Cette étude évalue les effets protecteurs de la capsule Yangjing sur le dysfonctionnement de la spermatogenèse induit par la cyclophosphamide chez la souris et examine le rôle de la voie de signalisation lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.
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Article de recherche
La capsule Yangjing atténue le dysfonctionnement spermatogénique chez la souris en inhibant la voie QKI-5/p38 MAPK via la régulation positive de l'incRNA NONMMUT031883.2
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le dysfonctionnement de la spermatogenèse est une cause importante d'infertilité masculine, et le cyclophosphamide (CP) peut altérer la spermatogenèse en induisant une apoptose anormale des spermatogonies. La capsule Yangjing (YC) est utilisée pour améliorer la fonction reproductive, mais son mécanisme moléculaire sous-jacent reste mal compris. Cette étude a examiné les effets protecteurs de la YC dans un modèle murin de dysfonctionnement de la spermatogenèse induit par le CP et dans des cellules spermatogoniales GC-1. Le nombre et la mobilité des spermatozoïdes, la fertilité masculine, les taux sériques d'hormones sexuelles et les modifications histopathologiques des testicules et des épididymes ont été évalués. La viabilité cellulaire, la libération de lactate déshydrogénase, l'apoptose et les protéines liées à l'apoptose ont été analysées dans les cellules GC-1. La transcription inverse quantitative en chaîne par polymérase (RT-qPCR), les tests d'immunoprécipitation de l'ARN, l'immunofluorescence et le Western blot ont été utilisés pour examiner l'ARN long non codant NONMMUT031883.2, la protéine Quaking-5 (QKI-5) et la voie de signalisation de la protéine kinase activée par un stress mitogène p38 (p38 MAPK). La YC a amélioré de manière dépendante de la dose la qualité du sperme, les taux sériques d'hormones sexuelles, la morphologie des organes reproducteurs, l'histopathologie testiculaire et la fertilité chez les souris traitées au CP. Dans les cellules GC-1, la YC a augmenté la viabilité cellulaire et réduit les lésions cellulaires et l'apoptose. L'ARN long non codant NONMMUT031883.2 interagit physiquement avec QKI-5, et le traitement par YC a augmenté l'expression de l'ARN long non codant NONMMUT031883.2 tout en réduisant l'expression de QKI-5 et la phosphorylation de p38. Le traitement par YC a inhibé l'apoptose induite par l'extinction de l'ARN long non codant NONMMUT031883.2 dans les cellules GC-1, tandis qu'une surexpression de QKI-5 a atténué les effets anti-apoptotiques de la YC. Ces résultats suggèrent que la YC atténue le dysfonctionnement de la spermatogenèse induit par le CP et que ses effets protecteurs sont médiés par la régulation de la voie de signalisation lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.
Introduction
Le dysfonctionnement de la spermatogenèse désigne un trouble de la reproduction provoqué par des anomalies dans la production, la maturation ou la fonction des spermatozoïdes dans le système reproducteur masculin. Il se caractérise par une diminution du nombre et de la mobilité des spermatozoïdes, ainsi qu'une augmentation du taux de spermatozoïdes malformés.1,2La pathogenèse du dysfonctionnement de la spermatogenèse est complexe et associée à des facteurs génétiques, des troubles auto-immuns, des toxines environnementales, des lésions induites par la chimiothérapie et des atteintes des organes reproducteurs3-5. Des médicaments chimiothérapeutiques tels que la cyclophosphamide (CP) peuvent endommager directement les tubules séminifères testiculaires et induire l'apoptose des spermatogonies, contribuant ainsi au dysfonctionnement spermatogénique masculin.6,7La thérapie de remplacement hormonal, la supplémentation en antioxydants et les technologies de procréation médicalement assistée sont actuellement utilisées comme interventions cliniques. Toutefois, ces approches présentent une efficacité inconstante et des effets indésirables importants.8,9,10Par conséquent, l'identification d'interventions sûres et efficaces ainsi que la clarification de leurs cibles moléculaires revêtent une importance clinique pour améliorer les résultats en matière de fertilité chez les patients présentant un dysfonctionnement de la spermatogenèse.
La médecine traditionnelle chinoise a montré un potentiel dans la protection de la fonction reproductive masculine et le traitement des troubles de la spermatogenèse en raison de ses propriétés multitarget et de sa toxicité relativement faible11,12. La capsule Yangjing (YC) est un médicament breveté chinois composé de Rehmannia glutinosa, Epimedium, de placenta, de Polygonatum sibiricum, de Angelica sinensis et d'autres plantes médicinales chinoises. Elle est utilisée pour tonifier le rein et l'essence, nourrir le sang et la moelle, et réguler la fonction reproductive13. Des études antérieures ont montré que la YC peut réguler les niveaux d'hormones sexuelles chez les animaux mâles, améliorer la qualité du sperme, réparer les lésions tissulaires testiculaires et protéger contre les atteintes reproductrices induites par des agents chimiques14,15. Les cellules spermatogoniques constituent la base de la spermatogenèse, et une apoptose anormale des spermatogonies représente un événement central dans le développement des troubles de la spermatogenèse16. On a également signalé que la YC améliore la viabilité des spermatogonies, augmente la proportion de cellules en phase S et inhibe l'apoptose17. Toutefois, ses effets protecteurs et ses mécanismes moléculaires spécifiques dans les troubles de la spermatogenèse induits par le CP restent peu clairs.
Les ARN non codants longs (lncARN) sont des molécules d'ARN de plus de 200 nucléotides qui ne possèdent pas de capacité de codage protéique18. Les lncARN peuvent réguler l'expression des gènes par des mécanismes incluant le silence chromosomique, la modification de la chromatine, l'empreinte génomique et l'activation transcriptionnelle19,20. La protéine liant l'ARN Quaking-5 (QKI-5) participe à des processus physiologiques et pathologiques, notamment la prolifération cellulaire et l'apoptose, en régulant l'épissage alternatif de gènes en aval21. La voie de la protéine kinase activée par un stress mitogène p38 (MAPK) est impliquée dans la régulation de l'apoptose et joue également un rôle important dans la fertilité masculine et le développement testiculaire22,23. Une étude antérieure a montré qu'une surexpression de QKI-5 active la voie p38 MAPK dans les cellules de carcinome hépatocellulaire24. De plus, il a été démontré que le lncARN NONMMUT074098.2 interagit avec QKI-5 dans les spermatogonies, tandis qu'une inhibition de QKI-5 bloquait la voie p38 MAPK et réduisait l'apoptose spermatogoniale25. Cette étude a utilisé un modèle murin de dysfonction spermatogénique induite par le CP afin d'investiguer si le YC régule l'expression du lncARN NONMMUT031883.2 et l'axe de signalisation QKI-5/p38 MAPK, réduisant ainsi l'apoptose anormale des spermatogonies et atténuant la dysfonction spermatogénique induite par le CP (Figure 1). L'objectif était de préciser le mécanisme moléculaire sous-jacent aux effets protecteurs du YC sur la spermatogenèse et d'approfondir la compréhension de son rôle pharmacologique dans la protection de la fonction reproductive masculine.
Figure 1 : Schéma du dispositif expérimental. Le panneau supérieur résume les expériences in vitro réalisées sur des cellules spermatogoniales GC-1. L'extinction de l'ARNl NONMMUT031883,2 a été utilisée pour induire l'apoptose et des lésions cellulaires, suivie de l'extinction de QKI-5 afin d'évaluer ses effets sur l'apoptose et les dommages cellulaires. Le panneau inférieur résume les expériences in vivo menées sur des modèles murins de dysfonctionnement spermatogénique induit par la cyclophosphamide (CP). Les souris ont reçu un traitement par la Yangjing Capsule et/ou une intervention ciblant l'ARNl NONMMUT031883,2 ou QKI-5. La fertilité, les taux hormonaux sériques, les tissus testiculaires et épididymaires, la suspension spermatique, les réserves de spermatozoïdes, la qualité du sperme et les lésions histopathologiques testiculaires ont ensuite été évalués. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
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Protocole
Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément aux lignes directrices ARRIVE et au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Tous les protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par le comité d'éthique animal de l'Université du Sud-Est (numéro d'approbation : 20230216022).
1. Préparation du sérum contenant du YC
Deux gélules de Yangjing (YC ; 0,5 g/gélule) ont été ouvertes et 0,8 g de contenu a été pesé. Du sérum physiologique a été ajouté jusqu'à un volume final de 10 mL, puis le mélange a été homogénéisé vigoureusement au vortex afin de préparer une suspension à 80 mg/mL. Des souris mâles BALB/c spécifiques sans agents pathogènes, pesant 22–25 g et âgées de 8 semaines, ont été maintenues à 22 °C et une humidité de 55 à 60 %, sous un cycle lumière/obscurité de 12 h, avec fourniture de nourriture et d'eau ad libitumAprès une semaine d'acclimatation, les souris ont reçu du YC par gavage oral à une dose de 800 mg/kg de poids corporel dans un volume de 10 mL/kg, une fois par jour pendant 5 jours consécutifs. Deux heures après la dernière administration, les souris ont été anesthésiées par une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 1 %, et des échantillons de sang ont été recueillis afin de préparer un sérum contenant du YC. Le sérum a été inactivé à 56 °C pendant 30 min, filtré à travers un 0.22 µm membrane, et stockée à −80 °C jusqu'à l'utilisation.
2. Culture cellulaire et transfection
Les cellules spermatogoniales murines GC-1 ont été cultivées dans du DMEM contenant 1 % de pénicilline-streptomycine et 10 % de sérum bovin fœtal. Tous les cultures ont été maintenus à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % de CO₂ (v/v).
Des ARN interférents courts spécifiques aux ARNl (sh-ARNl), un plasmide d'expression surexprimant QKI-5 (OE-QKI-5), un ARN interférent petit (si-QKI-5) ciblant QKI-5, ainsi que leurs contrôles négatifs correspondants (sh-NC, OE-NC et si-NC) ont été synthétisés et construits. Les cellules GC-1 ont été transfectées avec sh-ARNl ou sh-NC, si-QKI-5 ou si-NC, ou OE-QKI-5 ou OE-NC selon les instructions du réactif de transfection. Après une incubation de 48 h, l'efficacité de transfection a été évaluée en mesurant l'expression de l'ARNl NONMMUT031883.2 ou de QKI-5.
Pour le groupe sh-lncARN + si-QKI-5 + étoposide, les cellules GC-1 ont été transfectées avec le sh-lncARN et le si-QKI-5, puis traitées avec 100 µM d'étoposide pendant 12 h26. Pour les tests ultérieurs de viabilité cellulaire, les cellules GC-1 ont été cultivées dans un milieu enrichi avec 5 %, 10 % ou 20 % de sérum contenant du YC, et ont été désignées respectivement comme les groupes YC à faible dose (L-YC), YC à dose moyenne (M-YC) et YC à forte dose (H-YC). Les concentrations de sérum contenant du YC (5 %, 10 % et 20 % YC) ont été déterminées en fonction des résultats d'expériences préliminaires de gradient de concentration. Pour les groupes sh-lncARN + H-YC + OE-NC et sh-lncARN + H-YC + OE-QKI-5, les cellules GC-1 ont été transfectées avec le sh-lncARN plus OE-NC ou le sh-lncARN plus OE-QKI-5 pendant 48 h, puis exposées à un sérum contenant 20 % de YC pendant 24 h.
3. Essai au kit Cell Counting Kit-8
Les cellules GC-1 ont été semées dans des plaques de 96 puits à raison de 5 × 103 cellules/puits et cultivées pendant 24 h. Après l’attachement des cellules, le milieu initial a été remplacé par 100 µL de milieu complet supplémenté en sérum contenant du YC, puis les cellules ont été incubées pendant 6, 12 ou 24 h. Après incubation, 10 µL du réactif du kit Cell Counting Kit-8 ont été ajoutés à chaque puits, et les cellules ont été incubées à 37 °C à l’abri de la lumière pendant 2 h. L’absorbance à 450 nm a été mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaques.
4. Dosage de la lactate déshydrogénase
Après 48 h de transfection avec sh-NC ou sh-lncARN, le milieu de culture des cellules GC-1 a été recueilli et le surnageant obtenu par centrifugation. Conformément aux instructions du kit de dosage de la lactate déshydrogénase, le surnageant a été doucement mélangé avec la solution de détection working solution et transféré dans une plaque de 96 puits. La plaque a été incubée à 25 °C à l’obscurité pendant 30 min. L’absorbance à 490 nm a été mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaque, et la libération de lactate déshydrogénase a été calculée afin d’évaluer les lésions cellulaires.
5. Coloration au Calcein AM/iodure de propidium
Après une transfection avec sh-NC ou sh-lncRNA pendant 48 h, la viabilité des cellules GC-1 a été évaluée par coloration au Calcein AM/iodure de propidium (PI). Les cellules ont été semées dans des plaques de 12 puits à raison de 5 × 104 cellules/puits et cultivées jusqu'à ce qu'elles atteignent une confluence de 60 % à 70 %. Les cellules ont été rincées doucement avec du tampon salin phosphate, puis 500 µL de solution de coloration au Calcein AM/PI ont été ajoutés à chaque puits. Les cellules ont été incubées à 37 °C à l'obscurité pendant 30 min, puis observées au microscope à fluorescence. Les cellules vivantes et mortes ont été décomptées à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images, et la proportion de cellules survivantes a été calculée.
6. Cytométrie en flux
Les cellules GC-1 ont été recueillies par centrifugation et rincées délicatement avec du tampon salin phosphate. Le culot cellulaire a été resuspendu dans 500 µL de tampon d'incubation à une densité de 5 × 105 cellules/mL. L'annexine V-APC et l'iodure de propidium (PI) ont ensuite été ajoutées, 5 µL chacune, et la suspension a été bien mélangée puis incubée à 25 °C à l'abri de la lumière pendant 10 min. L'apoptose a été analysée par cytométrie en flux en utilisant des longueurs d'onde d'excitation/émission de 633/660 nm pour l'APC et de 488/630 nm pour le PI. Le taux d'apoptose a été évalué à l'aide d'un logiciel d'analyse par cytométrie en flux.
7. Dosage de l'activité de la caspase-3
Après les traitements indiqués, environ 1 × 106 cellules GC-1 ont été recueillies, rincées et resuspendues dans du tampon phosphate salin. Les cellules ont été mélangées avec 100 µL du réactif II provenant du kit de dosage de l'activité de la caspase-3 et lysées sur glace pendant 15 min. Après centrifugation, 50 µL du surnageant du lysat ont été prélevés et mélangés avec 40 µL du réactif I et 10 µL du réactif III. Le mélange a été incubé à 37 °C pendant 2 h. L'absorbance à 405 nm a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques, et l'activité de la caspase-3 a été évaluée conformément aux instructions du fabricant du kit.
8. Essai de précipitation de l'ARN
Les brins sens et antisens de l'ARNl NONMMUT031883.2 ont été synthétisés selon la séquence correspondante et marqués avec de la biotine. Les cellules ont été lysées dans un tampon de lyse pour immunoprécipitation sur de la glace pendant 30 min, et le surnageant contenant les protéines a été récupéré par centrifugation. Les billes magnétiques streptavidine ont été lavées trois fois avec du tampon de liaison à l'ARN et incubées dans un tampon de liaison contenant 1 % d'albumine de sérum bovin pendant 30 min.
Les billes prétraitées ont été mélangées avec les sondes marquées à la biotine et incubées à 25 °C pendant 30 min. Les sondes non liées ont été éliminées par séparation magnétique. Le surnageant du lysat cellulaire a ensuite été ajouté, et le mélange a été incubé à 4 °C pendant 4 h afin de former des complexes ARN-protéine fixés sur les billes magnétiques. Les billes magnétiques ont été lavées trois fois avec du tampon de lavage pour éliminer les protéines liées de façon non spécifique. Le tampon de lavage a été éliminé par séparation magnétique, puis du tampon de charge 2× SDS a été ajouté. Les échantillons ont été chauffés à 95 °C pendant 10 min, et le surnageant a été récupéré par séparation magnétique en vue d'une analyse par immunoblotting (Western blot) ultérieure.
9. Construction d'un modèle murin de dysfonctionnement de la spermatogenèse
Après 5 jours d'acclimatation, des souris mâles BALB/c spécifiques sans agents pathogènes, pesant 22–25 g et âgées de 8 semaines, ont reçu du cyclophosphamide (CP) par voie intrapéritonéale à raison de 50 mg/kg une fois par jour pendant 7 jours afin d'établir un modèle de dysfonctionnement de la spermatogenèse14,27. Les souris correctement modélisées ont été réparties aléatoirement, à l'aide d'une table de nombres aléatoires, en groupes CP, YC 200 mg/kg, YC 400 mg/kg, YC 800 mg/kg, YC 800 mg/kg + sh-NC et YC 800 mg/kg + sh-lncRNA, avec six souris par groupe.
Les souris des groupes traités au YC ont reçu la dose correspondante de YC par gavage oral une fois par jour pendant 30 jours13. Pour les groupes 800 mg/kg YC + sh-NC et 800 mg/kg YC + sh-lncRNA, après l'établissement réussi du modèle, les souris ont été anesthésiées par inhalation d'isoflurane à 2 %. Après avoir confirmé l'absence de réflexe de retrait plantaire chez chaque souris et la stabilité de la fréquence respiratoire, la zone chirurgicale a été rasée et désinfectée à l'aide de povidone-iodée. En conditions aseptiques, une incision médiane ventrale a été pratiquée à travers la peau et la paroi corporelle en avant des organes génitaux. Le testicule a été exposé en manipulant soigneusement la graisse épididymaire, en prenant soin d'éviter tout dommage vasculaire. À l'aide d'un micromanipulateur, les tubules séminifères ont été visualisés, puis 1 µL de suspension d'adénovirus (1 × 1010 TU/mL) a été injecté lentement à l'aide d'une aiguille de micro-injection28. L'aiguille a été maintenue en place pendant 5 min après l'injection avant d'être retirée lentement, et l'hémostase a été obtenue à l'aide d'un coton stérile. La même procédure a ensuite été réalisée sur le testicule controlatéral. L'incision a ensuite été suturée, et les souris ont été laissées en récupération sur un tapis chauffant en postopératoire. Les souris témoins ont reçu quotidiennement un volume équivalent de solution saline par gavage et par injection.
10. Évaluation de la fertilité
Après l'achèvement de l'administration du médicament, les souris mâles de chaque groupe ont été accouplées librement avec des souris femelles BALB/c selon un ratio de 1:2 pendant 7 jours. La formation du bouchon vaginal chez les souris femelles a été surveillée et enregistrée quotidiennement. Une fois l'accouplement confirmé, les souris mâles ont été retirées, et les souris femelles ont été logées individuellement jusqu'à l'accouchement naturel. Neuf souris femelles gestantes par groupe ont été obtenues et incluses dans l'analyse. La taille moyenne de la portée a été notée afin d'évaluer la fertilité masculine dans chaque groupe.
À la fin de la période expérimentale, les souris ont été euthanasiées par administration intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 100 mg/kg. Cette méthode d’euthanasie a été approuvée par le Comité d'éthique animale de l'Université du Sud-Est (numéro d'approbation : 20230216022). Les testicules et les épididymes ont été soigneusement séparés, photographiés puis pesés. Les indices testiculaire et épididymaire ont été calculés selon la formule : masse de l'organe / masse du corps. Un épididyme provenant de chaque souris a été prélevé, coupé en morceaux, placé dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate préchauffée (37 °C) et incubé pendant 20 minutes afin de permettre aux spermatozoïdes de s'extraire29. La suspension de spermatozoïdes a été doucement homogénéisée, et 10 µL de cette suspension ont été déposés sur une lame de comptage des cellules sanguines préalablement chauffée. Le dénombrement des spermatozoïdes a été effectué manuellement au microscope optique avec un grossissement de 200×, et les résultats ont été exprimés en 106/L. Par ailleurs, le pourcentage de spermatozoïdes mobiles progressifs par rapport au nombre total de spermatozoïdes a été calculé pour évaluer la mobilité des spermatozoïdes13.
11. Détermination des taux d'hormones sexuelles
Du sang a été prélevé de la veine orbitaire de souris de chaque groupe et laissé reposer à 25 °C pendant 30 min. Le sérum a été recueilli par centrifugation à 3 000 × g pendant 10 min30. Les taux sériques de testostérone, d'hormone lutéinisante (LH) et d'hormone folliculo-stimulante (FSH) ont été mesurés à l'aide des kits correspondants de dosage immuno-enzymatique (ELISA).
12. Essai de stabilité de l'ARN
Les cellules GC-1 ont été semées dans des plaques de culture en 96 puits, transfectées avec un si-QKI-5 ou un si-NC, puis cultivées pendant 48 h. La dactinomycine a ensuite été ajoutée à 5 µg/mL, et les cellules ont été récoltées à 0, 3, 6 et 9 h. L'ARN total a été isolé, et le niveau d'expression relative de l'ARN long non codant NONMMUT031883.2 a été déterminé par réaction de transcription inverse quantitative suivie d'une réaction en chaîne par polymérase. Le niveau relatif d'ARN à chaque point de prélèvement a été calculé en prenant comme référence le niveau d'expression à 0 h fixé à 100 %.
13. Réaction de transcription inverse quantitative en chaîne par polymérase
Les cellules GC-1 et les tissus testiculaires de souris ont été rincés avec du tampon salin phosphate et lysés pour l'isolement de l'ARN total. L'ADN complémentaire a été synthétisé par transcription inverse à l'aide de la transcriptase inverse AMV. L'amplification par réaction en chaîne par polymérase a été réalisée à l'aide d'un système de PCR en temps réel et d'un kit de PCR quantitative, l'ADN complémentaire servant de matrice d'amplification. L'ARN U6 a été utilisé comme référence interne pour l'ARNl NONMMUT031883.2, et GAPDH a été utilisé comme référence interne pour référence interne pour QKI-5. L'expression relative du gène cible a été calculée en utilisant le 2−ΔΔCt méthode25L'ARN a également été isolé séparément à partir des fractions cytoplasmique et nucléaire afin de déterminer la localisation subcellulaire de l'ARNnl NONMMUT031883.2. Les séquences des amorces sont fournies dans Tableau 1.
| Gène | Amorce directe (5' à 3') | Amorce inverse (5' à 3') |
| QKI-5 | CTGTCATGCCAAACGGAAC | GATGGACACGCATATCGTG |
| GAPDH | AGGTCGGTGTGAACGGATTTG | TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA |
| lncRNA NONMMUT031883.2 | CCACTGTGGCACATTGAAGTA | TTAAGTTAATGGGTGCTGTGTT |
| U6 RNA | CTCGCTTCGGCAGCACA | AACGCTTCACGAATTTGCGT |
Tableau 1 : Séquences des amorces utilisées pour la réaction de transcription inverse quantitative en chaîne par polymérase. Les séquences des amorces sens et antisens sont indiquées dans le sens 5′–3′ pour l'ARNl NONMMUT031883.2, QKI-5, U6 et GAPDH.
14. Coloration par l'hématoxyline et l'éosine
Les tissus testiculaires et épididymaires de souris ont été immergés dans du paraformaldéhyde à 4 % et fixés à 4 °C pendant 24 h. Après un rinçage au tampon phosphate salin, les tissus ont été déshydratés à l'aide d'une série d'éthanol à concentration croissante, inclus dans la paraffine et coupés en sections de 5 µm. Les sections ont été chauffées à 60 °C pendant 60 min, puis déparaffinées dans le xylène pendant 30 min.
Après une réhydratation dans une série d'éthanol graduée, les sections ont été colorées à l'hématoxyline pendant 5 min, traitées avec une solution de différenciation à l'acide chlorhydrique-éthanol pendant 10 s, rincées à l'eau du robinet pour la coloration bleue, puis colorées à l'éosine 1 % pendant 2 min. Les sections ont ensuite été déshydratées dans de l'éthanol à 95 % et de l'éthanol absolu, puis clarifiées dans le xylène pendant 30 min. Après séchage à l'air, les sections ont été montées avec de la gomme neutre. Les modifications morphologiques des testicules et des épididymes ont été observées au microscope.
15. Immunofluorescence
Des coupes paraffines de testicules de souris ont été déparaffinées et réhydratées à l’aide d’une série d’éthanol à concentration décroissante, suivies d’une récupération des antigènes par micro-ondes dans un tampon citrate à pH 6,0. Après refroidissement naturel à température ambiante, les coupes ont été incubées avec du Triton X-100 à 0,3 % pendant 10 min. Les coupes ont été bloquées avec 5 % d’albumine de sérum bovin à 25 °C pendant 60 min, rincées au tampon phosphate salin, puis incubées toute la nuit à 4 °C avec un anticorps primaire dirigé contre Ki67. Le jour suivant, un anticorps secondaire immunoglobuline G marqué avec un fluorochrome a été appliqué, et les coupes ont été incubées à 37 °C à l’abri de la lumière pendant 60 min. Après un rinçage au tampon phosphate salin, les coupes ont été contre-colorées avec du DAPI pendant 10 min et observées au microscope à fluorescence. L’intensité de fluorescence a été analysée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image.
Pour la coloration en immunofluorescence des cellules GC-1, les cellules ont été ensemencées dans des plaques de 12 puits à raison de 1 × 105 cellules/puits et incubées pendant 24 h. Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 min, perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,3 % pendant 10 min, bloquées avec de l'albumine sérique bovine à 5 %, puis incubées toute la nuit à 4 °C avec un anticorps primaire dirigé contre QKI-5. Le reste de la procédure a été réalisé comme décrit pour les sections de tissu testiculaire.
16. Coloration TUNEL
Des coupes paraffines de testicules de souris ont été déparaffinées, réhydratées à l'aide d'une série d'éthanol à concentration décroissante, puis incubées avec du Triton X-100 à 0,1 % pendant 5 min afin d'augmenter la perméabilité de la membrane cellulaire. Une solution working de protéinase K à 20 µg/mL, sans DNase, a été appliquée uniformément sur les coupes, qui ont ensuite été incubées à 37 °C pendant 15 min. La solution de détection TUNEL a été ajoutée, et les coupes ont été incubées à 37 °C à l'abri de la lumière pendant 90 min. Après une incubation avec le DAPI pendant 10 min, un milieu de montage antifade a été appliqué, et le tissu testiculaire a été observé au microscope à fluorescence.
Les cellules GC-1 ont été ensemencées dans des plaques de 12 puits et fixées avec du paraformaldéhyde 4 % pendant 30 min. Après perméabilisation avec du Triton X-100 0,1 % pendant 5 min, une solution de détection TUNEL a été appliquée aux cellules, suivie d'une incubation à l'obscurité pendant 60 min. Les cellules ont ensuite été colorées avec du DAPI pendant 10 min et observées au microscope à fluorescence.
17. Immunotransfert (Western blotting)
Les tissus testiculaires de souris et les cellules GC-1 ont été lysés dans un tampon de lyse cellulaire pour immunoprécipitation sur de la glace pendant 30 min et soumis à une ultrasonication. Après centrifugation, le surnageant contenant les protéines a été récupéré et la concentration en protéines a été déterminée à l’aide d’un kit d’analyse par acide bichinconinique. Le surnageant protéique a été mélangé avec du tampon de charge SDS et chauffé dans de l’eau bouillante pendant 10 min. Après séparation par électrophorèse sur gel, les protéines ont été transférées sur des membranes de fluorure de polyvinylidène et bloquées avec 5 % d’albumine sérique bovine pendant 2 h31.
Les membranes ont été incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires dirigés contre la caspase-3 clivée (1:500), la Bcl-2 (1:1000), la caspase-3 (1:2000), la Bax (1:500), la QKI-5 (1:1000), la p38 phosphorylée (1:1000) ou la p38 (1:500). Le jour suivant, les membranes ont été rincées avec une solution saline tamponnée au Tris contenant du Tween 20 et incubées avec une immunoglobuline G de chèvre anti-lapin à une dilution de 1:10000 pendant 2 h à 25 °C. La solution de travail de chimiluminescence amplifiée a été appliquée sur la surface des membranes, et les bandes protéiques ont été visualisées à l’aide d’un système d’imagerie de gels. L’intensité des bandes a été analysée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image, et l’expression protéique relative a été normalisée par rapport à la GAPDH (1:3000).
La cycloheximide à 50 µg/mL a été utilisée pour inhiber la synthèse protéique. Afin de déterminer la demi-vie de QKI-5, les cellules ont été récoltées à 0, 3, 6 et 9 h, et les niveaux protéiques de QKI-5 ont ensuite été déterminés par immunobuvardage25.
18. Analyse statistique
Toutes les données ont été analysées statistiquement et représentées à l'aide de logiciels statistiques, de graphiques et d'analyse d'images. Le test de Shapiro-Wilk a été utilisé pour évaluer la normalité des données. Les données expérimentales sont présentées sous la forme moyenne ± écart-type. Une analyse de variance à un facteur a été utilisée pour évaluer les différences entre les groupes. Le test t de LSD a été utilisé pour des comparaisons par paires post hoc lorsque les variances étaient homogènes, tandis que le test de Dunnett T3 a été utilisé lorsque les variances étaient hétérogènes. Une valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
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Résultats
L'inhibition de l'ARNl NONMMUT031883.2 induit l'apoptose des spermatogonies
Les cellules GC-1 ont été transfectées avec un ARNsh ciblant l'ARNl afin d'inhiber l'expression de l'ARNl NONMMUT031883.2. Par rapport aux cellules transfectées avec l'ARNsh de contrôle (sh-NC), le niveau transcriptionnel de l'ARNl NONMMUT031883.2 a été nettement réduit après la transfection avec l'ARNsh ciblant l'ARNl, confirmant ainsi une inhibition efficace (Figure 2A). Après l'inhibition de...
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Discussion
Le dysfonctionnement acquis de la spermatogenèse induit par la chimiothérapie est une cause importante d'infertilité masculine32,33,34. Toutefois, les mécanismes moléculaires spécifiques restent incomplètement compris. Les résultats de cette étude montrent que la capsule Yangjing (YC) améliore de manière dépendante de la dose les anomalies des hormones sexuelles, les lésions histopathologiques testiculaires et l'altération de la...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d'intérêts financiers ou non financiers.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention no 82374257), le quatrième groupe du programme de formation des talents universitaires de haut niveau de l'hôpital provincial de médecine chinoise du Jiangsu (subvention no k2026yrc74) et les projets de recherche scientifique en médecine traditionnelle chinoise et en médecine intégrée chinoise-occidentale de la province du Jiangsu (subvention no CYTF2026019).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Actinomycine D | MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA | HY-17559 | Inhibiteur de la transcription utilisé pour les dosages de stabilité de l'ARN |
| Transcriptase inverse AMV | Takara, Tokyo, Japon | 2621 | Enzyme pour la synthèse de l'ADN complémentaire |
| Kit de détection d'annexine V-APC/PI | BioLab Technology, Pékin, Chine | KFS191 | Kit pour l'analyse par cytométrie en flux de l'apoptose |
| Milieu de montage antifade | MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA | HY-K1042 | Milieu de montage pour la préservation de la fluorescence |
| Anticorps primaire Bax | Affinity Biosciences, OH, USA | AF0120 | Anticorps primaire pour la détection de Bax |
| Kit BCA | Macklin, Shanghai, Chine | B917925 | Kit pour la détermination de la concentration en protéines |
| Anticorps primaire Bcl-2 | Affinity Biosciences, OH, USA | AF0769 | Anticorps primaire pour la détection de Bcl-2 |
| Albumine sérique bovine | BioLab Technology, Pékin, Chine | BTN131070 | Réactif de blocage |
| Kit de détection calceine/PI | Beyotime, Shanghai, Chine | C2015M | Kit pour la coloration des cellules vivantes/mortes |
| Kit de dosage de l'activité de la caspase-3 | BioLab Technology, Pékin, Chine | QN2866 | Kit pour mesurer l'activité de la caspase-3 |
| Anticorps primaire caspase-3 | Abcam, MA, USA | ab184787 | Anticorps primaire pour la détection de la caspase-3 |
| Réactif CCK-8 | MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA | HY-K0301 | Réactif pour l'évaluation de la viabilité cellulaire |
| Anticorps primaire caspase-3 clivée | Abcam, MA, USA | ab32042 | Anticorps primaire pour la détection de la caspase-3 clivée |
| Cycloheximide | Macklin, Shanghai, Chine | H823111 | Inhibiteur de la synthèse protéique utilisé pour les dosages de stabilité des protéines |
| Cyclophosphamide | MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA | HY-17420 | Utilisé pour induire un dysfonctionnement spermatogénique |
| Réactif DAPI | Beyotime, Shanghai, Chine | C1006 | Contre-coloration nucléaire |
| Milieu DMEM | Wuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, Chine | SNLM-302 | Milieu de culture cellulaire pour les cellules GC-1 |
| Solution de travail ECL | Solarbio, Pékin, Chine | SW2030 | Substrat chimiluminescent pour la détection des bandes protéiques |
| Etoposide | MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA | HY-13629 | Agent inducteur de l'apoptose |
| Cytomètre en flux | BD Biosciences, CA, USA | BD FACSCalibur | Instrument pour l'analyse de l'apoptose |
| Logiciel FlowJo | BD Biosciences, CA, USA | v10.8 | Logiciel pour l'analyse des données de cytométrie en flux |
| Microscope à fluorescence | Leica, Heidelberg, Allemagne | DM3000 | Instrument pour l'imagerie en fluorescence |
| Anticorps secondaire IgG marqué par fluorescence | Servicebio, Wuhan, Chine | GB22303 | Anticorps secondaire pour la détection en immunofluorescence |
| Kit ELISA pour l'hormone folliculostimulante | Huamei Biotech, Wuhan, Chine | CSB-E06871m | Kit pour mesurer l'hormone folliculostimulante sérique |
| Anticorps primaire GAPDH | Affinity Biosciences, OH, USA | T0004 | Anticorps de contrôle de chargement pour le Western blot |
| Cellules GC-1 | Wuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, Chine | SNL-302 | Ligne cellulaire de spermatogonies murines |
| Système d'imagerie de gel | Jinpeng Analysis Instrument, Shanghai, Chine | JP-2880 | Système d'imagerie pour la visualisation des gels et des transferts |
| Système d'imagerie de gel | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | iBright CL1500 | Système d'imagerie par chimiluminescence pour les Western blots |
| Anticorps secondaire caprin anti-lapin IgG | Servicebio, Wuhan, Chine | GB23303 | Anticorps secondaire pour le Western blot |
| Solution d'hématoxyline | BioLab Technology, Pékin, Chine | YT165 | Colorant nucléaire pour l'analyse histologique |
| Solution de différenciation acide chlorhydrique-éthanol | Beyotime, Shanghai, Chine | C0163S | Réactif de différenciation pour la coloration à l'hématoxyline |
| Logiciel ImageJ | National Institutes of Health, USA | 1.54h | Logiciel pour la quantification d'images |
| Solution de lyse cellulaire pour immunoprécipitation (IP) | Beyotime, Shanghai, Chine | P0013 | Solution de lyse pour l'immunoprécipitation et l'extraction protéique |
| Anticorps primaire Ki67 | Affinity Biosciences, OH, USA | AF0198 | Anticorps primaire pour la détection de Ki67 |
| Kit de dosage de la cytotoxicité par LDH | Beyotime, Shanghai, Chine | C0016 | Kit pour mesurer la libération de la lactate déshydrogénase et les lésions cellulaires |
| Microscope optique | Olympus, Tokyo, Japon | CKX53 | Utilisé pour le comptage des spermatozoïdes et l'observation morphologique |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | L3000001 | Réactif de transfection |
| Lecteur de microplaques | Molecular Devices, CA, USA | SpectraMax Mini | Instrument pour les mesures d'absorbance |
| Kit ELISA pour l'hormone lutéinisante murine | Huamei Biotech, Wuhan, Chine | CSB-E12770m | Kit pour mesurer l'hormone lutéinisante sérique |
| Kit ELISA pour la testostérone murine | Huamei Biotech, Wuhan, Chine | CSB-E05101m | Kit pour mesurer la testostérone sérique |
| Gomme neutre | BioLab Technology, Pékin, Chine | QN1253 | Milieu de montage pour les sections histologiques |
| Anticorps primaire p38 | Affinity Biosciences, OH, USA | AF6456 | Anticorps primaire pour la détection de la p38 totale |
| Paraformaldéhyde | MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA | HY-Y0333 | Fixateur pour cellules et tissus |
| Kit PARIS | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | AM1921 | Kit pour la fractionnement de l'ARN nucléaire et cytoplasmique |
| Système PCR | ABI, CA, USA | ABI PRISM 7300 | Instrument de PCR en temps réel |
| Anticorps primaire p-p38 | Affinity Biosciences, OH, USA | AF3455 | Anticorps primaire pour la détection de la p38 phosphorylée |
| Solution de protéinase K | Beyotime, Shanghai, Chine | ST532 | Réactif pour la perméabilisation tissulaire avant la coloration TUNEL |
| Membraanes PVDF | Millipore, MA, USA | ISEQ00010 | Membraanes pour le transfert protéique en Western blot |
| Anticorps primaire QKI-5 | Abcam, MA, USA | ab126742 | Anticorps primaire pour la détection de QKI-5 |
| Solution de liaison ARN | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | 65040D | Solution pour les réactions de liaison ARN-protéine |
| Solution de chargement SDS | Beyotime, Shanghai, Chine | P0286 | Solution de chargement d'échantillons pour SDS-PAGE |
| Billes magnétiques streptavidine | MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA | HY-K0208 | Billes magnétiques pour la capture de sondes ARN marquées par biotine |
| Kit qPCR TB Green FAST | Takara, Tokyo, Japon | CN830S | Kit réactif pour la PCR quantitative |
| Triton X-100 | Macklin, Shanghai, Chine | T824275 | Réactif de perméabilisation |
| Réactif TRIzol | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | 15596018CN | Réactif pour l'extraction totale d'ARN |
| Solution de détection TUNEL | Beyotime, Shanghai, Chine | C1086 | Réactif pour la détection de la fragmentation de l'ADN |
| Xylène | Macklin, Shanghai, Chine | X821391 | Réactif pour l'élimination de la paraffine et la clarification tissulaire |
Références
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