure de propidium (PI). Les cellules ont été semées dans des plaques de 12 puits à raison de 5 × 104 cellules/puits et cultivées jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 60 % à 70 %. Les cellules ont été rincées doucement avec du tampon salin phosphate, puis 500 µL de solution de coloration au Calcein AM/PI ont été ajoutés à chaque puits. Les cellules ont été incubées à 37 °C à l'obscurité pendant 30 min, puis observées au microscope à fluorescence. Les cellules vivantes et mortes ont été décomptées à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images, et la proportion de cellules survivantes a été calculée.

6. Cytométrie en flux
Les cellules GC-1 ont été recueillies par centrifugation et rincées délicatement avec du tampon salin phosphate. Le culot cellulaire a été resuspendu dans 500 µL de tampon d'incubation à une densité de 5 × 105 cellules/mL. L'annexine V-APC et l'iodure de propidium (PI) ont ensuite été ajoutées, 5 µL chacune, et la suspension a été bien mélangée puis incubée à 25 °C à l'abri de la lumière pendant 10 min. L'apoptose a été analysée par cytométrie en flux en utilisant des longueurs d'onde d'excitation/émission de 633/660 nm pour l'APC et de 488/630 nm pour le PI. Le taux d'apoptose a été évalué à l'aide d'un logiciel d'analyse par cytométrie en flux.

7. Dosage de l'activité de la caspase-3
Après les traitements indiqués, environ 1 × 106 cellules GC-1 ont été recueillies, rincées et resuspendues dans du tampon phosphate salin. Les cellules ont été mélangées avec 100 µL du réactif II provenant du kit de dosage de l'activité de la caspase-3 et lysées sur glace pendant 15 min. Après centrifugation, 50 µL du surnageant du lysat ont été prélevés et mélangés avec 40 µL du réactif I et 10 µL du réactif III. Le mélange a été incubé à 37 °C pendant 2 h. L'absorbance à 405 nm a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques, et l'activité de la caspase-3 a été évaluée conformément aux instructions du fabricant du kit.

8. Essai de précipitation de l'ARN
Les brins sens et antisens de l'ARNl NONMMUT031883.2 ont été synthétisés selon la séquence correspondante et marqués avec de la biotine. Les cellules ont été lysées dans un tampon de lyse pour immunoprécipitation sur de la glace pendant 30 min, et le surnageant contenant les protéines a été récupéré par centrifugation. Les billes magnétiques streptavidine ont été lavées trois fois avec du tampon de liaison à l'ARN et incubées dans un tampon de liaison contenant 1 % d'albumine de sérum bovin pendant 30 min.

Les billes prétraitées ont été mélangées avec les sondes marquées à la biotine et incubées à 25 °C pendant 30 min. Les sondes non liées ont été éliminées par séparation magnétique. Le surnageant du lysat cellulaire a ensuite été ajouté, et le mélange a été incubé à 4 °C pendant 4 h afin de former des complexes ARN-protéine fixés sur les billes magnétiques. Les billes magnétiques ont été lavées trois fois avec du tampon de lavage pour éliminer les protéines liées de façon non spécifique. Le tampon de lavage a été éliminé par séparation magnétique, puis du tampon de charge 2× SDS a été ajouté. Les échantillons ont été chauffés à 95 °C pendant 10 min, et le surnageant a été récupéré par séparation magnétique en vue d'une analyse par immunoblotting (Western blot) ultérieure.

9. Construction d'un modèle murin de dysfonctionnement de la spermatogenèse
Après 5 jours d'acclimatation, des souris mâles BALB/c spécifiques sans agents pathogènes, pesant 22–25 g et âgées de 8 semaines, ont reçu du cyclophosphamide (CP) par voie intrapéritonéale à raison de 50 mg/kg une fois par jour pendant 7 jours afin d'établir un modèle de dysfonctionnement de la spermatogenèse14,27. Les souris correctement modélisées ont été réparties aléatoirement, à l'aide d'une table de nombres aléatoires, en groupes CP, YC 200 mg/kg, YC 400 mg/kg, YC 800 mg/kg, YC 800 mg/kg + sh-NC et YC 800 mg/kg + sh-lncRNA, avec six souris par groupe.

Les souris des groupes traités au YC ont reçu la dose correspondante de YC par gavage oral une fois par jour pendant 30 jours13. Pour les groupes 800 mg/kg YC + sh-NC et 800 mg/kg YC + sh-lncRNA, après l'établissement réussi du modèle, les souris ont été anesthésiées par inhalation d'isoflurane à 2 %. Après avoir confirmé l'absence de réflexe de retrait plantaire chez chaque souris et la stabilité de la fréquence respiratoire, la zone chirurgicale a été rasée et désinfectée à l'aide de povidone-iodée. En conditions aseptiques, une incision médiane ventrale a été pratiquée à travers la peau et la paroi corporelle en avant des organes génitaux. Le testicule a été exposé en manipulant soigneusement la graisse épididymaire, en prenant soin d'éviter tout dommage vasculaire. À l'aide d'un micromanipulateur, les tubules séminifères ont été visualisés, puis 1 µL de suspension d'adénovirus (1 × 1010 TU/mL) a été injecté lentement à l'aide d'une aiguille de micro-injection28. L'aiguille a été maintenue en place pendant 5 min après l'injection avant d'être retirée lentement, et l'hémostase a été obtenue à l'aide d'un coton stérile. La même procédure a ensuite été réalisée sur le testicule controlatéral. L'incision a ensuite été suturée, et les souris ont été laissées en récupération sur un tapis chauffant en postopératoire. Les souris témoins ont reçu quotidiennement un volume équivalent de solution saline par gavage et par injection.

10. Évaluation de la fertilité
Après l'achèvement de l'administration du médicament, les souris mâles de chaque groupe ont été accouplées librement avec des souris femelles BALB/c selon un ratio de 1:2 pendant 7 jours. La formation du bouchon vaginal chez les souris femelles a été surveillée et enregistrée quotidiennement. Une fois l'accouplement confirmé, les souris mâles ont été retirées, et les souris femelles ont été logées individuellement jusqu'à l'accouchement naturel. Neuf souris femelles gestantes par groupe ont été obtenues et incluses dans l'analyse. La taille moyenne de la portée a été notée afin d'évaluer la fertilité masculine dans chaque groupe.

À la fin de la période expérimentale, les souris ont été euthanasiées par administration intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 100 mg/kg. Cette méthode d’euthanasie a été approuvée par le Comité d'éthique animale de l'Université du Sud-Est (numéro d'approbation : 20230216022). Les testicules et les épididymes ont été soigneusement séparés, photographiés puis pesés. Les indices testiculaire et épididymaire ont été calculés selon la formule : masse de l'organe / masse du corps. Un épididyme provenant de chaque souris a été prélevé, coupé en morceaux, placé dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate préchauffée (37 °C) et incubé pendant 20 minutes afin de permettre aux spermatozoïdes de s'extraire29. La suspension de spermatozoïdes a été doucement homogénéisée, et 10 µL de cette suspension ont été déposés sur une lame de comptage des cellules sanguines préalablement chauffée. Le dénombrement des spermatozoïdes a été effectué manuellement au microscope optique avec un grossissement de 200×, et les résultats ont été exprimés en 106/L. Par ailleurs, le pourcentage de spermatozoïdes mobiles progressifs par rapport au nombre total de spermatozoïdes a été calculé pour évaluer la mobilité des spermatozoïdes13.

11. Détermination des taux d'hormones sexuelles
Du sang a été prélevé de la veine orbitaire de souris de chaque groupe et laissé reposer à 25 °C pendant 30 min. Le sérum a été recueilli par centrifugation à 3 000 × g pendant 10 min30. Les taux sériques de testostérone, d'hormone lutéinisante (LH) et d'hormone folliculo-stimulante (FSH) ont été mesurés à l'aide des kits correspondants de dosage immuno-enzymatique (ELISA).

12. Essai de stabilité de l'ARN
Les cellules GC-1 ont été semées dans des plaques de culture en 96 puits, transfectées avec un si-QKI-5 ou un si-NC, puis cultivées pendant 48 h. La dactinomycine a ensuite été ajoutée à 5 µg/mL, et les cellules ont été récoltées à 0, 3, 6 et 9 h. L'ARN total a été isolé, et le niveau d'expression relative de l'ARN long non codant NONMMUT031883.2 a été déterminé par réaction de transcription inverse quantitative suivie d'une réaction en chaîne par polymérase. Le niveau relatif d'ARN à chaque point de prélèvement a été calculé en prenant comme référence le niveau d'expression à 0 h fixé à 100 %.

13. Réaction de transcription inverse quantitative en chaîne par polymérase
Les cellules GC-1 et les tissus testiculaires de souris ont été rincés avec du tampon salin phosphate et lysés pour l'isolement de l'ARN total. L'ADN complémentaire a été synthétisé par transcription inverse à l'aide de la transcriptase inverse AMV. L'amplification par réaction en chaîne par polymérase a été réalisée à l'aide d'un système de PCR en temps réel et d'un kit de PCR quantitative, l'ADN complémentaire servant de matrice d'amplification. L'ARN U6 a été utilisé comme référence interne pour l'ARNl NONMMUT031883.2, et GAPDH a été utilisé comme référence interne pour référence interne pour QKI-5. L'expression relative du gène cible a été calculée en utilisant le 2−ΔΔCt méthode25L'ARN a également été isolé séparément à partir des fractions cytoplasmique et nucléaire afin de déterminer la localisation subcellulaire de l'ARNnl NONMMUT031883.2. Les séquences des amorces sont fournies dans Tableau 1.

GèneAmorce directe (5' à 3')Amorce inverse (5' à 3')
QKI-5CTGTCATGCCAAACGGAACGATGGACACGCATATCGTG
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
lncRNA NONMMUT031883.2CCACTGTGGCACATTGAAGTATTAAGTTAATGGGTGCTGTGTT
U6 RNACTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT

Tableau 1 : Séquences des amorces utilisées pour la réaction de transcription inverse quantitative en chaîne par polymérase. Les séquences des amorces sens et antisens sont indiquées dans le sens 5′–3′ pour l'ARNl NONMMUT031883.2, QKI-5, U6 et GAPDH.

14. Coloration par l'hématoxyline et l'éosine
Les tissus testiculaires et épididymaires de souris ont été immergés dans du paraformaldéhyde à 4 % et fixés à 4 °C pendant 24 h. Après un rinçage au tampon phosphate salin, les tissus ont été déshydratés à l'aide d'une série d'éthanol à concentration croissante, inclus dans la paraffine et coupés en sections de 5 µm. Les sections ont été chauffées à 60 °C pendant 60 min, puis déparaffinées dans le xylène pendant 30 min.

Après une réhydratation dans une série d'éthanol graduée, les sections ont été colorées à l'hématoxyline pendant 5 min, traitées avec une solution de différenciation à l'acide chlorhydrique-éthanol pendant 10 s, rincées à l'eau du robinet pour la coloration bleue, puis colorées à l'éosine 1 % pendant 2 min. Les sections ont ensuite été déshydratées dans de l'éthanol à 95 % et de l'éthanol absolu, puis clarifiées dans le xylène pendant 30 min. Après séchage à l'air, les sections ont été montées avec de la gomme neutre. Les modifications morphologiques des testicules et des épididymes ont été observées au microscope.

15. Immunofluorescence
Des coupes paraffines de testicules de souris ont été déparaffinées et réhydratées à l’aide d’une série d’éthanol à concentration décroissante, suivies d’une récupération des antigènes par micro-ondes dans un tampon citrate à pH 6,0. Après refroidissement naturel à température ambiante, les coupes ont été incubées avec du Triton X-100 à 0,3 % pendant 10 min. Les coupes ont été bloquées avec 5 % d’albumine de sérum bovin à 25 °C pendant 60 min, rincées au tampon phosphate salin, puis incubées toute la nuit à 4 °C avec un anticorps primaire dirigé contre Ki67. Le jour suivant, un anticorps secondaire immunoglobuline G marqué avec un fluorochrome a été appliqué, et les coupes ont été incubées à 37 °C à l’abri de la lumière pendant 60 min. Après un rinçage au tampon phosphate salin, les coupes ont été contre-colorées avec du DAPI pendant 10 min et observées au microscope à fluorescence. L’intensité de fluorescence a été analysée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image.

Pour la coloration en immunofluorescence des cellules GC-1, les cellules ont été ensemencées dans des plaques de 12 puits à raison de 1 × 105 cellules/puits et incubées pendant 24 h. Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 min, perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,3 % pendant 10 min, bloquées avec de l'albumine sérique bovine à 5 %, puis incubées toute la nuit à 4 °C avec un anticorps primaire dirigé contre QKI-5. Le reste de la procédure a été réalisé comme décrit pour les sections de tissu testiculaire.

16. Coloration TUNEL
Des coupes paraffines de testicules de souris ont été déparaffinées, réhydratées à l'aide d'une série d'éthanol à concentration décroissante, puis incubées avec du Triton X-100 à 0,1 % pendant 5 min afin d'augmenter la perméabilité de la membrane cellulaire. Une solution working de protéinase K à 20 µg/mL, sans DNase, a été appliquée uniformément sur les coupes, qui ont ensuite été incubées à 37 °C pendant 15 min. La solution de détection TUNEL a été ajoutée, et les coupes ont été incubées à 37 °C à l'abri de la lumière pendant 90 min. Après une incubation avec le DAPI pendant 10 min, un milieu de montage antifade a été appliqué, et le tissu testiculaire a été observé au microscope à fluorescence.

Les cellules GC-1 ont été ensemencées dans des plaques de 12 puits et fixées avec du paraformaldéhyde 4 % pendant 30 min. Après perméabilisation avec du Triton X-100 0,1 % pendant 5 min, une solution de détection TUNEL a été appliquée aux cellules, suivie d'une incubation à l'obscurité pendant 60 min. Les cellules ont ensuite été colorées avec du DAPI pendant 10 min et observées au microscope à fluorescence.

17. Immunotransfert (Western blotting)
Les tissus testiculaires de souris et les cellules GC-1 ont été lysés dans un tampon de lyse cellulaire pour immunoprécipitation sur de la glace pendant 30 min et soumis à une ultrasonication. Après centrifugation, le surnageant contenant les protéines a été récupéré et la concentration en protéines a été déterminée à l’aide d’un kit d’analyse par acide bichinconinique. Le surnageant protéique a été mélangé avec du tampon de charge SDS et chauffé dans de l’eau bouillante pendant 10 min. Après séparation par électrophorèse sur gel, les protéines ont été transférées sur des membranes de fluorure de polyvinylidène et bloquées avec 5 % d’albumine sérique bovine pendant 2 h31.

Les membranes ont été incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires dirigés contre la caspase-3 clivée (1:500), la Bcl-2 (1:1000), la caspase-3 (1:2000), la Bax (1:500), la QKI-5 (1:1000), la p38 phosphorylée (1:1000) ou la p38 (1:500). Le jour suivant, les membranes ont été rincées avec une solution saline tamponnée au Tris contenant du Tween 20 et incubées avec une immunoglobuline G de chèvre anti-lapin à une dilution de 1:10000 pendant 2 h à 25 °C. La solution de travail de chimiluminescence amplifiée a été appliquée sur la surface des membranes, et les bandes protéiques ont été visualisées à l’aide d’un système d’imagerie de gels. L’intensité des bandes a été analysée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image, et l’expression protéique relative a été normalisée par rapport à la GAPDH (1:3000).

La cycloheximide à 50 µg/mL a été utilisée pour inhiber la synthèse protéique. Afin de déterminer la demi-vie de QKI-5, les cellules ont été récoltées à 0, 3, 6 et 9 h, et les niveaux protéiques de QKI-5 ont ensuite été déterminés par immunobuvardage25.

18. Analyse statistique
Toutes les données ont été analysées statistiquement et représentées à l'aide de logiciels statistiques, de graphiques et d'analyse d'images. Le test de Shapiro-Wilk a été utilisé pour évaluer la normalité des données. Les données expérimentales sont présentées sous la forme moyenne ± écart-type. Une analyse de variance à un facteur a été utilisée pour évaluer les différences entre les groupes. Le test t de LSD a été utilisé pour des comparaisons par paires post hoc lorsque les variances étaient homogènes, tandis que le test de Dunnett T3 a été utilisé lorsque les variances étaient hétérogènes. Une valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Résultats

L'inhibition de l'ARNl NONMMUT031883.2 induit l'apoptose des spermatogonies
Les cellules GC-1 ont été transfectées avec un ARNsh ciblant l'ARNl afin d'inhiber l'expression de l'ARNl NONMMUT031883.2. Par rapport aux cellules transfectées avec l'ARNsh de contrôle (sh-NC), le niveau transcriptionnel de l'ARNl NONMMUT031883.2 a été nettement réduit après la transfection avec l'ARNsh ciblant l'ARNl, confirmant ainsi une inhibition efficace (Figure 2A). Après l'inhibition de l'ARNl NONMMUT031883.2, la viabilité des cellules GC-1 a été significativement diminuée (Figure 2B), tandis que la libération de LDH a été significativement augmentée, indiquant un dommage cellulaire accru (Figure 2C). La coloration au calcein-AM/PI a révélé un nombre accru de cellules GC-1 positives au PI et une proportion réduite de cellules survivantes dans le groupe sh-ARNl (Figure 2D, E). Le taux d'apoptose des cellules GC-1 a été nettement augmenté suite à l'inhibition de l'ARNl NONMMUT031883.2 (Figure 2F, G). Le taux de cellules positives à l'essai TUNEL a également été significativement élevé dans le groupe sh-ARNl, confirmant davantage l'augmentation de l'apoptose (Figure 2H, I). De plus, l'inhibition de l'ARNl NONMMUT031883.2 a significativement augmenté l'activité de la caspase-3 dans les cellules GC-1 (Figure 2J). Dans le groupe sh-ARNl, l'expression de Bax a été nettement augmentée, celle de Bcl-2 a été réduite, et le ratio caspase-3 clivée/caspase-3 a été significativement accru (Figure 2K, L). Ces résultats indiquent que l'inhibition de l'ARNl NONMMUT031883.2 induit l'apoptose des cellules GC-1. Toutes les données quantifiées ont été obtenues avec n = 6.

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Figure 2 : L'extinction de l'ARNl NONMMUT031883,2 induit l'apoptose des spermatogonies. (A) Analyse par réaction de transcription inverse quantitative en chaîne par polymérase (qRT-PCR) de l'expression de l'ARNl NONMMUT031883,2 dans les cellules GC-1. (B) Essai Cell Counting Kit-8 (CCK-8) de la viabilité des cellules GC-1 après extinction de l'ARNl NONMMUT031883,2. (C) Libération de la lactate déshydrogénase (LDH) par les cellules GC-1 après extinction de l'ARNl NONMMUT031883,2. (D, E) Coloration par calceine-AM/iodure de propidium (IP) de la survie des cellules GC-1 (20× ; échelle, 100 µm). (F, G) Analyse par cytométrie en flux de l'apoptose après extinction de l'ARNl NONMMUT031883,2. (H, I) Analyse par marquage TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling) des cellules GC-1 (40× ; échelle, 50 µm). (J) Activité de la caspase-3 après extinction de l'ARNl NONMMUT031883,2. (K, L) Analyse par immunobuvardage (Western blot) de l'expression de Bcl-2, Bax, caspase-3 et caspase-3 clivée après transfection par sh-ARNl. Les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type ; n = 6. ***p < 0,001 par rapport à sh-NC. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

L'ARNl NONMMUT031883.2 interagit avec QKI-5
L'interaction entre l'ARNl NONMMUT031883.2 et QKI-5 a été étudiée afin d'élucider le mécanisme moléculaire sous-jacent à l'apoptose des spermatogonies. Après séparation des fractions nucléaire et cytoplasmique, une analyse par qRT-PCR a montré que l'ARNl NONMMUT031883.2 était principalement localisé dans le noyau des cellules GC-1 (Figure 3A). Une analyse par immunofluorescence a révélé que QKI-5 était également concentré dans le noyau, fournissant ainsi une base spatiale à l'interaction entre l'ARNl NONMMUT031883.2 et QKI-5 (Figure 3B). La demi-vie de l'ARNl NONMMUT031883.2 a été mesurée après traitement à l'actinomycine D afin d'évaluer si QKI-5 régulait la stabilité de cet ARNl. L'invalidation de QKI-5 n'a eu aucun effet notable sur la demi-vie du transcrit d'ARNl (Figure 3C). Après inhibition de la synthèse protéique par le cycloheximide, l'invalidation de l'ARNl NONMMUT031883.2 n'a pas modifié l'expression protéique de QKI-5 (Figure 3D, E). L'efficacité de capture de la sonde antisense marquée à la biotine ciblant l'ARNl NONMMUT031883.2 a ensuite été évaluée par qRT-PCR. La sonde antisense a enrichi efficacement l'ARNl cible et a donc été utilisée pour le test de précipitation d'ARN ultérieur (Figure 3F). La précipitation d'ARN suivie d'un immunoblotting a révélé une interaction physique spécifique entre l'ARNl NONMMUT031883.2 et QKI-5 (Figure 3G, H). Ces résultats indiquent que l'ARNl NONMMUT031883.2 et QKI-5 sont colocalisés dans le noyau des cellules GC-1 et interagissent spécifiquement. Les données quantitatives des Figure 3C et Figure 3D, F ont été obtenues avec n = 3, et le reste des données quantitatives a été obtenu avec n = 6.

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Figure 3 : Le lncARN NONMMUT031883.2 interagit avec QKI-5. (A) Analyse par qRT-PCR de la distribution nucléaire et cytoplasmique du lncARN NONMMUT031883.2 dans les cellules GC-1. (B) Analyse par immunofluorescence de la localisation subcellulaire de QKI-5 dans les cellules GC-1 (40× ; échelle, 50 µm). (C) Analyse par qRT-PCR de la demi-vie du lncARN NONMMUT031883.2 après traitement à l'actinomycine D et inhibition de QKI-5 (n = 3). (D, E) Analyse par immunobuvardage de l'expression protéique de QKI-5 après traitement à la cycloheximide et inhibition du lncARN NONMMUT031883.2 (n = 3). (F) Validation par qRT-PCR de l'efficacité d'enrichissement de la sonde antisense marquée à la biotine ciblant le lncARN NONMMUT031883.2. (G, H) Analyse par capture d'ARN et immunobuvardage de l'interaction entre le lncARN NONMMUT031883.2 et QKI-5. Les données sont exprimées comme moyenne ± écart type ; n = 6. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

L'inhibition de QKI-5 réduit l'apoptose des spermatogonies en supprimant la voie de signalisation p38 MAPK
Le rôle de QKI-5 et de la voie p38 MAPK en aval dans l'apoptose des spermatogonies a été examiné. Après transfection avec le si-QKI-5, les niveaux protéiques de QKI-5 ont été significativement réduits dans les cellules GC-1, confirmant une inhibition efficace (Figure 4A, B). L'inhibition de l'ARNl NONMMUT031883.2 a augmenté de manière significative le rapport p-p38/p38, tandis que l'inhibition simultanée de QKI-5 a diminué ce rapport, indiquant une inhibition de l'activation de la voie p38 MAPK (Figure 4C, D). L'inhibition de QKI-5 a atténué les dommages causés aux cellules GC-1 par l'inhibition de l'ARNl NONMMUT031883.2, alors que le traitement avec l'inducteur d'apoptose étoposide a fortement réduit la viabilité cellulaire (Figure 4E). L'inhibition de QKI-5 a significativement réduit le taux d'apoptose des cellules GC-1, tandis que le traitement par l'étoposide a fortement augmenté l'apoptose (Figure 4F, G). La transfection avec le si-QKI-5 a également significativement réduit l'activité de la caspase-3, alors que le traitement par l'étoposide a augmenté cette activité (Figure 4H). L'inhibition de QKI-5 a diminué l'expression de Bax, augmenté l'expression de Bcl-2 et significativement réduit le rapport caspase-3 clivée/caspase-3, tandis que le traitement par l'étoposide a inversé ces profils d'expression (Figure 4I, J). Ces résultats indiquent que l'inhibition de QKI-5 supprime l'apoptose dans les spermatogonies GC-1 en bloquant la voie de signalisation p38 MAPK. Toutes les données quantifiées ont été obtenues avec n = 6.

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Figure 4 : La diminution de QKI-5 inhibe l'apoptose des spermatogonies en supprimant la voie de signalisation p38 MAPK. (A, B) Analyse par immunobuvardage de l'expression de QKI-5 dans les cellules GC-1 après transfection avec si-NC ou si-QKI-5. (C, D) Analyse par immunobuvardage de l'expression de p38 phosphorylée (p-p38) et de la p38 totale. (E) Analyse de viabilité cellulaire par CCK-8 dans les différents groupes de traitement. (F, G) Analyse par cytométrie en flux de l'apoptose après traitement par l'étoposide. (H) Activité de la caspase-3 dans les différents groupes de traitement. (I, J) Analyse par immunobuvardage de l'expression de Bax, Bcl-2, caspase-3 et caspase-3 clivée dans les cellules GC-1. Les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type ; n = 6. ***p < 0,001 par rapport à si-NC ou sh-NC ; ###p < 0,001 par rapport à sh-lncRNA ; &&&p < 0,001 par rapport à sh-lncRNA + si-QKI-5. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

YC inhibe l'apoptose des spermatogonies via la voie NONMMUT031883.2 ARNl/p38 MAPK/QKI-5
Après traitement des cellules GC-1 avec un sérum contenant du YC pendant 6, 12 et 24 h, la viabilité cellulaire a augmenté progressivement en fonction des concentrations croissantes de YC et des durées d'exposition prolongées. Ces concentrations ont donc été choisies pour les expériences ultérieures, avec une durée de traitement de 24 h.Figure 5A). Le traitement par YC pendant 24 h a fortement augmenté le niveau transcriptionnel de l'ARNl NONMMUT031883.2 dans les cellules GC-1 (Figure 5B) et augmenté sa capacité de liaison à QKI-5 (Figure 5C, D). Après le traitement par YC, l'expression de QKI-5 et le ratio p-p38/p38 ont été nettement réduits dans les cellules GC-1, suggérant une inhibition de la voie p38 MAPK (Figure 5E, F). Le traitement par YC a également nettement réduit le taux d'apoptose (Figure 5G, H), activité réduite de la caspase-3 (Figure 5I), une augmentation de l'expression de Bcl-2, et une diminution de l'expression de Bax ainsi que du ratio caspase-3 clivée/caspase-3 (Figure 5J, K).

Pour évaluer davantage la spécificité de la voie, les cellules GC-1 ont été transfectées avec OE-NC ou OE-QKI-5. L'expression protéique de QKI-5 a été significativement augmentée dans les cellules transfectées avec OE-QKI-5, confirmant une surexpression réussie (Figure 5L, M). L'extinction de l'ARNl NONMMUT031883.2 a réduit de manière significative la viabilité cellulaire, effet inversé par le traitement au YC. La surexpression de QKI-5 a atténué l'effet cytoprotecteur du YC (Figure 5N). Le traitement au YC a également réduit l'apoptose induite par l'extinction de l'ARNl NONMMUT031883.2 (Figure 5O, P), diminué l'activité de la caspase-3 (Figure 5Q), réduit l'expression de Bax, augmenté celle de Bcl-2 et diminué le ratio caspase-3 clivée/caspase-3 (Figure 5R, S). En revanche, la surexpression de QKI-5 a atténué les effets anti-apoptotiques du YC. Ces résultats indiquent que le YC régule à la hausse l'ARNl NONMMUT031883.2 et favorise sa liaison à QKI-5, inhibant ainsi la voie p38 MAPK et supprimant l'apoptose dans les cellules GC-1. Toutes les données quantifiées ont été obtenues avec n = 6.

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Figure 5: YC inhibe l'apoptose des spermatogonies via la voie de l'ARNl NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK. (A) Analyse de la viabilité des cellules GC-1 par CCK-8 après exposition à un sérum contenant la capsule Yangjing (YC) pendant 6, 12 et 24 h. (B) Analyse par qRT-PCR de l'expression de l'ARNl NONMMUT031883.2 dans les cellules GC-1 après 24 h de traitement par YC. (C, D) Analyse par captage d'ARN de la liaison de l'ARNl NONMMUT031883.2 à QKI-5 après traitement par YC. (E, F) Analyse par immunobuvardage de l'expression de QKI-5, p-p38 et p38 après traitement au YC. (G, H) Analyse par cytométrie en flux de l'apoptose des cellules GC-1 après traitement au YC. (I) Activité de la caspase-3 après traitement par YC. (J, K) Analyse par immunobuvardage de l'expression de Bcl-2, Bax, de la caspase-3 et de la caspase-3 clivée après traitement au YC. (L, M) Analyse par immunobuvardage de l'expression de QKI-5 après transfection avec OE-NC ou OE-QKI-5. (N) Analyse de la viabilité des cellules GC-1 par CCK-8 (O, P) Analyse cytométrique de l'apoptose dans les cellules GC-1 après la surexpression de QKI-5. (Q) Activité de la caspase-3 suite à la surexpression de QKI-5. (R, S) Analyse par immunotransfert de l'expression de Bax, Bcl-2, de la caspase-3 et de la caspase-3 clivée suite à la surexpression de QKI-5. Les données sont présentées comme la moyenne ± écart type ; n = 6. ***p < 0,001 par rapport au témoin ; ###p < 0,001 versus sh-lncARN ; &&&p < 0,001 versus AR-lncRNA + H-YC + OE-NC. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Le YC améliore les troubles de la spermatogenèse induits par le CP chez la souris
Les effets protecteurs du YC ont été évalués chez des souris présentant un trouble de la spermatogenèse. Les testicules et les épididymes des souris du groupe CP présentaient une atrophie marquée, un volume réduit et un aspect terne. Après traitement avec différentes doses de YC, la morphologie, le volume et la couleur des organes reproducteurs se sont progressivement améliorés (Figure 6A). Les poids relatifs des testicules et des épididymes ont augmenté de manière significative, l'effet le plus important étant observé dans le groupe traité avec 800 mg/kg de YC (Figure 6B, C).

Le taux de déformité des spermatozoïdes a été significativement augmenté dans le groupe CP, avec des anomalies fréquentes incluant une distorsion de la tête, un enroulement de la queue et des lésions structurelles. Le nombre de spermatozoïdes et leur mobilité ont également été nettement réduits. Après traitement par YC, la morphologie des spermatozoïdes s'est améliorée (Figure 6D), le nombre de spermatozoïdes a augmenté (Figure 6E) et leur mobilité a été significativement améliorée (Figure 6F). Des expériences d'accouplement ont montré que la fertilité et la taille des portées étaient nettement réduites dans le groupe CP, tandis que le traitement par YC a amélioré la fertilité (Figure 6G). Les taux sériques de testostérone, d'hormone folliculo-stimulante et d'hormone lutéinisante étaient également nettement réduits dans le groupe CP et ont augmenté après le traitement par YC (Figure 6H-J). Ces résultats indiquent que YC améliore l'atrophie des organes reproducteurs, la qualité des spermatozoïdes, la fertilité et la sécrétion des hormones sexuelles chez les souris présentant un dysfonctionnement de la spermatogenèse. Les données quantitatives de la Figure 6G ont été obtenues avec n = 9, et le reste des données quantitatives a été obtenu avec n = 6.

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Figure 6 : YC améliore les troubles de la spermatogenèse induits par le CP chez la souris. (A-C) Morphologie des organes reproducteurs chez les groupes témoins, traités au cyclophosphamide (CP) et traités au YC (A), indice testiculaire (B) et indice épididymaire (C). (D-F) Morphologie des spermatozoïdes (D) (40× ; échelle, 50 µm), densité des spermatozoïdes (E) et mobilité des spermatozoïdes (F). (G) Fertilité masculine évaluée par des expériences d'accouplement (n = 9). (H-J) Niveaux sériques d'hormone folliculo-stimulante (FSH), de testostérone et d'hormone lutéinisante (LH), mesurés à l'aide de kits de dosage immunoenzymatique par lien avec une enzyme. Les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type ; n = 6. ***p < 0,001 par rapport au témoin ; #p < 0,05, ##p < 0,01 et ###p < 0,001 par rapport au CP. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Le YC améliore les lésions histopathologiques testiculaires chez les souris présentant un dysfonctionnement de la spermatogenèse
L'effet réparateur du YC sur les lésions des tissus testiculaires a été évalué par coloration histologique. La coloration à l'hématoxyline et à l'éosine a révélé une structure tissulaire intacte, des couches cellulaires bien définies et un nombre adéquat de cellules dans le groupe témoin. En revanche, le groupe CP présentait une atrophie marquée des tubules séminifères et une désorganisation structurelle, un nombre réduit de cellules et un effondrement de la lumière de l'épididyme. Après traitement au YC, les lésions testiculaires et épididymaires ont été atténuées, la structure des tubules séminifères s'est progressivement restaurée, et les cellules sont devenues plus ordonnées et ont augmenté en nombre (Figure 7A, B).

La proportion de cellules positives au TUNEL dans le tissu testiculaire était significativement augmentée dans le groupe CP et significativement réduite après le traitement par YC (Figure 7C, D). L'expression de Bax et le rapport caspase-3 clivée/caspase-3 étaient nettement augmentés dans le groupe CP, tandis que l'expression de Bcl-2 était réduite. Le traitement par YC inversait ces profils d'expression (Figure 7E, F). Une analyse par immunofluorescence a montré que l'intensité de fluorescence de Ki67 était fortement réduite dans le groupe CP et significativement augmentée après le traitement par YC, suggérant une restauration de la prolifération des cellules spermatogéniques (Figure 7G, H). Ces résultats suggèrent que le YC réduit les lésions histopathologiques induites par le CP dans les testicules et les épididymes, inhibe l'apoptose excessive et favorise la prolifération des cellules spermatogéniques. Toutes les données quantifiées ont été obtenues avec n = 6.

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Figure 7 : YC améliore les lésions histopathologiques induites par le CP dans le tissu testiculaire de souris. (A, B) Coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (HE) des testicules (A) et des épididymes (B) après traitement par YC (20× ; échelle, 100 µm). (C, D) Analyse TUNEL de l'apoptose dans le tissu testiculaire de souris (40× ; échelle, 50 µm). (E, F) Analyse par immunobuvardage de l'expression de Bax, Bcl-2, de la caspase-3 et de la caspase-3 clivée dans le tissu testiculaire après traitement par YC. (G, H) Analyse en immunofluorescence de l'expression de Ki67 dans le tissu testiculaire de souris (40× ; échelle, 50 µm). Les données sont exprimées comme moyenne ± écart type ; n = 6. ***p < 0,001 par rapport au témoin ; p < 0,001 par rapport au CP. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

YC améliore la dysfonction spermatogénique et les lésions pathologiques testiculaires chez la souris via la voie de l'ARNl NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK
L'implication de la voie de l'ARNl NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK dans les effets du YC a été davantage évaluée. L'expression de l'ARNl NONMMUT031883.2 était significativement réduite dans le tissu testiculaire des souris du groupe CP, tandis que l'expression de QKI-5 et le rapport p-p38/p38 étaient nettement augmentés (Figure 8A-D). Après traitement au YC, l'expression de l'ARNl NONMMUT031883.2 augmentait, tandis que l'expression de QKI-5 et le rapport p-p38/p38 diminuaient.

Afin d'évaluer davantage la spécificité de la voie, l'ARNl NONMMUT031883.2 a été inhibé chez la souris à l'aide d'un ARNsh ciblant l'ARNl. Le niveau d'expression de l'ARNl NONMMUT031883.2 a été significativement réduit, confirmant une inhibition efficace (Figure 8E). Après l'inhibition de l'ARNl NONMMUT031883.2, le niveau de QKI-5 dans le tissu testiculaire n'a pas changé de manière significative, mais le rapport p-p38/p38 a augmenté significativement (Figure 8F, G). Le traitement par ARNsh a atténué les effets de YC à 800 mg/kg, entraînant une diminution de l'expression de l'ARNl NONMMUT031883.2 dans le tissu testiculaire (Figure 8H) et une augmentation des niveaux de p-p38/p38 (Figure 8I, J). Le traitement par YC a significativement augmenté le nombre et la mobilité des spermatozoïdes après l'induction par CP, tandis que l'inhibition de l'ARNl NONMMUT031883.2 a atténué ces effets (Figure 8K, L). Le traitement par YC a également augmenté les niveaux de testostérone, d'hormone folliculo-stimulante et d'hormone lutéinisante dans le groupe CP, alors que l'inhibition de l'ARNl a atténué ces effets (Figure 8M-O).

La coloration à l'hématoxyline et à l'éosine a montré que le YC améliorait les lésions testiculaires induites par le CP, notamment l'atrophie des tubules séminifères et le désordre de l'arrangement des cellules spermatogéniques. L'extinction de l'ARNl NONMMUT031883.2 a atténué ces effets protecteurs (Figure 8P). Après traitement par le YC, l'expression de Bax ainsi que le rapport caspase-3 clivée/caspase-3 étaient réduits, tandis que l'expression de Bcl-2 était augmentée. L'extinction de l'ARNl NONMMUT031883.2 a inversé ces effets sur les protéines liées à l'apoptose (Figure 8Q, R). Ces résultats indiquent que le YC améliore la qualité du sperme et réduit les lésions des tissus testiculaires après induction par le CP en régulant à la hausse l'ARNl NONMMUT031883.2, en régulant à la baisse QKI-5 et en inhibant la voie p38 MAPK. Toutes les données quantifiées ont été obtenues avec n = 6.

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Figure 8: YC améliore la spermatogenèse et réduit les lésions histopathologiques testiculaires via la voie de signalisation de l'ARN long non codant NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK. (A) Analyse par qRT-PCR de l'expression de l'ARNl NONMMUT031883.2 dans le tissu testiculaire de souris. (B-D) Analyse par immunotransfert de l'expression de QKI-5, p-p38 et p38 dans le tissu testiculaire de souris après traitement par YC. (E) Validation par RT-qPCR de l'invalidation de l'ARNl NONMMUT031883.2 dans le tissu testiculaire de souris après administration de sh-ARNl (F, G) Analyse par immunoblot de Western des niveaux de QKI-5 et de p-p38/p38 dans le tissu testiculaire de souris après abolition de l'ARNnl NONMMUT031883.2. (H) Analyse par qRT-PCR de l'expression de l'ARNl NONMMUT031883.2 dans le tissu testiculaire de souris après traitement au YC et administration de sh-ARNl. (I, J) Analyse par immunotransfert de l'expression de p-p38 et de p38 dans le tissu testiculaire de souris. (K, L) Nombre de spermatozoïdes (Ket la mobilité des spermatozoïdes (L) dans les différents groupes de traitement. (M-O) Les concentrations sériques de FSH, de testostérone et de LH ont été mesurées à l'aide de kits de dosage immunoenzymatique (ELISA). (P) Coloration H-E du tissu testiculaire chez des souris traitées au CP (20×; barre d'échelle, 100 µm). (Q, R) Analyse par immunobuvardage de l'expression de Bcl-2, Bax, de la caspase-3 clivée et de la caspase-3 dans le tissu testiculaire de souris. Les données sont présentées comme la moyenne ± écart type ; n = 6. ***p < 0,001 par rapport au témoin ; p < 0,001 par rapport à CP ; p < 0,001 contre 800 mg/kg YC + sh-NC. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Disponibilité des données :
Les données brutes appuyant les résultats de cette étude sont fournies en tant que Fichier supplémentaire 1.

Fichier supplémentaire 1 : Données brutes. Ce fichier Excel contient les données numériques brutes à la base des analyses quantitatives présentées dans les Figures 2–8. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le dysfonctionnement acquis de la spermatogenèse induit par la chimiothérapie est une cause importante d'infertilité masculine32,33,34. Toutefois, les mécanismes moléculaires spécifiques restent incomplètement compris. Les résultats de cette étude montrent que la capsule Yangjing (YC) améliore de manière dépendante de la dose les anomalies des hormones sexuelles, les lésions histopathologiques testiculaires et l'altération de la fertilité induites par la cyclophosphamide (CP) chez la souris mâle. Ces améliorations étaient associées à la surexpression de l'ARNl NONMMUT031883.2 et à l'inhibition de la voie QKI-5/p38 MAPK, suggérant que la YC pourrait agir via cet axe pour réduire l'apoptose anormale des spermatogonies.

La toxicité reproductive du CP a été largement documentée. Son métabolite, l'acroléine, peut s'accumuler dans le tissu testiculaire et induire l'apoptose des cellules germinales par stress oxydatif, dommages de l'ADN et d'autres voies. Les spermatogonies, en tant que cellules initiatrices de la spermatogenèse, sont particulièrement sensibles aux effets cytotoxiques du CP35,36. Cao et al. ont constaté que la signalisation du point de contrôle des dommages de l'ADN était significativement enrichie dans le tissu testiculaire de patients atteints d'azoospermie après une chimiothérapie au CP, tandis que les gènes associés au développement des spermatozoïdes étaient fortement sous-régulés et l'intégrité structurelle des tubules séminifères était perturbée37. La protéine Bcl-2 est une protéine anti-apoptotique qui agit en maintenant l'intégrité de la membrane mitochondriale38. Bax est une protéine pro-apoptotique, et sa surexpression peut favoriser la libération du cytochrome c des mitochondries vers le cytoplasme, activer la cascade des caspases et induire l'apoptose39,40. Saleh et al. ont démontré qu'une exposition au CP provoquait une atrophie des tubules séminifères et un œdème interstitiel chez la souris, accompagnées d'une sous-régulation de Bcl-2 et d'une surexpression de Bax, entraînant finalement une diminution du nombre et de la mobilité des spermatozoïdes41. Par conséquent, l'inhibition de l'apoptose excessive des spermatogonies induite par le CP pourrait représenter une cible importante pour la protection de la fonction reproductive après une chimiothérapie. Dans la présente étude, une intervention par YC a réduit de manière dépendante de la dose les anomalies de la sécrétion des hormones sexuelles sériques induites par le CP, réparé les lésions des tubules séminifères et amélioré la mobilité des spermatozoïdes ainsi que la fertilité masculine. Le YC a également augmenté l'expression de Bcl-2, diminué l'expression de Bax, le rapport clivé caspase-3/caspase-3 et le nombre de cellules positives au TUNEL dans le tissu testiculaire. In vitro, un sérum contenant du YC a fortement réduit l'apoptose des cellules GC-1 et augmenté la viabilité cellulaire, renforçant ainsi l'effet inhibiteur sur l'apoptose des spermatogonies.

Les ARN non codants longs (lncARN) jouent des rôles régulateurs importants dans les processus physiologiques et pathologiques, notamment la spermatogenèse et l'apoptose des cellules germinales42,43. Une expression anormale des lncARN peut altérer la fonction spermatogénique testiculaire en régulant le stress oxydatif et les voies apoptotiques, ce qui constitue un mécanisme moléculaire clé de l'infertilité masculine44. Wang et al. ont montré que le lncARN DNM3OS régule l'axe miR-214-5p/E2F2, entraînant une diminution de l'activité des cellules spermatogoniales ainsi qu'une augmentation de l'apoptose et du vieillissement cellulaire, contribuant ainsi à l'azoospermie non obstructive45. Des études antérieures ont également révélé que l'extinction du lncARN NONMMUT074098.2 dans les spermatogonies induit l'apoptose25. Ces travaux indiquent que les lncARN sont des régulateurs essentiels de l'apoptose spermatogoniale et de la spermatogenèse. Dans la présente étude, l'extinction du lncARN NONMMUT031883.2 a induit l'apoptose spermatogoniale. Son expression était significativement réduite dans le tissu testiculaire de souris après l'induction par le CP, tandis qu'une intervention par le YC a partiellement restauré son expression. De plus, l'intervention par le YC a atténué l'apoptose spermatogoniale anormale induite par l'extinction du lncARN NONMMUT031883.2, suggérant que l'effet protecteur du YC pourrait être associé à la régulation de ce lncARN.

QKI-5 est une protéine liant l'ARN appartenant à la famille STAR et participe à plusieurs processus physiologiques et pathologiques en régulant l'épissage, la stabilité et l'efficacité traductionnelle des ARNm cibles46,47. Des recherches antérieures ont établi que QKI-5 est un régulateur important du système reproducteur et que son expression anormale peut favoriser l'apoptose des cellules germinales et altérer la fonction spermatique par activation de la voie p38 MAPK en aval25. Li et al. ont montré qu'inhiber l'activation de la voie p38 MAPK réduisait les lésions tissulaires testiculaires induites par le CP et restaurait la fonction de la barrière hémato-testiculaire chez le rat48. Ces résultats suggèrent que l'axe QKI-5/p38 MAPK pourrait constituer une voie importante régulant l'apoptose des spermatogonies et représenter une cible potentielle pour le traitement des troubles de la spermatogenèse. Dans la présente étude, l'expression de QKI-5 et la phosphorylation de p38 ont été significativement augmentées dans le tissu testiculaire de souris après induction par le CP, tandis qu'une intervention par le YC a réduit l'expression de QKI-5 et l'activation de la voie p38 MAPK. L'ARNl NONMMUT031883.2 s'est lié directement à QKI-5, tandis que l'expression de QKI-5 n'affectait pas la stabilité de cet ARNl, suggérant ainsi qu'il pourrait réguler la fonction de QKI-5 par interaction directe. L'extinction de QKI-5 atténuait les dommages causés aux cellules GC-1 par l'extinction de l'ARNl NONMMUT031883.2, tandis que la surexpression de QKI-5 réduisait les effets protecteurs du YC sur les cellules GC-1. Li et al. ont signalé que l'ARNl NONMMUT074098.2 régule l'apoptose des cellules germinales en se liant à QKI-525. Les résultats actuels montrent que l'ARNl NONMMUT031883.2 se lie également à QKI-5 et est impliqué dans la régulation de l'apoptose des spermatogonies. Dans leur ensemble, ces données suggèrent que le YC pourrait augmenter l'expression de l'ARNl NONMMUT031883.2, inhiber la voie QKI-5/p38 MAPK, réduire l'apoptose anormale des spermatogonies et atténuer les troubles de la spermatogenèse induits par le CP. Cependant, il convient de noter que le YC est une formulation végétale multicomposante qui agit probablement sur plusieurs cibles. D'autres mécanismes, tels que les effets antioxydants directs des composants du YC, la modulation d'autres voies de signalisation ou une régulation épigénétique indépendante de l'axe ARNl-QKI-5, ne peuvent être exclus et pourraient contribuer aux effets protecteurs observés.

Plusieurs limites doivent être reconnues. L'étude a été menée uniquement sur un modèle murin et sur la lignée cellulaire GC-1, sans validation à l'aide d'échantillons cliniques provenant de patients présentant une infertilité. La spermatogenèse est un processus complexe, et le cycle complet de spermatogenèse chez la souris dure environ 35 jours49,50. Le protocole de traitement YC de 30 jours utilisé dans cette étude ne couvre pas un cycle de spermatogenèse complet. Par conséquent, des études futures utilisant des protocoles d'intervention de ≥35 jours sont nécessaires afin d'évaluer systématiquement les effets thérapeutiques du YC sur l'ensemble du cycle de spermatogenèse. De plus, les événements moléculaires précis qui suivent la liaison de l'ARNl NONMMUT031883.2 à QKI-5, tels que les modifications de l'activité d'épissage de QKI-5 et de sa localisation subcellulaire, ainsi que la reconnaissance et la régulation des cibles d'épissage en aval, restent à explorer. En outre, bien que le traitement YC ait augmenté l'expression de l'ARNl NONMMUT031883.2, les facteurs de transcription en amont et les mécanismes épigénétiques restent à élucider. Des études futures intégrant une analyse des promoteurs et des tests de chromatine immunoprécipitée sont nécessaires pour clarifier la base moléculaire de l'induction par le YC de l'expression de l'ARNl NONMMUT031883.2. En outre, des recherches futures devraient évaluer les effets du YC chez des patients souffrant d'infertilité masculine associée à une chimiothérapie et analyser l'expression de l'ARNl NONMMUT031883.2 dans le tissu testiculaire ou le sperme, afin de déterminer sa valeur clinique potentielle comme marqueur diagnostique ou thérapeutique.

En conclusion, le YC régule à la hausse le lncRNA NONMMUT031883.2 et inhibe l'activation de la voie QKI-5/p38 MAPK, réduisant ainsi l'apoptose des spermatogonies et les lésions testiculaires, et atténuant la dysfonction spermatogénique chez la souris. Ces résultats précisent le mécanisme moléculaire sous-jacent aux effets protecteurs du YC contre la dysfonction spermatogénique et élargissent la compréhension actuelle des rôles du lncRNA NONMMUT031883.2 et de la voie QKI-5/p38 MAPK dans la régulation de la spermatogenèse. Le lncRNA NONMMUT031883.2 et le QKI-5 pourraient représenter des cibles thérapeutiques potentielles dans la dysfonction spermatogénique masculine.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d'intérêts financiers ou non financiers.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention no 82374257), le quatrième groupe du programme de formation des talents universitaires de haut niveau de l'hôpital provincial de médecine chinoise du Jiangsu (subvention no k2026yrc74) et les projets de recherche scientifique en médecine traditionnelle chinoise et en médecine intégrée chinoise-occidentale de la province du Jiangsu (subvention no CYTF2026019).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Actinomycine DMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17559Inhibiteur de la transcription utilisé pour les dosages de stabilité de l'ARN
Transcriptase inverse AMVTakara, Tokyo, Japon2621Enzyme pour la synthèse de l'ADN complémentaire
Kit de détection d'annexine V-APC/PIBioLab Technology, Pékin, ChineKFS191Kit pour l'analyse par cytométrie en flux de l'apoptose
Milieu de montage antifadeMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K1042Milieu de montage pour la préservation de la fluorescence
Anticorps primaire BaxAffinity Biosciences, OH, USAAF0120Anticorps primaire pour la détection de Bax
Kit BCAMacklin, Shanghai, ChineB917925Kit pour la détermination de la concentration en protéines
Anticorps primaire Bcl-2Affinity Biosciences, OH, USAAF0769Anticorps primaire pour la détection de Bcl-2
Albumine sérique bovineBioLab Technology, Pékin, ChineBTN131070Réactif de blocage
Kit de détection calceine/PIBeyotime, Shanghai, ChineC2015MKit pour la coloration des cellules vivantes/mortes
Kit de dosage de l'activité de la caspase-3BioLab Technology, Pékin, ChineQN2866Kit pour mesurer l'activité de la caspase-3
Anticorps primaire caspase-3Abcam, MA, USAab184787Anticorps primaire pour la détection de la caspase-3
Réactif CCK-8MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0301Réactif pour l'évaluation de la viabilité cellulaire
Anticorps primaire caspase-3 clivéeAbcam, MA, USAab32042Anticorps primaire pour la détection de la caspase-3 clivée
CycloheximideMacklin, Shanghai, ChineH823111Inhibiteur de la synthèse protéique utilisé pour les dosages de stabilité des protéines
CyclophosphamideMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17420Utilisé pour induire un dysfonctionnement spermatogénique
Réactif DAPIBeyotime, Shanghai, ChineC1006Contre-coloration nucléaire
Milieu DMEMWuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ChineSNLM-302Milieu de culture cellulaire pour les cellules GC-1
Solution de travail ECLSolarbio, Pékin, ChineSW2030Substrat chimiluminescent pour la détection des bandes protéiques
EtoposideMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-13629Agent inducteur de l'apoptose
Cytomètre en fluxBD Biosciences, CA, USABD FACSCaliburInstrument pour l'analyse de l'apoptose
Logiciel FlowJoBD Biosciences, CA, USAv10.8Logiciel pour l'analyse des données de cytométrie en flux
Microscope à fluorescenceLeica, Heidelberg, AllemagneDM3000Instrument pour l'imagerie en fluorescence
Anticorps secondaire IgG marqué par fluorescenceServicebio, Wuhan, ChineGB22303Anticorps secondaire pour la détection en immunofluorescence
Kit ELISA pour l'hormone folliculostimulanteHuamei Biotech, Wuhan, ChineCSB-E06871mKit pour mesurer l'hormone folliculostimulante sérique
Anticorps primaire GAPDHAffinity Biosciences, OH, USAT0004Anticorps de contrôle de chargement pour le Western blot
Cellules GC-1Wuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, ChineSNL-302Ligne cellulaire de spermatogonies murines
Système d'imagerie de gelJinpeng Analysis Instrument, Shanghai, ChineJP-2880Système d'imagerie pour la visualisation des gels et des transferts
Système d'imagerie de gelInvitrogen, Carlsbad, CA, USAiBright CL1500Système d'imagerie par chimiluminescence pour les Western blots
Anticorps secondaire caprin anti-lapin IgGServicebio, Wuhan, ChineGB23303Anticorps secondaire pour le Western blot
Solution d'hématoxylineBioLab Technology, Pékin, ChineYT165Colorant nucléaire pour l'analyse histologique
Solution de différenciation acide chlorhydrique-éthanolBeyotime, Shanghai, ChineC0163SRéactif de différenciation pour la coloration à l'hématoxyline
Logiciel ImageJNational Institutes of Health, USA1.54hLogiciel pour la quantification d'images
Solution de lyse cellulaire pour immunoprécipitation (IP)Beyotime, Shanghai, ChineP0013Solution de lyse pour l'immunoprécipitation et l'extraction protéique
Anticorps primaire Ki67Affinity Biosciences, OH, USAAF0198Anticorps primaire pour la détection de Ki67
Kit de dosage de la cytotoxicité par LDHBeyotime, Shanghai, ChineC0016Kit pour mesurer la libération de la lactate déshydrogénase et les lésions cellulaires
Microscope optiqueOlympus, Tokyo, JaponCKX53Utilisé pour le comptage des spermatozoïdes et l'observation morphologique
Lipofectamine 3000Invitrogen, Carlsbad, CA, USAL3000001Réactif de transfection
Lecteur de microplaquesMolecular Devices, CA, USASpectraMax MiniInstrument pour les mesures d'absorbance
Kit ELISA pour l'hormone lutéinisante murineHuamei Biotech, Wuhan, ChineCSB-E12770mKit pour mesurer l'hormone lutéinisante sérique
Kit ELISA pour la testostérone murineHuamei Biotech, Wuhan, ChineCSB-E05101mKit pour mesurer la testostérone sérique
Gomme neutreBioLab Technology, Pékin, ChineQN1253Milieu de montage pour les sections histologiques
Anticorps primaire p38Affinity Biosciences, OH, USAAF6456Anticorps primaire pour la détection de la p38 totale
ParaformaldéhydeMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-Y0333Fixateur pour cellules et tissus
Kit PARISInvitrogen, Carlsbad, CA, USAAM1921Kit pour la fractionnement de l'ARN nucléaire et cytoplasmique
Système PCRABI, CA, USAABI PRISM 7300Instrument de PCR en temps réel
Anticorps primaire p-p38Affinity Biosciences, OH, USAAF3455Anticorps primaire pour la détection de la p38 phosphorylée
Solution de protéinase KBeyotime, Shanghai, ChineST532Réactif pour la perméabilisation tissulaire avant la coloration TUNEL
Membraanes PVDFMillipore, MA, USAISEQ00010Membraanes pour le transfert protéique en Western blot
Anticorps primaire QKI-5Abcam, MA, USAab126742Anticorps primaire pour la détection de QKI-5
Solution de liaison ARNInvitrogen, Carlsbad, CA, USA65040DSolution pour les réactions de liaison ARN-protéine
Solution de chargement SDSBeyotime, Shanghai, ChineP0286Solution de chargement d'échantillons pour SDS-PAGE
Billes magnétiques streptavidineMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0208Billes magnétiques pour la capture de sondes ARN marquées par biotine
Kit qPCR TB Green FASTTakara, Tokyo, JaponCN830SKit réactif pour la PCR quantitative
Triton X-100Macklin, Shanghai, ChineT824275Réactif de perméabilisation
Réactif TRIzolInvitrogen, Carlsbad, CA, USA15596018CNRéactif pour l'extraction totale d'ARN
Solution de détection TUNELBeyotime, Shanghai, ChineC1086Réactif pour la détection de la fragmentation de l'ADN
XylèneMacklin, Shanghai, ChineX821391Réactif pour l'élimination de la paraffine et la clarification tissulaire

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Mots-clés

BiologyYangjing Capsulesspermatogenic dysfunctionlncRNA NONMMUT031883 2Quaking I 5p38 MAPK pathway

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