Effets néphroprotecteurs de l'éthanol et du fomepizole dans un modèle de rat prétraité au méthotrexate d'intoxication au méthanol

Résumé

Cette étude compare les effets néphroprotecteurs de l'éthanol et de la fomépizole dans un modèle de rat prétraité au méthotrexate d'intoxication au méthanol, conçu pour réduire l'élimination du formiate dépendante du folate. Les résultats rénaux ont été évalués à l'aide de mesures de la fonction rénale, de biomarqueurs de lésion rénale, de marqueurs inflammatoires, de biomarqueurs liés au redox et de résultats histopathologiques.

Résumé

L'intoxication par le méthanol provoque une acidose métabolique, des lésions d'organes et la mort ; les atteintes rénales prédisent des issues défavorables. L'éthanol et la fomépizole ont été comparés dans un modèle de rat prétraité par le méthotrexate d'intoxication au méthanol. Trente rats mâles Wistar ont été répartis en cinq groupes : Témoin, méthotrexate (MTX), MTX + méthanol, MTX + méthanol + fomépizole et MTX + méthanol + éthanol (n = 6 par groupe). Le MTX a été administré par gavage oral à 0,3 mg/kg/jour aux jours 1 à 7. Les trois groupes exposés au méthanol ont reçu 3 g/kg de méthanol par gavage oral au jour 8. La fomépizole a été administrée par voie intrapéritonéale à 15 mg/kg 4 heures après l'administration de méthanol, suivie de 10 mg/kg aux heures 12, 24 et 36. L'éthanol a été administré une fois par gavage oral à 0,5 g/kg 4 heures après l'administration de méthanol. Les prélèvements ont été effectués au jour 10. Aucun critère de jugement principal n'avait été désigné a priori. La fonction rénale, les lésions du homogénat rénal, les biomarqueurs inflammatoires, les biomarqueurs sanguins liés au redox et les résultats histopathologiques ont été évalués. Une analyse de variance (ANOVA) a révélé des différences significatives entre les groupes pour la cystatine C du homogénat rénal (p = 0,003), l'interleukine-6 (IL-6 ; p = 0,013), la molécule-1 de lésion rénale (KIM-1 ; p = 0,017), l'urée sérique (p = 0,017) et la créatinine sérique (p < 0,001). Les tests post hoc de Duncan ont montré des valeurs inférieures pour ces paramètres dans les deux groupes recevant un antidote par rapport au groupe MTX + méthanol. Aucune différence biochimique significative n'a été observée entre les deux groupes antidote. Les scores histopathologiques étaient plus faibles dans les groupes antidote. Bien que la fomépizole ait présenté un profil descriptif plus favorable, ces résultats n'établissent pas sa supériorité par rapport à l'éthanol. L'hétérogénéité des variances, les tests multiples, les régimes antidote inégaux, l'absence de mesures toxicocinétiques et d'équilibre acido-basique, ainsi qu'une courte durée de suivi limitent l'interprétation. De futures études devraient inclure des mesures directes du méthanol et du formiate, l'activité rénale cytosolique de l'alcool déshydrogénase, des corrélations avec les paramètres biochimiques rénaux, des périodes de suivi plus longues et des régimes antidote comparables.

Introduction

L'intoxication par l'alcool méthylique (méthanol) est une urgence toxicologique majeure associée à une morbidité et une mortalité importantes dans le monde entier, en particulier suite à la consommation de boissons alcoolisées illicites ou fabriquées illégalement. Bien que le méthanol lui-même présente une toxicité relativement faible, il est principalement métabolisé dans le foie par l'alcool déshydrogénase (ADH) en formaldéhyde, puis en acide formique ; l'accumulation consécutive de formiate peut provoquer une acidose métabolique à trou anionique élevé, une neuropathie optique et des lésions multi-organiques.^1,2Le formaldéhyde est un intermédiaire à courte durée de vie, tandis que l'accumulation de formiate est considérée comme le principal facteur de toxicité, par inhibition de la cytochrome oxydase mitochondriale, induction d'une hypoxie cellulaire et d'un stress oxydatif³. Le diagnostic précoce, la correction de l'acidose métabolique, le traitement antidotique et l'hémodialyse constituent les principales approches thérapeutiques permettant de réduire la mortalité.².

Dans l'intoxication par le méthanol, les manifestations cliniques deviennent généralement apparentes après une période latente. Des nausées, des vomissements, des douleurs abdominales et une légère dépression du système nerveux central peuvent être suivis d'une acidose métabolique à trou anionique élevé, d'une dyspnée, de troubles de l'état mental et de symptômes visuels^1,2. Des troubles visuels tels que la vision floue, la photophobie, la mydriase, un œdème du disque optique et, dans les cas graves, une cécité permanente font partie des effets toxiques les plus caractéristiques associés à l'inhibition, par l'acide formique, de la cytochrome oxydase mitochondriale^1,2. Les stratégies thérapeutiques actuelles comprennent les soins de support ; la correction de l'acidose métabolique à l'aide de bicarbonate de sodium ; la supplémentation en folinique ou en acide folique ; l'inhibition de l'alcool déshydrogénase par l'éthanol ou le fomépizole ; et, dans certains cas graves sélectionnés, l'hémodialyse afin d'accélérer l'élimination du méthanol et du formiate^3,4. Le fomépizole est de plus en plus considéré comme un antidote de première intention en raison de sa pharmacocinétique plus prévisible, d'une posologie plus simple et d'un risque moindre d'effets indésirables ; toutefois, l'éthanol reste une alternative importante en raison de sa disponibilité et de son coût inférieur^4,5,6,7.

Bien que les lésions du nerf optique et du système nerveux central aient traditionnellement été considérées comme les manifestations prédominantes de la toxicité du méthanol, le rein est de plus en plus reconnu comme un organe cible cliniquement pertinent^8,9,10. Dans des cohortes spécifiques au méthanol, une lésion rénale aiguë (LRA) a été associée à une acidose métabolique plus sévère, à un échec respiratoire, à un échec multiviscéral, à une ventilation mécanique, à un traitement extracorporel, à une hospitalisation plus longue et à une mortalité intra-hospitalière plus élevée ; la déplétion volémique, la septicémie, la rhabdomyolyse et la pancréatite aiguë ont également été identifiées comme des facteurs associés au développement d'une LRA^8,10. Dans la cohorte rapportée par Chang et al., la LRA est restée indépendamment associée à la mortalité intra-hospitalière dans une analyse multivariée ; toutefois, la conception observationnelle rétrospective n'établit pas que la LRA elle-même a causé la mortalité⁸. Par conséquent, la LRA doit être interprétée comme un marqueur d'une gravité plus importante de la maladie et d'un pronostic moins favorable dans l'intoxication au méthanol. En revanche, la revue systématique de Wang et al. a évalué les atteintes rénales après un empoisonnement par alcools toxiques de manière plus large, principalement par le méthanol et l'éthylène glycol ; ses conclusions ne sont donc pas exclusivement spécifiques au méthanol⁹. Cette revue a mis en évidence une mortalité à court terme importante et des lacunes significatives dans les données concernant la récupération rénale à long terme, la dialyse continue et la standardisation des rapports sur les résultats rénaux⁹.

La relation entre la toxicité du méthanol et l'IRA est probablement multifactorielle. L'accumulation de métabolites toxiques pourrait contribuer par une inhibition mitochondriale, une hypoxie cellulaire, une acidose métabolique sévère et un déséquilibre redox, tandis que des facteurs systémiques observés dans des cohortes cliniques — notamment la déplétion volémique, l'altération hémodynamique, la rhabdomyolyse, la sepsie, l'insuffisance respiratoire et le dysfonctionnement multiviscéral — pourraient induire des atteintes rénales supplémentaires^1,2,3,8,10. Ces voies offrent des liens biologiquement et cliniquement plausibles entre l'intoxication par le méthanol et les lésions rénales. Les troubles métaboliques rénaux peuvent résulter de l'exposition au formiate circulant, de l'inhibition mitochondriale, de l'acidose métabolique et du stress hémodynamique systémique. Toutefois, la contribution spécifique du métabolisme de l'alcool et de l'aldehyde au sein du tissu rénal reste incertaine, car les concentrations de méthanol, de formaldéhyde et de formiate, l'activité rénale de l'ADH et la fonction mitochondriale n'ont pas été évaluées directement dans la présente étude.

Un défi méthodologique majeur dans les études expérimentales de la toxicité du méthanol réside dans le fait que les rats métabolisent l'acide formique plus rapidement que les humains. Bien que l'accumulation d'acide formique soit un facteur déterminant principal de la toxicité du méthanol chez l'homme, obtenir une accumulation comparable et des lésions organiques conséquentes chez le rat est plus difficile en raison de leur métabolisme très efficace du formate, dépendant du folate. Par conséquent, des agents qui suppriment le métabolisme du folate sont fréquemment utilisés dans les modèles expérimentaux de toxicité du méthanol^11,12. Un traitement préalable par le méthotrexate (MTX) a été utilisé pour réduire l'élimination du formate dépendante du folate chez les rats, augmentant ainsi la sensibilité à la toxicité du méthanol^11,12. Le méthotrexate n'induit pas lui-même la toxicité du méthanol, et le modèle obtenu ne reproduit pas tous les aspects de l'intoxication humaine au méthanol. Étant donné que le méthotrexate peut influencer indépendamment les résultats rénaux, oxydatifs et inflammatoires, un groupe traité uniquement au MTX a été inclus afin de caractériser les modifications associées au traitement préalable. Malgré ces limites, le modèle fournit une plateforme préclinique contrôlée permettant de comparer les profils d'atteinte rénale entre des groupes expérimentaux recevant le même protocole de prétraitement au méthotrexate et d'exposition au méthanol, et d'évaluer ces atteintes aux niveaux biochimique, inflammatoire, oxydatif et histopathologique.

L'inhibition de l'alcool déshydrogénase constitue le pilier du traitement antidotique de l'intoxication par le méthanol. Les deux agents les plus couramment utilisés à cet effet en pratique clinique sont l'éthanol et la fomépizole (4-méthylpyrazole). L'éthanol supprime de manière compétitive la formation de métabolites toxiques en raison de son affinité plus élevée que le méthanol pour l'ADH, tandis que la fomépizole, un inhibiteur puissant et sélectif de l'ADH, empêche directement la transformation du méthanol en formaldéhyde et en acide formique^5,6. Toutefois, aucun consensus complet n'existe quant à l'efficacité clinique comparative, la sécurité, la facilité d'administration et les effets protecteurs sur les organes de ces deux antidotes. La fomépizole est considérée comme avantageuse dans de nombreux centres en raison de son schéma posologique standardisé, de l'absence de nécessité de surveillance des concentrations sériques, de l'absence de dépression du système nerveux central et de propriétés pharmacocinétiques plus prévisibles, tandis que le traitement par éthanol est associé à des inconvénients potentiels, notamment l'hypoglycémie, l'hépatotoxicité, des troubles mentaux et la nécessité d'une surveillance intensive^6,7. En revanche, des comparaisons cliniques à grande échelle ont suggéré que les effets des deux antidotes sur la mortalité et les résultats cliniques pourraient être similaires. Dans l'étude de Zakharov et al., qui a évalué des cas d'intoxication de masse, aucune différence significative de survie n'a été observée entre la fomépizole et l'éthanol⁵.

Malgré l'importance pronostique de l'IRA dans l'intoxication au méthanol^8,9,10, les lésions rénales ont fait l'objet d'une attention nettement moindre que la toxicité oculaire et neurologique, et les effets rénaux comparatifs de l'éthanol et du fomépizole restent insuffisamment caractérisés. Une évaluation centrée sur le rein, intégrant des tests conventionnels de la fonction rénale, des biomarqueurs précoces de lésions tubulaires, des cytokines inflammatoires, des paramètres liés au redox et une histopathologie, est donc justifiée afin de déterminer si les deux stratégies antidotiques sont associées à des profils différents de résultats rénaux. En outre, ce modèle contrôlé de rat prétraité par le méthotrexate pourrait faciliter l'évaluation préclinique de stratégies antidotiques candidates, de traitements ciblant spécifiquement le rein et d'interventions de soutien dans des conditions expérimentales bien définies. La valeur scientifique de ce modèle réside dans l'évaluation comparative dans un cadre expérimental aigu, plutôt que dans la reproduction directe de la complexité clinique et métabolique de l'intoxication humaine au méthanol.

Les différences dans le métabolisme du méthanol entre les rongeurs et les humains, ainsi que l'utilisation d'un traitement préventif pharmacologique pour réduire l'élimination du formiate dépendante du folate, restent des limitations méthodologiques importantes. De plus, la toxicité aiguë induite dans des conditions expérimentales peut ne pas refléter fidèlement les durées d'exposition variables et les affections concomitantes observées en pratique clinique. Par conséquent, les résultats obtenus à partir de ce modèle animal doivent être considérés comme des preuves précliniques préliminaires et ne doivent pas être utilisés directement pour étayer des décisions thérapeutiques chez l'humain. Une confirmation dans des études cliniques convenablement conçues est nécessaire avant que des conclusions cliniques puissent être tirées. Dans ce contexte, la principale lacune dans les connaissances concerne la question de savoir si l'éthanol et la fomépizole sont associés à des profils différents d'atteinte rénale selon les mesures conventionnelles de la fonction rénale, les biomarqueurs de lésion tubulaire, les cytokines inflammatoires, les paramètres liés au redox et l'histopathologie, dans un modèle de rat prétraité au méthotrexate. L'hypothèse de l'étude était que l'inhibition de l'alcool déshydrogénase par l'éthanol ou la fomépizole serait associée à une atténuation de la lésion rénale, avec d'éventuelles différences entre les traitements selon les domaines d'issue évalués. La néphroprotection a été définie de manière opérationnelle comme un profil d'issues rénales plus favorable que dans le groupe MTX + Méthanol. Ce profil comprenait des concentrations plus faibles d'urée et de créatinine sériques ; des niveaux rénaux plus bas de la molécule de lésion rénale-1 (KIM-1), de la cystatine C, du facteur de nécrose tumorale-alpha (TNF-α), de l'interleukine-6 (IL-6) et de l'interleukine-1 bêta (IL-1β) ; des concentrations sériques plus faibles de malondialdéhyde (MDA) ; une activité plus élevée de la superoxyde dismutase (SOD) sérique, des taux sanguins plus élevés de glutathion réduit (GSH) et une activité sanguine plus élevée de la catalase (CAT) ; ainsi que des scores histopathologiques plus faibles pour la dégénérescence tubulaire, la nécrose tubulaire, la lésion glomérulaire, la congestion vasculaire, l'inflammation interstitielle et la fibrose. La néphroprotection n'a pas été calculée comme un score composite unique ; au lieu de cela, les issues individuelles ont été évaluées collectivement à travers ces différents domaines complémentaires. L'étude visait donc à comparer les effets de l'éthanol et de la fomépizole sur la fonction rénale, la lésion tubulaire, l'inflammation, le statut redox et l'histopathologie rénale dans ce modèle.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité d'éthique local des expériences sur les animaux de l'Université Ahi Evran de Kırşehir (décision d'approbation n°1, réunion n°12, date d'approbation : 12 juin 2025) et ont été réalisées conformément aux lignes directrices nationales et internationales relatives aux soins et à l'utilisation des animaux de laboratoire. Des mesures ont été prises tout au long de l'étude afin de minimiser la douleur et la détresse et d'utiliser le nombre minimal d'animaux nécessaire.

Préparation des produits chimiques
Le méthotrexate a été utilisé comme agent de prétraitement afin de faciliter la mise en place du modèle expérimental de toxicité du méthanol. Étant donné que l'oxydation du formiate, dépendante du folate, est plus efficace chez le rat que chez l'humain, un prétraitement par méthotrexate a été appliqué pour réduire l'élimination du formiate et augmenter la sensibilité à la toxicité du méthanol ; il a été utilisé comme une intervention sensibilisant le modèle, et non comme substitut à l'exposition au méthanol^11,12. Le méthotrexate était fourni sous forme d'une solution à 500 mg/5 mL, correspondant à une concentration stock de 100 mg/mL. Cette formulation a été diluée avec une solution stérile de chlorure de sodium à 0,9 % pour obtenir une concentration finale d'utilisation de 0,06 mg/mL. La solution d'utilisation a été administrée par gavage oral à une dose de 5 mL/kg, ce qui correspond à une dose de MTX de 0,3 mg/kg. Chez les rats pesant entre 200 et 220 g au début de l'étude, le volume quotidien administré variait de 1,00 à 1,10 mL par animal et était calculé individuellement à partir du poids corporel enregistré au début de l'étude. Le poids corporel n'a pas été réévalué durant la période de prétraitement de 7 jours au MTX. Le méthotrexate a été administré une fois par jour pendant 7 jours consécutifs (jours 1 à 7 de l'étude), et le méthanol a été administré le jour 8 de l'étude, après achèvement du protocole de prétraitement au MTX. Ce régime était conforme aux modèles de prétraitement par gavage oral au MTX publiés précédemment¹³.

Le méthanol (pureté ≥99,8 %) a été préparé frais le jour de l'administration sous forme de solution aqueuse working à 20 % (v/v) par dilution avec de l'eau distillée stérile. La solution working a été préparée en mélangeant un volume de méthanol avec quatre volumes d'eau distillée stérile. Conformément aux modèles de rats prétraités par le méthotrexate décrits précédemment pour l'intoxication au méthanol, une dose unique de méthanol a été administrée aux groupes 3 à 5 le jour 8 de l'étude à raison de 3 g/kg par gavage oral. Aucune restriction alimentaire ou hydrique n'a été imposée avant l'administration du méthanol. Le volume d'administration requis a été calculé individuellement en fonction du poids corporel de chaque animal et était d'environ 18,9 mL/kg pour la solution de méthanol à 20 %. Chez un rat pesant environ 220 g, cette dose correspondait à 0,66 g de méthanol et à un volume final de gavage d'environ 4,2 mL. Ce régime d'exposition au méthanol a été choisi afin de maintenir la comparabilité avec les modèles de rats prétraités par le méthotrexate publiés précédemment pour la toxicité aiguë du méthanol^13,14,15.

La solution working de fomepizole a été préparée dans une solution stérile de chlorure de sodium à 0,9 % à une concentration finale de 10 mg/mL. Une dose de charge intrapéritonéale de 15 mg/kg a été administrée 4 h après l'administration de méthanol, suivie de doses d'entretien intrapéritonéales de 10 mg/kg aux moments 12, 24 et 36 h. À la concentration working de 10 mg/mL, les volumes d'administration étaient de 1,5 mL/kg pour la dose de charge et de 1,0 mL/kg pour chaque dose d'entretien. Chez un rat dont le poids corporel au début de l'étude était d'environ 220 g, ces doses correspondaient à environ 0,33 mL pour la dose de charge et 0,22 mL pour chaque dose d'entretien. Tous les volumes d'administration ont été calculés à partir du poids corporel enregistré au début de l'étude. Les doses de charge et d'entretien de fomepizole ont été choisies en se référant aux recommandations établies pour le traitement de l'intoxication au méthanol^1,6.

L'éthanol a été utilisé comme traitement comparateur antidotique. L'éthanol absolu (pureté ≥99,8 %) a été dilué avec de l'eau distillée stérile en mélangeant un volume d'éthanol absolu avec quatre volumes d'eau distillée stérile afin d'obtenir une solution aqueuse de travail finale à 20 % (v/v). Une dose unique d'éthanol a été administrée par gavage oral à une dose de 0,5 g/kg, 4 heures après l'administration de méthanol ; aucune dose d'entretien d'éthanol n'a été administrée. Le volume d'administration était d'environ 3,2 mL/kg. Chez un rat dont le poids corporel au début de l'étude était d'environ 220 g, cela correspondait à un volume final de gavage d'environ 0,70 mL. Le volume d'administration a été calculé à partir du poids corporel enregistré au début de l'étude. La concentration d'éthanol, la dose, la voie et le moment de l'administration ont été choisis en se basant sur des modèles de rats prétraités au méthotrexate déjà publiés, utilisant l'éthanol comme comparateur antidotique^13,14.

Toutes les solutions ont été préparées fraîchement le jour de l'administration et ont été vérifiées pour leur aspect homogène ainsi que l'absence de particules visibles. Les administrations orales ont été réalisées à l'aide d'une canule gastrique en acier inoxydable. Pendant la gavage, la canule a été soigneusement introduite de la cavité buccale dans l'œsophage, en évitant tout risque de régurgitation, de fuite buccale, d'aspiration ou de détresse respiratoire. Les injections intrapéritonéales ont été effectuées dans des conditions aseptiques à l'aide de seringues et d'aiguilles stériles jetables. Toutes les procédures liées à la préparation et à l'administration des produits chimiques ont été menées conformément aux réglementations institutionnelles de sécurité en laboratoire.

Animaux expérimentaux, conditions d'hébergement et randomisation
Un total de 30 rats mâles albinos Wistar adultes, âgés de 8 à 12 semaines et pesant 220 ± 20 g, ont été obtenus auprès du laboratoire de recherche sur les animaux expérimentaux de l'Université Ahi Evran, à Kırşehir, en Turquie. Les rats Wistar ont été choisis car ils ont été largement utilisés dans des études expérimentales de toxicité et de néphroprotection, ce qui permet une comparaison avec des études précédemment publiées. Les animaux ont été logés à 24 ± 2 °C sous un cycle lumineux de 12 heures claires/12 heures d'obscurité. Une alimentation standard en granulés et de l'eau du robinet ont été fournies ad libitum pendant toute la durée de l'expérience, soit 10 jours. Avant les procédures expérimentales, tous les animaux ont subi une période d'acclimatation de 7 jours.

Trente rats ont été répartis en cinq groupes expérimentaux à l'aide d'une procédure de répartition aléatoire assistée par ordinateur, avec un objectif de six animaux par groupe. Pour chaque rat, un nombre entier aléatoire compris entre 1 et 5 a été généré, et l'animal a été affecté au groupe expérimental correspondant. Dès qu'un groupe comptait six animaux, tout tirage ultérieur désignant ce groupe était rejeté, et un nouveau nombre aléatoire était généré jusqu'à ce qu'un groupe disposant d'une place disponible soit sélectionné. Cette procédure a été poursuivie jusqu'à ce que les 30 rats soient tous attribués, ce qui a donné six animaux par groupe. Le même chercheur a généré les attributions aléatoires et mis en œuvre la répartition ; aucun opérateur de répartition distinct n'a été utilisé. Le groupe 1 (témoin) n'a reçu aucun traitement expérimental par médicament, et les animaux ont subi le même prélèvement planifié à terme que les autres groupes. Le groupe 2 (MTX) a reçu du méthotrexate par gavage oral à 0,3 mg/kg pendant 7 jours. Le groupe 3 (MTX + Méthanol) a reçu du méthotrexate pendant 7 jours, suivi de méthanol à 3 g/kg le jour 8 de l'étude. Le groupe 4 (MTX + Méthanol + Fomépizole) a reçu un traitement préalable par méthotrexate suivi de méthanol, avec une administration de 4-méthylpyrazole initiée 4 h plus tard. Le groupe 5 (MTX + Méthanol + Éthanol) a reçu un traitement préalable par méthotrexate suivi de méthanol, avec une administration d'éthanol 4 h plus tard.

Les trois groupes exposés au méthanol ont reçu le même prétraitement au MTX et le même protocole d'administration de méthanol, et ne différaient uniquement quant au traitement antidotique post-exposition. L'attribution expérimentale des groupes, le protocole d'administration, le moment du traitement antidotique et le processus de collecte des échantillons sont résumés dans la Figure 1. Une analyse a priori de la puissance statistique a été réalisée pour une ANOVA à un facteur à effets fixes comprenant cinq groupes indépendants. En supposant une taille d'effet standardisée importante (f de Cohen = 0,70), un seuil de significativité de 0,05 et une puissance statistique de 80 %, la taille d'échantillon minimale requise a été calculée à 30 animaux, soit six animaux par groupe. La puissance calculée pour une taille d'échantillon totale de 30 était d'environ 80,9 %. La taille d'effet supposée (f de Cohen = 0,70) a été définie avant l'expérience, sur la base de l'attente des chercheurs concernant un effet global important entre les groupes dans ce modèle de toxicité aiguë. Cette hypothèse reposait sur le jugement des chercheurs et non sur une estimation issue de données pilotes ou d'une étude précédente spécifique. Aucun critère de jugement principal n'avait été désigné a priori pour cette étude ; le calcul de la taille de l'échantillon était fondé sur une hypothèse d'un effet global important dans une comparaison omnibus entre les cinq groupes expérimentaux. Un critère de jugement principal ne peut pas être désigné rétrospectivement comme un point d'évaluation spécifié a priori. Par conséquent, le calcul de la taille de l'échantillon ne garantit pas une puissance adéquate pour chaque critère individuel ou pour les comparaisons par paires.

Protocole d'intoxication par le méthanol et de traitement antidotique
Après la période d'acclimatation, les animaux des groupes 2 à 5 ont reçu du méthotrexate une fois par jour pendant 7 jours consécutifs (jours d'étude 1 à 7). Au jour 8 de l'étude, les animaux des groupes 3 à 5 ont reçu une dose unique de solution de méthanol à 20 %, à raison de 3 g/kg, par gavage oral. Aucun jeûne ni autre restriction alimentaire ou hydrique n'a été imposé avant l'administration du méthanol.

Dans le groupe MTX + Méthanol + Fomépizole, une dose de charge de 15 mg/kg a été administrée par voie intrapéritonéale 4 h après l'administration de méthanol, suivie de doses d'entretien de 10 mg/kg par voie intrapéritonéale aux moments 12, 24 et 36 h après l'administration de méthanol. Dans le groupe MTX + Méthanol + Éthanol, une dose unique d'éthanol a été administrée par gavage oral à 0,5 g/kg, 4 h après l'administration de méthanol ; aucune dose d'entretien d'éthanol n'a été administrée. Les deux régimes antidotiques ont été choisis pour refléter les recommandations établies en matière de posologie du fomépizole et des protocoles comparateurs d'éthanol publiés précédemment^1,6,13,14. Les régimes n'ont pas été conçus pour fournir un traitement apparié en termes de dose, de voie ou d'exposition. Par conséquent, le régime répété de fomépizole par voie intrapéritonéale et la dose unique d'éthanol par voie orale constituaient une comparaison pharmacologique inégale. Une administration réussie par gavage a été confirmée par l'absence de régurgitation, de fuite buccale ou de détresse respiratoire pendant la procédure. Une administration intrapéritonéale réussie a été confirmée par l'absence de fuite, d'hémorragie ou d'enflure marquée au site d'injection.

Après l'administration, les animaux ont été régulièrement surveillés quant à leur état de santé général, leur mobilité, leur ingestion alimentaire, leur posture, l'apparence de leur pelage et les signes de toxicité. Le schéma thérapeutique a été conçu pour permettre l'initiation de la formation de métabolites toxiques à partir du méthanol, tout en permettant l'évaluation des effets protecteurs et thérapeutiques des agents antidotiques.

Euthanasie, critères d'arrêt humanitaires et prélèvement d'échantillons
Tout au long de l'expérience, tous les animaux ont été évalués quotidiennement quant à leur état de santé général, leur ingestion de nourriture et d'eau, leur mobilité et leurs changements comportementaux. Les critères d'arrêt humanitaires étaient prédéfinis comme une léthargie marquée, l'incapacité à consommer de la nourriture ou de l'eau, une perte de poids sévère, une mobilité restreinte, une posture anormale, une piloérection persistante ou des signes évidents de détresse. Les animaux remplissant l'un de ces critères devaient être euthanasiés de manière humanitaire. Toutefois, aucun animal n'a atteint les critères d'arrêt humanitaires prédéfinis durant l'étude.

Tous les animaux des cinq groupes expérimentaux ont été euthanasiés au dixième jour de l'étude. Pour les groupes MTX + méthanol, MTX + méthanol + fomépizole et MTX + méthanol + éthanol, ce point final correspondait à 48 h après l'administration unique de méthanol au huitième jour de l'étude. Le groupe témoin est resté non traité jusqu'au dixième jour de l'étude, tandis que le groupe MTX seul a été surveillé jusqu'au dixième jour suivant l'achèvement du protocole d'administration de MTX sur 7 jours. Ainsi, les cinq groupes présentaient une durée totale d'étude identique et ont subi l'euthanasie et le prélèvement d'échantillons le même jour de l'étude.

La kétamine et le xylazine ont été utilisées pour induire une anesthésie profonde. La profondeur de l'anesthésie a été confirmée par la disparition du réflexe de retrait podal. Une fois l'anesthésie profonde obtenue, des échantillons sanguins ont été prélevés par ponction intracardiaque. Environ 3 à 5 mL de sang ont été recueillis à l’aide d’une seringue et d’une aiguille adaptées. Le sang prélevé pour la mesure des concentrations sériques d’urée et de créatinine, de l’activité sérique de la SOD et de la concentration sérique de MDA a été transféré dans des tubes sans anticoagulant et laissé coaguler complètement. Le sang destiné à la mesure du taux de GSH et de l’activité de la CAT a été recueilli séparément dans des tubes contenant de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et traité sans étape de coagulation. Après la formation complète du caillot, les échantillons sériques ont été centrifugés à 3 000 × g pendant 10 à 15 minutes à 4 °C. Le sérum séparé a été stocké à −80 °C jusqu’à l’analyse. La séparation réussie du sérum a été confirmée par un aspect clair et non hémolyse. Après le prélèvement sanguin, l’euthanasie a été réalisée par exsanguination sous anesthésie profonde. Une laparotomie médiane a ensuite été effectuée, et les deux reins ont été soigneusement retirés. Après élimination des tissus graisseux et conjonctifs environnants, les reins ont été rincés avec une solution saline physiologique froide. Les échantillons tissulaires ont été divisés pour des analyses histopathologiques et biochimiques. Les échantillons destinés à l’examen histopathologique ont été placés dans du formaldéhyde tamponné neutre à 10 %. Les échantillons destinés aux analyses biochimiques ont été étiquetés correctement et stockés à −80 °C.

La collecte des échantillons, les analyses biochimiques et les évaluations des résultats ont été effectuées par des chercheurs en aveugle par rapport aux groupes expérimentaux. Aucun animal n’a été exclu des analyses.

Analyses biochimiques
La concentration sérique en urée a été mesurée à l’aide d’un dosage cinétique enzymatique uréase–glutamate déshydrogénase sur un analyseur biochimique automatisé. L’urée est hydrolysée par l’uréase pour produire de l’ammoniac, qui réagit ensuite avec le 2-oxoglutarate et le nicotinamide adénine dinucléotide réduit (NADH) en présence de la glutamate déshydrogénase. La diminution de l’absorbance résultant de la consommation de NADH a été mesurée de manière cinétique. La concentration sérique en créatinine a été mesurée par méthode colorimétrique à l’aide du même analyseur biochimique automatisé.

L'activité de la superoxyde dismutase (SOD) sérique a été déterminée à l'aide d'un dosage colorimétrique basé sur la génération de radicaux superoxyde par le système xanthine–xanthine oxydase et leur réaction avec le chlorure de 2-(4-iodophényl)-3-(4-nitrophényl)-5-phényltétrazolium pour former un produit formazan coloré. L'absorbance finale a été mesurée à 505 nm. La concentration de malondialdéhyde (MDA) sérique a été déterminée par la réaction à l'acide thiobarbiturique. Les échantillons sériques ont été mélangés avec de l'acide trichloroacétique froid afin de précipiter les protéines, puis centrifugés à 7 500 × g pendant 5 min à 4 °C. Le surnageant obtenu a été mélangé avec un volume égal d'acide thiobarbiturique et incubé à 90 °C pendant 60 min. Les tubes de réaction ont ensuite été refroidis dans un bain d'eau froide pendant 10 min, et l'absorbance a été mesurée à 532 nm. Les concentrations de MDA ont été calculées à partir de la courbe d'étalonnage correspondante. Le glutathion réduit (GSH) a été dosé dans le sang anticoagulé à l'EDTA selon une méthode d'Ellman modifiée. Après précipitation des protéines par l'acide trichloroacétique, les échantillons déprotéinisés ont été réagis avec le 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoïque) dans un tampon Tris 500 mM à pH 8,2, et l'absorbance a été mesurée à 412 nm. L'activité de la catalase (CAT) a été mesurée dans le sang anticoagulé à l'EDTA à l'aide d'un dosage colorimétrique en deux étapes. Les échantillons ont été incubés avec une quantité connue de peroxyde d'hydrogène, puis, après arrêt de la réaction enzymatique, le peroxyde d'hydrogène résiduel a été mesuré à l'aide d'un réactif chromogène à 405 nm.

Étant donné que l'activité de la SOD et la concentration de MDA ont été mesurées dans le sérum, et que le taux de GSH et l'activité de la CAT ont été mesurées dans du sang anticoagulé à l'EDTA plutôt que dans des homogénats de tissu rénal, la normalisation de ces paramètres liés au redox par rapport à la concentration totale de protéines tissulaires n'était pas applicable. Pour l'interprétation du profil des biomarqueurs liés au redox, des concentrations sériques plus élevées de MDA ont été considérées comme cohérentes avec une peroxydation lipidique accrue, tandis que des activités sériques plus faibles de la SOD, des taux sanguins plus bas de GSH et une activité catécholaminergique sanguine réduite ont été considérés comme indicatifs d'une capacité antioxydante diminuée ; des changements en sens inverse ont été interprétés comme un profil lié au redox plus favorable.

Pour les mesures par dosage immunoenzymatique (ELISA) sur tissu rénal, environ 50 mg de tissu rénal conservé à −80 °C ont été homogénéisés sur glace dans 500 µL de tampon d'homogénéisation contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéases, ce qui correspond à un rapport fixe tissu/tampon de 1:10 (p/v). Un homogénat de tissu rénal spécifique à chaque animal a été préparé pour chaque rat. Les échantillons provenant d'animaux différents ont été traités indépendamment et n'ont été regroupés à aucune étape. Les homogénats ont été centrifugés à 14 000 × g pendant 10 min à 4 °C, et les surnageants obtenus pour chaque animal ont été recueillis séparément puis divisés en aliquotes destinées aux analyses rénales prévues. La concentration totale en protéines n'a pas été mesurée séparément ; par conséquent, les résultats d'ELISA sur tissu n'ont pas été normalisés par rapport à celle-ci. Les concentrations finales, calculées à partir des courbes standards spécifiques à chaque test, ont été exprimées en ng/L pour le TNF-α et l'IL-6, et en ng/mL pour l'IL-1β, la KIM-1 et la cystatine C.

La molécule-1 d'agression rénale (KIM-1) et la cystatine C ont été évaluées comme biomarqueurs de lésion rénale, tandis que le facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α), l'interleukine-6 (IL-6) et l'interleukine-1β (IL-1β) ont été évalués comme marqueurs inflammatoires rénaux. Les cinq analytes ont été dosés dans des homogénats de tissu rénal à l'aide de kits ELISA spécifiques au rat, conformément aux protocoles des fabricants. Pour les dosages respectifs, les sensibilités analytiques et les plages de mesure étaient de 2,51 ng/L et 5–1 000 ng/L pour le TNF-α, 0,052 ng/L et 0,1–40 ng/L pour l'IL-6, 0,08 ng/mL et 0,2–60 ng/mL pour l'IL-1β, 0,01 ng/mL et 0,05–10 ng/mL pour la KIM-1, et 0,25 ng/mL et 0,5–100 ng/mL pour la cystatine C, respectivement. Avant l'analyse, tous les réactifs, étalons et surnageants de tissu rénal ont été portés à température ambiante. Des courbes standards ont été établies séparément pour chaque série d'analyse selon les recommandations du fabricant. Les étalons et les surnageants de tissu rénal ont été ajoutés dans des puits prérecouverts d'anticorps, suivis par l'anticorps de détection biotinylé correspondant et le conjugué streptavidine-peroxydase de raifort. Les échantillons et les réactifs ELISA ont été incubés pendant 1 heure à 37 °C. Après cinq cycles de lavage à l'aide d'un laveur automatique de microplaques, les solutions de substrat A et B ont été ajoutées et incubées pendant 10 minutes à 37 °C. La réaction colorimétrique a été arrêtée à l'aide d'une solution acide d'arrêt, et l'absorbance a été mesurée à 450 nm. Pour chaque analyte, les valeurs d'absorbance corrigées du blanc ont été converties en concentrations à l'aide de la courbe standard spécifique au dosage correspondant.

Toutes les analyses biochimiques ont été réalisées dans des conditions standardisées, et tous les échantillons ont été traités selon les mêmes procédures. Les mesures par ELISA sur les tissus rénaux ont été effectuées en double. Pour chaque analyte, la moyenne des deux puits en réplicat technique a été calculée afin d'obtenir une valeur par animal. Les puits en réplicat technique et les aliquotes séparées provenant de l'homogénat spécifique à un même animal n'ont pas été considérés comme des observations indépendantes. L'animal individuel a été considéré comme l'unité expérimentale, et un résultat par animal pour chaque paramètre a été inclus dans l'analyse statistique.

Transformation histopathologique et évaluation lésionnelle rénale
Les échantillons de tissus ont été préparés pour l'analyse microscopique selon des procédures histopathologiques standard. Les tissus rénaux ont été fixés dans du formaldéhyde tamponné neutre à 10 % à température ambiante pendant 72 h. Après la fixation, les tissus ont été déshydratés à l'aide d'une série d'éthanol aux concentrations croissantes de 50 %, 70 %, 80 %, 96 % et 100 %, chaque concentration étant maintenue pendant 1 h. Ensuite, les tissus ont été clarifiés selon une procédure en deux étapes utilisant le xylène, puis inclus dans des blocs de paraffine. Des coupes de 5 µm d'épaisseur ont été obtenues à partir des blocs de paraffine à l'aide d'un microtome rotatif.

Pour la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine, les coupes ont été déparaffinisées et réhydratées, puis colorées à l'hématoxyline pendant 5 min, suivies d'un rinçage à l'eau courante pendant 5 min. Une différenciation a été effectuée à l'aide d'alcool acide, après quoi les coupes ont été maintenues dans de l'eau ammoniacale pendant 1 min. Ensuite, les coupes ont été contre-colorées à l'éosine pendant 2 min. Puis, elles ont été déshydratées à l'aide d'une série alcoolique ascendante, clarifiées dans le xylène et montées avec un milieu de montage approprié.

Pour la coloration trichrome de Masson, les sections ont été déparaffinisées et réhydratées, puis incubées dans une solution de mordant à 56 °C pendant 60 min et lavées à l’eau courante pendant 10 min. Les sections ont ensuite été traitées successivement avec l’hématéine ferrique de Weigert pendant 10 min, le rouge Biebrich-fuchsine acide pendant 15 min, l’acide phosphotungstique pendant 10 min, puis l’aniline bleue pendant 10 min. Enfin, les sections ont été maintenues dans de l’acide acétique à 1 % pendant 5 min, déshydratées, clarifiées dans le xylène et montées.

La réussite de la coloration a été confirmée par une coloration nucléaire nette, un contraste cytoplasmique préservé, le maintien de l'architecture rénale et une visualisation distincte des structures du tissu conjonctif. Toutes les lames colorées ont été évaluées dans des conditions standardisées à l'aide d'un microscope optique équipé d'un système d'imagerie numérique.

Les évaluations histopathologiques ont été réalisées par un seul pathologiste expérimenté, aveugle quant aux groupes expérimentaux. La notation histopathologique a été effectuée à un grossissement de 200×. Pour chaque animal et chaque paramètre histopathologique, 10 champs microscopiques choisis au hasard ont été examinés. Le champ présentant l'altération la plus sévère pour le paramètre évalué a été utilisé pour attribuer au sujet un score entier unique sur une échelle de 0 à 4. Les lésions tubulaires ont été évaluées en fonction de la dilatation tubulaire, de l'accumulation de matériel protéique dans la lumière tubulaire, de la dégénérescence de l'épithélium tubulaire et de la nécrose tubulaire. Les lésions glomérulaires ont été évaluées selon la dégénérescence ou l'atrophie glomérulaire, l'élargissement de l'espace de Bowman et la congestion vasculaire. Les lésions interstitielles ont été évaluées en fonction de l'inflammation et de la fibrose interstitielles. Des coupes rénales de 5 µm, colorées à l'hématoxyline-éosine et à la trichrome de Masson, provenant de chaque animal, ont été utilisées pour l'évaluation histopathologique. Des photomicrographies représentatives ont été obtenues à un grossissement de 200×, avec des barres d'échelle représentant 100 µm. Le nombre de coupes histologiques distinctes examinées par animal n'a pas pu être retrouvé dans les dossiers de l'étude et ne peut donc pas être indiqué.

Les résultats de la trichromie de Masson ont été interprétés selon une analyse histomorphologique, en tenant compte de la localisation et du motif morphologique du dépôt de collagène, plutôt que de l'intensité de la coloration bleue seule. Le score semi-quantitatif de fibrose interstitielle était fondé sur cette évaluation histomorphologique, et le pourcentage de surface positive au collagène n’a pas été quantifié. L’évaluation histopathologique a été réalisée de manière semi-quantitative en utilisant des critères d’évaluation des lésions rénales décrits précédemment^16,17. Chaque animal s’est vu attribuer un score entier pour chaque paramètre histopathologique sur une échelle de 0 à 4, où 0 = absent, 1 = minimal, 2 = léger, 3 = modéré et 4 = sévère. Les catégories de notation reflétaient l’évaluation globale, en aveugle, de la sévérité morphologique de chaque lésion par le pathologiste, plutôt qu’une mesure morphométrique continue.

Précautions de sécurité et gestion des déchets
Des équipements de protection individuelle appropriés ont été utilisés lors de la manipulation du méthanol, du formaldéhyde, du xylène, d'échantillons biologiques et de tissus animaux. Des blouses de laboratoire, des gants et une protection oculaire ont été portés. En raison de la toxicité systémique et de la volatilité du méthanol, toutes les manipulations ont été effectuées avec précaution. Les procédures impliquant le formaldéhyde et le xylène ont été réalisées sous une hotte de chimie chaque fois que possible. Les objets tranchants ont été collectés dans des conteneurs appropriés pour déchets piquants. Les déchets chimiques et les matériaux biologiques ont été éliminés conformément aux procédures institutionnelles de biosécurité et de gestion des déchets dangereux.

Analyse statistique
Les variables biochimiques continues, les biomarqueurs de lésion rénale, les paramètres inflammatoires, la fonction rénale et les variables liées au redox ont été exprimées sous la forme moyenne ± écart-type (moyenne ± SD). La normalité de la distribution des données a été évaluée à l’aide du test de Shapiro–Wilk, et l’homogénéité des variances a été analysée par le test de Levene. Les comparaisons entre groupes pour les résultats biochimiques ont été effectuées par une analyse de variance à un facteur (ANOVA). Les vérifications des hypothèses ont révélé un écart par rapport à la normalité dans un groupe pour la créatinine sérique, ainsi qu’une hétérogénéité des variances pour plusieurs résultats biochimiques. L’approche ANOVA initiale a été conservée ; toutefois, ces écarts pourraient avoir affecté la fiabilité des valeurs p- obtenues, et les résultats ont donc été interprétés avec prudence.

Lorsqu'une différence statistiquement significative était détectée par ANOVA, des comparaisons par paires entre les groupes étaient effectuées à l'aide du test de comparaison multiple a posteriori de Duncan. Les valeurs partageant la même lettre en exposant au sein de chaque ligne ne différaient pas de manière significative selon le test a posteriori de Duncan. Aucun ajustement supplémentaire pour la multiplicité n'a été appliqué aux résultats biochimiques. La procédure de Duncan ne permettait pas un contrôle rigoureux du taux d'erreur de type I global, et l'analyse de multiples résultats augmentait davantage le risque de résultats faussement positifs. Par conséquent, les comparaisons significatives individuelles ont été interprétées avec prudence.

Les tailles d'effet globales pour les résultats biochimiques ont été estimées à l'aide de l'eta-carré (η²), calculé selon la formule (F × df_between)/(F × df_between + df_error), avec df_between = 4 et df_error = 25. Les intervalles de confiance bilatéraux à 95 % ont été calculés en inversant la distribution F non centrale et en transformant les limites de non-centralité (λ) selon λ/(λ + N), où N = 30. Ces calculs supplémentaires ont été effectués à l'aide d'un environnement de calcul scientifique. Les estimations ont été obtenues à partir des statistiques F arrondies issues de l'analyse statistique principale et étaient donc approximatives. Les intervalles de confiance reposaient sur les hypothèses de normalité et d'homogénéité des variances du modèle ANOVA et n'ont pas été ajustés pour tenir compte de multiples résultats.

Les scores histopathologiques étaient des observations ordinales et semi-quantitatives, résumées de manière descriptive par la moyenne ± écart-type afin d'illustrer la charge moyenne des lésions au niveau du groupe et la variabilité entre les animaux. Aucun test d'inférence hypothétique ni aucune comparaison par paires a posteriori n'a été effectué pour les scores histopathologiques. Par conséquent, l'ANOVA, le test a posteriori de Duncan et la présentation des valeurs p ont été appliqués uniquement aux résultats biochimiques, aux biomarqueurs de lésion rénale, aux paramètres inflammatoires, à la fonction rénale et aux résultats liés au redox. Une valeur p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Résultats

All 30 animals were included in the analyses, with six animals in each of the five experimental groups. All animals in the five groups were euthanized and sampled on study day 10. For the three methanol-exposed groups, this endpoint corresponded to 48 h after methanol administration. Therefore, the total study duration and sample collection time were consistent across all experimental groups. Renal injury and inflammatory biomarkers, renal function and redox-related parameters, and histopathological findings were evaluated as described below.

Biochemical findings: renal injury and inflammatory biomarkers
The findings for renal injury and inflammatory biomarkers measured in kidney tissue homogenates are presented in Table 1. One-way ANOVA indicated significant overall differences among the five groups in cystatin C [F(4,25) = 5.329, p = 0.003], IL-6 [F(4,25) = 3.907, p = 0.013], KIM-1 [F(4,25) = 3.673, p = 0.017], TNF-α [F(4,25) = 7.660, p < 0.001], and IL-1β [F(4,25) = 11.584, p < 0.001]. Post hoc group comparisons were performed using Duncan’s multiple range test, with group assignments indicated by superscript letters in Table 1. Kidney tissue homogenate levels of cystatin C, IL-6, and KIM-1 were highest in the MTX + Methanol group, whereas no significant differences were observed among the Control, MTX-only, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol groups for these variables. Kidney tissue homogenate levels of TNF-α and IL-1β were also highest in the MTX + Methanol group. The MTX-only group showed higher levels of TNF-α and IL-1β in kidney tissue homogenates than the Control group, whereas the antidote-treated groups showed intermediate values (Table 1).

Renal function and redox-related parameters
Serum renal function indices and blood-derived redox-related parameters were presented in Table 2. One-way ANOVA indicated significant overall differences among the five groups in serum urea [F(4,25) = 3.694, p = 0.017], serum creatinine [F(4,25) = 12.988, p < 0.001], serum SOD activity [F(4,25) = 11.621, p < 0.001], blood GSH level [F(4,25) = 10.164, p < 0.001], blood CAT activity [F(4,25) = 10.631, p < 0.001], and serum MDA concentration [F(4,25) = 8.814, p < 0.001]. Post hoc group comparisons were performed using Duncan’s multiple range test, with group assignments indicated by superscript letters in Table 2.

Serum urea, serum creatinine, and serum MDA concentrations were highest in the MTX + Methanol group. Serum urea and serum MDA concentrations did not differ significantly among the Control, MTX-only, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol groups, whereas serum creatinine was lowest in the Control group (Table 2).

The MTX + Methanol group also showed the lowest serum SOD activity, blood GSH level, and blood CAT activity. Compared with the MTX + Methanol group, the fomepizole-treated group showed significantly higher serum SOD and blood CAT activities, whereas the corresponding increases in the ethanol-treated group were not statistically significant. Blood GSH levels did not differ significantly among the MTX-only, MTX + Methanol, and two antidote-treated groups (Table 2).

Compared with the Control group, the MTX-only group showed higher kidney tissue homogenate levels of TNF-α and IL-1β and lower serum SOD activity, blood GSH level, and blood CAT activity but did not differ significantly in kidney tissue homogenate levels of cystatin C, IL-6, or KIM-1 or in serum urea, serum creatinine, or serum MDA concentration.

Histopathological findings and renal injury scores
The results of the histopathological evaluation of renal tissues were presented in Table 3. Descriptive variation among the groups was observed in tubular dilatation, accumulation of proteinaceous material, tubular epithelial degeneration, tubular necrosis, glomerular degeneration, enlargement of Bowman’s space, vascular congestion, interstitial inflammation, and interstitial fibrosis.

In the Control group, renal tissue preserved normal histological architecture, with no evident pathological alterations in the glomerular or tubular structures. In the MTX group, mild tubular degeneration, vascular congestion, and interstitial inflammation were observed.

The MTX + Methanol group showed the highest observed injury scores across the evaluated tubular, glomerular, vascular, and interstitial parameters. Both antidote-treated groups showed descriptively lower observed scores than the MTX + Methanol group. In descriptive comparisons, the fomepizole-treated group showed lower observed scores than the ethanol-treated group for most parameters, particularly tubular dilatation, tubular necrosis, glomerular degeneration, enlargement of Bowman’s space, vascular congestion, and interstitial fibrosis (Table 3). These comparisons were descriptive, and no inferential statistical tests were performed on the histopathological scores. Representative renal histopathological images obtained using hematoxylin and eosin and Masson’s trichrome staining are shown in Figure 2.

Overall, the MTX + Methanol group showed the highest renal injury and inflammatory biomarker values, the least favorable renal function and redox profiles, and the highest histopathological injury scores. Both antidote-treated groups showed more favorable renal outcome patterns than the MTX + Methanol group, with the fomepizole-treated group showing a more consistently favorable pattern across the evaluated domains. The MTX-only group also showed changes in selected inflammatory and redox-related parameters relative to the Control group.

DATA AVAILABILITY:
The animal-level raw data supporting the biochemical, renal injury biomarker, inflammatory, renal function, and redox-related analyses are provided in Supplementary File 1.

Figure 1: Experimental design and treatment timeline. Schematic representation of the experimental rat model of methanol intoxication. Adult male Wistar albino rats were assigned to five groups: Control, methotrexate (MTX) only, MTX + Methanol, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol (n = 6/group). Standard pellet chow and tap water were available ad libitum throughout the 10-day study, and no fasting or other food or water restrictions were imposed before or after methanol administration. The Control group received no experimental treatment. Animals in Groups 2–5 received MTX by oral gavage at 0.3 mg/kg once daily for seven consecutive days (study days 1–7). Animals in Groups 3–5 received a single dose of methanol at 3 g/kg by oral gavage on study day 8. In the MTX + Methanol + Fomepizole group, an intraperitoneal loading dose of fomepizole at 15 mg/kg was administered 4 h after methanol administration, followed by maintenance doses of 10 mg/kg at 12, 24, and 36 h. In the MTX + Methanol + Ethanol group, ethanol was administered as a single dose of 0.5 g/kg by oral gavage 4 h after methanol administration. All animals were euthanized on study day 10. For Groups 3–5, this endpoint corresponded to 48 h after methanol administration. Blood and kidney samples were collected for analyses of renal function, renal injury biomarkers, inflammatory cytokines, redox-related biomarkers, and renal histopathology. Abbreviations: MTX = methotrexate. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2: Representative histopathological findings in renal tissue from experimental groups. Representative kidney sections from the Control, MTX, MTX + Methanol, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol groups are shown. The upper row presents hematoxylin and eosin (H&E) staining, whereas the lower row presents Masson’s trichrome staining. The Control group exhibited preserved renal architecture with normal glomerular and tubular morphology. The blue-stained collagen observed in the glomerular and tubular basement membranes, vascular walls, and interstitial connective tissue of the Control group was considered physiological collagen rather than evidence of pathological fibrosis. The MTX group showed mild tubular degeneration, vascular congestion, and inflammatory changes. The MTX + Methanol group exhibited more pronounced renal injury, characterized by tubular degeneration (*), vascular congestion (+), widening of Bowman’s space (x), tubular necrosis (↑), interstitial inflammation (↕), and periglomerular collagen accumulation consistent with a histomorphological fibrotic change (‡), as observed in the Masson’s trichrome-stained section. The Fomepizole-treated group showed lower histopathological injury scores than the MTX + Methanol group, with relatively preserved tubular and glomerular structures and less extensive necrosis, inflammation, vascular congestion, and collagen-associated changes. The Ethanol-treated group also showed lower histopathological injury scores than the MTX + Methanol group; however, residual tubular, glomerular, and vascular alterations were more apparent than in the Fomepizole-treated group. Photomicrographs were obtained at 200× magnification, and scale bars represent 100 µm. Masson’s trichrome staining was evaluated as supportive histomorphological evidence; differences in the intensity of blue staining among the panels were not used as a quantitative measure for intergroup comparison of fibrosis. Symbols: * tubular degeneration; + vascular congestion; x widening of Bowman’s space; ↑ tubular necrosis; ↕ interstitial inflammation; ‡ periglomerular collagen accumulation consistent with a histomorphological fibrotic change. MTX, methotrexate. Please click here to view a larger version of this figure.

Variable	Control (n = 6)	MTX (n = 6)	MTX + Methanol (n = 6)	MTX + Methanol + Fomepizole (n = 6)	MTX + Methanol + Ethanol (n = 6)	p	η² (95% CI)
Cystatin C (ng/mL)	26.07 ± 12.05a	32.01 ± 1.86a	45.23 ± 10.51b	32.49 ± 1.60a	31.27 ± 4.60a	0.003	0.460 (0.084 – 0.597)
IL-6 (ng/L)	7.66 ± 1.38a	8.72 ± 2.45a	11.02 ± 0.83b	7.96 ± 1.54a	8.12 ± 1.77a	0.013	0.385 (0.023 – 0.535)
KIM-1 (ng/mL)	2.21 ± 1.00a	2.47 ± 0.24a	3.45 ± 0.81b	2.28 ± 0.58a	2.32 ± 0.37a	0.017	0.370 (0.013 – 0.522)
TNF-α (ng/L)	118.66 ± 22.95a	190.51 ± 5.84b	238.29 ± 34.68c	147.10 ± 24.31ab	168.41 ± 75.41ab	<0.001	0.551 (0.181 – 0.668)
IL-1β (ng/mL)	8.43 ± 0.59a	12.53 ± 1.05c	15.26 ± 1.46d	10.05 ± 2.86ab	11.17 ± 2.37bc	<0.001	0.650 (0.316 – 0.743)

Table 1: Renal injury and inflammatory biomarkers in experimental groups. Data are presented as mean ± standard deviation (SD), with six animals per group. All biomarkers were measured in kidney tissue homogenates. Cystatin C, KIM-1, and IL-1β concentrations are expressed in ng/mL; IL-6 and TNF-α concentrations are expressed in ng/L. Reported p values are from omnibus one-way analysis of variance (ANOVA) across the five groups. Following a significant omnibus test, post hoc comparisons were performed using Duncan’s multiple range test. Within each row, groups sharing at least one superscript letter do not differ significantly, whereas groups with no letter in common differ significantly at the 0.05 level. No additional multiplicity adjustment was applied across biomarkers. Variance heterogeneity was identified among some biomarkers; therefore, the ANOVA and Duncan results should be interpreted with caution. Abbreviations: MTX = methotrexate; KIM-1 = kidney injury molecule-1; IL-6 = interleukin-6; TNF-α = tumor necrosis factor-alpha; IL-1β = interleukin-1 beta; SD = standard deviation; ANOVA = analysis of variance; CI = confidence interval. η² represents the overall effect size across the five groups. The two-sided 95% confidence intervals are model-based, assume normally distributed errors with equal variances, and are not adjusted for multiple outcomes. Therefore, the confidence intervals should be interpreted cautiously where these assumptions are violated.

Variable	Control	MTX	MTX + Methanol	MTX + Methanol + Fomepizole	MTX + Methanol + Ethanol	p	η² (95% CI)
Serum urea (mg/dL)	39.64 ± 13.69a	46.88 ± 9.49a	98.75 ± 59.24b	48.03 ± 19.64a	60.44 ± 18.53a	0.017	0.371 (0.014–0.523)
Serum creatinine (mg/dL)	0.50 ± 0.10a	0.54 ± 0.05ab	0.72 ± 0.03c	0.54 ± 0.03ab	0.60 ± 0.05b	<0.001	0.675 (0.356–0.762)
Serum SOD activity (U/mL)	470.40 ± 40.49d	371.16 ± 17.64c	219.29 ± 85.06a	319.38 ± 107.20bc	256.22 ± 67.89ab	<0.001	0.650 (0.317–0.743)
Blood GSH (mmol/L)	58.74 ± 31.90b	26.36 ± 5.92a	11.10 ± 3.73a	19.56 ± 1.66a	13.66 ± 5.32a	<0.001	0.619 (0.272–0.720)
Blood CAT activity (U/mL)	220.82 ± 74.08c	160.88 ± 55.18b	68.90 ± 13.41a	129.45 ± 7.49b	110.14 ± 20.18ab	<0.001	0.630 (0.287–0.728)
Serum MDA (nmol/mL)	13.17 ± 2.03a	17.29 ± 6.36a	31.83 ± 9.94b	17.93 ± 2.04a	19.34 ± 4.65a	<0.001	0.585 (0.225–0.694)

Table 2: Renal function and redox-related parameters in experimental groups. Data are presented as mean ± standard deviation (SD), with six animals per group. Serum urea, serum creatinine, superoxide dismutase (SOD) activity, and malondialdehyde (MDA) concentration were measured in serum, whereas reduced glutathione (GSH) level and catalase (CAT) activity were measured in blood anticoagulated with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). Serum urea and creatinine concentrations are expressed in mg/dL, SOD and CAT activities in U/mL, GSH levels in mmol/L, and MDA concentrations in nmol/mL. Reported p values are from omnibus one-way analysis of variance (ANOVA) across the five groups. Following a significant omnibus test, post hoc comparisons were performed using Duncan’s multiple range test. Within each row, groups sharing at least one superscript letter do not differ significantly, whereas groups with no letter in common differ significantly at the 0.05 level. No additional multiplicity adjustment was applied across biomarkers. Variance heterogeneity was identified for some outcomes; therefore, the ANOVA and Duncan results should be interpreted cautiously. The redox-related biomarkers are indirect indicators and do not constitute direct measurements of mitochondrial function or molecular mechanisms of injury. η² represents the overall effect size across the five groups. The two-sided 95% confidence intervals are model-based, assume normally distributed errors with equal variances, and are not adjusted for multiple outcomes. Therefore, the confidence intervals should be interpreted cautiously where these assumptions are violated. Abbreviations: MTX = methotrexate; SOD = superoxide dismutase; GSH = reduced glutathione; CAT = catalase; MDA = malondialdehyde; EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid; SD = standard deviation; ANOVA = analysis of variance; CI = confidence interval.

Variable	Control	MTX	MTX + Methanol	MTX + Methanol  + Fomepizole	MTX + Methanol + Ethanol
Tubular dilatation	0.16 ± 0.40	1.50 ± 0.54	3.50 ± 0.54	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Proteinaceous material accumulation	0.00 ± 0.00	1.33 ± 0.51	3.16 ± 0.40	0.66 ± 0.51	1.33 ± 0.51
Tubular epithelial degeneration	0.16 ± 0.40	1.83 ± 0.40	3.83 ± 0.40	1.00 ± 0.00	2.00 ± 0.00
Tubular necrosis	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	3.33 ± 0.51	0.83 ± 0.40	1.33 ± 0.51
Glomerular degeneration	0.16 ± 0.40	1.33 ± 0.51	3.33 ± 0.51	1.00 ± 0.00	1.66 ± 0.51
Bowman's space enlargement	0.00 ± 0.00	1.16 ± 0.40	3.00 ± 0.00	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Vascular congestion	0.00 ± 0.00	1.33 ± 0.51	3.16 ± 0.40	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Interstitial inflammation	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	3.00 ± 0.63	0.83 ± 0.40	1.16 ± 0.40
Interstitial fibrosis	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	2.83 ± 0.40	0.66 ± 0.51	1.16 ± 0.40

Table 3: Descriptive histopathological scores in experimental groups. Data are presented descriptively as mean ± standard deviation (SD), with six animals per group. Histopathological scores were obtained from kidney sections stained with hematoxylin and eosin (H&E) and Masson’s trichrome; the scores are dimensionless. Each animal was assigned one integer score for each histopathological parameter on a scale of 0–4, where 0 = absent, 1 = minimal, 2 = mild, 3 = moderate, and 4 = severe. The decimal values presented in the table represent the arithmetic means of the individual integer scores obtained from the six animals in each experimental group and do not represent scores assigned to individual animals or a continuous scoring system. The standard deviations represent between-animal variability within each group. No inferential statistical testing or post hoc pairwise comparisons were performed on the histopathological scores; therefore, the observed between-group patterns should be interpreted descriptively rather than as statistically significant differences. Histopathological evaluation included tubular dilatation, proteinaceous material accumulation, tubular epithelial degeneration, tubular necrosis, glomerular degeneration, enlargement of Bowman’s space, vascular congestion, interstitial inflammation, and interstitial fibrosis.

Supplementary File 1: Raw data supporting the biochemical analyses. This spreadsheet contains the animal-level raw values used for the biochemical, renal injury biomarker, inflammatory, and redox-related analyses reported in the manuscript. Please click here to download this file.

Discussion

La principale découverte de cette étude était que le groupe MTX + méthanol présentait le profil de lésion rénale le plus défavorable, tant sur les plans fonctionnel, inflammatoire, redox et histopathologique. Ce groupe affichait les concentrations les plus élevées d'urée sérique, de créatinine sérique, de cystatine C rénale, de KIM-1, de TNF-α, d'IL-6, d'IL-1β et de MDA, ainsi que les activités les plus faibles de la SOD, les taux les plus bas de GSH et une activité réduite de la CAT, accompagnés des scores histopathologiques de lésion les plus élevés observés. Les deux groupes traités par antidote présentaient des profils rénaux plus favorables que le groupe MTX + méthanol, le groupe traité par la fomépizole montrant un profil globalement plus cohérentment bénéfique dans les différents domaines évalués. Toutefois, ces résultats ont été obtenus chez un modèle de rat prétraité de façon aiguë par le MTX, avec des régimes d'antidotes inéquivalents : administration intrapéritonéale répétée de fomépizole versus une seule dose orale d'éthanol. Ces différences concernant la voie d'administration et la fréquence des doses limitent la comparaison directe de l'efficacité néphroprotectrice, et les profils observés ne permettent pas d'établir la supériorité de la fomépizole par rapport à l'éthanol. Le groupe MTX seul présentait des taux plus élevés de TNF-α et d'IL-1β, ainsi qu'une activité de la SOD, des taux de GSH et une activité de la CAT plus faibles que le groupe témoin, tandis que les concentrations rénales de cystatine C, d'IL-6, de KIM-1, d'urée sérique, de créatinine sérique et de MDA restaient statistiquement comparables entre les groupes. Ce profil indiquait que le prétraitement au MTX contribuait au profil inflammatoire et redox sous-jacent. En conséquence, les modifications supplémentaires observées dans le groupe MTX + méthanol survenaient sur un fond de prétraitement au MTX et ne pouvaient pas être attribuées uniquement au méthanol. En l'absence d'un groupe méthanol seul, la contribution indépendante du méthanol et les interactions potentielles entre le MTX et le méthanol n'ont pas pu être entièrement dissociées.

D'après la toxicologie établie du méthanol, l'accumulation de métabolites toxiques représentait un facteur plausible de lésion rénale. Le méthanol est métabolisé principalement dans le foie par l'ADH en formaldéhyde, puis en acide formique^1,3,18,19,20. Le rein aurait donc pu être affecté principalement par le formiate circulant et les troubles métaboliques systémiques qui en résultent, plutôt que par un métabolisme local étendu du méthanol. Toutefois, une contribution du métabolisme de l'alcool ou de l'aldehyde dans le tissu rénal ne pouvait être exclue, car les concentrations de méthanol, de formaldéhyde et de formiate, ainsi que l'activité rénale de l'ADH, n'ont pas été mesurées. L'acide formique inhibe la cytochrome c oxydase mitochondriale, compromettant ainsi la phosphorylation oxydative, réduisant la production d'ATP et induisant une hypoxie histotoxique ; ce processus peut aboutir à une acidose lactique, à une augmentation de la production d'espèces réactives de l'oxygène et à des lésions membranaires^1,2,3,19,20. Comparé au foie, qui est le principal site du métabolisme du méthanol, le rein pourrait être particulièrement sensible aux effets secondaires du formiate et aux troubles métaboliques systémiques. Les cellules épithéliales des tubules proximaux ont des besoins énergétiques élevés et sont particulièrement vulnérables au dysfonctionnement mitochondrial, au stress oxydatif et à l'altération de la microcirculation. Par conséquent, l'hypoxie, l'acidose métabolique et l'inflammation induites par le formiate pourraient contribuer à la lésion rénale^{2,8,9,21,22,23}. Des études cliniques ayant montré des associations entre l'insuffisance rénale aiguë et l'acidose métabolique, l'insuffisance respiratoire, la rhabdomyolyse, le sepsis et le dysfonctionnement multiviscéral suggèrent que la lésion rénale pourrait refléter la charge toxique systémique^8,9,10,21. La dégradation du formiate dépendante du folate étant plus rapide chez le rat que chez l'humain, cela constituait une limitation importante des modèles expérimentaux^1,11,12. Par conséquent, un traitement préalable par le méthotrexate a été utilisé afin de réduire l'élimination du formiate et d'augmenter la sensibilité à la toxicité du méthanol, plutôt que de reproduire l'ensemble des caractéristiques cliniques et métaboliques de l'intoxication humaine au méthanol.

Un dysfonctionnement rénal a été démontré par l'évaluation combinée de paramètres biochimiques classiques et de biomarqueurs de lésion rénale. Des concentrations élevées d'urée et de créatinine sériques dans le groupe MTX + méthanol ont confirmé une filtration rénale et une capacité excrétrice altérées. L'augmentation des taux rénaux de cystatine C et de KIM-1 suggérait qu'une lésion tubulaire accompagnait l'altération fonctionnelle. Étant donné l'association du KIM-1 avec une lésion des tubules proximaux, cette augmentation était compatible avec une dégénérescence épithéliale tubulaire, une dilatation et une nécrose^24,25. L'élévation des taux de cystatine C appuyait également la présence d'une fonction rénale altérée^26,27. Les niveaux plus faibles de ces biomarqueurs dans les groupes traités par le fomépizole ou l'éthanol suggéraient une atténuation de la lésion rénale, avec un profil plus régulier observé dans le groupe traité par le fomépizole. Le profil des biomarqueurs liés au redox était compatible avec un stress oxydatif comme facteur contributif possible à la lésion rénale, sans toutefois constituer une preuve d'un mécanisme confirmé. Le MDA est couramment utilisé comme indicateur de la peroxydation lipidique, tandis que le GSH contribue au maintien de l'homéostasie redox cellulaire^28,29. Dans les modèles expérimentaux d'intoxication au méthanol et de neuropathie optique associée au méthanol, le stress oxydatif, la peroxydation lipidique et la diminution de la capacité antioxydante ont également été associés à des lésions tissulaires^10,15,20. Une activité sérique plus faible de la SOD, des concentrations sériques plus élevées de MDA et des niveaux sanguins plus bas de GSH ainsi qu'une activité CAT réduite dans le groupe MTX + méthanol étaient compatibles avec une capacité antioxydante diminuée et une peroxydation lipidique accrue ; toutefois, ces mesures n'établissaient pas un mécanisme mitochondrial ou moléculaire sous-jacent. Des concentrations sériques plus faibles de MDA et une récupération partielle de l'activité sérique de la SOD et de la CAT sanguine dans les groupes traités par les antidotes étaient compatibles avec un profil plus favorable des biomarqueurs liés au redox, un profil plus régulièrement favorable étant observé dans le groupe traité par le fomépizole.

Des valeurs plus élevées de TNF-α, d'IL-6 et d'IL-1β dans le groupe MTX + méthanol étaient compatibles avec un profil rénal pro-inflammatoire. Étant donné que ces cytokines n'étaient pas spécifiques à une voie particulière et que le MTX lui-même était associé à des modifications de certains marqueurs inflammatoires sélectionnés, ces résultats soutiennent l'idée d'une inflammation comme facteur contributif possible, plutôt que comme mécanisme confirmé, de lésion rénale. Une dysfonction mitochondriale induite par l'acide formique, une hypoxie cellulaire et un stress oxydatif pourraient constituer la base de l'activation des voies inflammatoires ; par conséquent, le stress oxydatif et l'inflammation pourraient évoluer comme des processus mutuellement renforçant dans la toxicité du méthanol^1,2,3,15. Des modèles expérimentaux d'intoxication au méthanol ont rapporté des associations entre l'exposition au méthanol et l'infiltration de cellules inflammatoires, des lésions histopathologiques et une augmentation des niveaux de marqueurs pro-inflammatoires tels que l'IL-1β et le TNF-α^13,15. Ces résultats étaient cohérents avec l'augmentation des niveaux de cytokines pro-inflammatoires et des scores élevés d'inflammation interstitielle, de dégénérescence tubulaire et de nécrose tubulaire observés dans le groupe MTX + méthanol. Dans leur ensemble, ces résultats étaient compatibles avec un processus multifactoriel impliquant les effets des métabolites toxiques, le stress oxydatif, l'inflammation, une altération de la microcirculation et une charge toxique systémique ; toutefois, ces voies n'ont pas été évaluées directement. Des niveaux plus faibles de TNF-α, d'IL-6 et d'IL-1β dans les groupes traités par antidote suggéraient que l'inhibition de la formation de métabolites toxiques aurait également pu limiter la réponse inflammatoire. Les observations histopathologiques fournissaient des corrélats tissulaires de la lésion rénale, le groupe MTX + méthanol présentant les scores de lésion les plus élevés observés pour les paramètres tubulaires, glomérulaires, vasculaires et interstitiels. Les deux groupes traités par antidote présentaient des scores histopathologiques de lésion qualitativement plus faibles, et le groupe traité au fomépizole présentait des scores qualitativement inférieurs à ceux du groupe traité à l'éthanol pour la plupart des paramètres. Toutefois, comme aucun test statistique inférentiel n'a été réalisé sur les scores histopathologiques, ces observations n'ont pas permis d'établir une protection histopathologique statistiquement significative ni la supériorité d'un antidote par rapport à l'autre^16,17.

Les effets antidotiques de l'éthanol et de la fomépizole dans l'intoxication par le méthanol reposent sur la suppression du métabolisme médié par la déshydrogénase de l'alcool, réduisant ainsi la formation de formaldéhyde et d'acide formique. L'éthanol agit comme un substrat compétitif, tandis que la fomépizole fonctionne comme un inhibiteur direct et puissant de la déshydrogénase de l'alcool^{1,3,4,6,7,30,31,32}. Les profils d'issue rénale plus favorables observés dans les deux groupes traités par antidote étaient compatibles avec les effets attendus de l'inhibition de la déshydrogénase de l'alcool. Néanmoins, la littérature actuelle ne démontre pas de supériorité clinique définitive de la fomépizole par rapport à l'éthanol. Bien que la fomépizole soit souvent préférée en raison d'une administration plus simple, d'une pharmacocinétique prévisible et d'un profil d'effets indésirables plus faible, l'éthanol reste une alternative efficace^{1,3,4,6,7,30,32}. Dans les données d'intoxication massive par le méthanol rapportées par Zakharov et al., aucune différence claire n'a été observée entre les deux antidotes en ce qui concerne la mortalité, la durée des soins intensifs ou la nécessité de dialyse ; par conséquent, les interprétations concernant une supériorité clinique doivent être faites avec prudence⁵. Aucune différence directe statistiquement significative entre les groupes traités par fomépizole et par éthanol n'a été identifiée pour les résultats biochimiques à l'aide du test post hoc de Duncan. De plus, la fomépizole a été administrée en doses répétées, tandis que l'éthanol a été administré en une seule dose. Les régimes n'étaient pas appariés en termes de voie d'administration, de fréquence de dosage ou d'exposition systémique. Par conséquent, le profil descriptivement plus favorable associé à la fomépizole aurait pu refléter des différences dans le calendrier des doses, la voie d'administration ou l'exposition au médicament, en plus des différences entre les agents antidotiques, et n'a pas établi une efficacité biochimique supérieure, une supériorité clinique ou une préférence thérapeutique clinique^5,6,30,32. Un atout majeur de l'étude était l'évaluation intégrée de l'urée et de la créatinine sériques, de la cystatine C, de la KIM-1, des cytokines pro-inflammatoires, des biomarqueurs liés au redox et des scores histopathologiques à travers des domaines fonctionnels, tubulaires, inflammatoires, liés au redox et structuraux complémentaires. Ce modèle centré sur les lésions rénales pourrait fournir un cadre préclinique utile pour évaluer les régimes antidotiques, les interventions réno-protectrices adjuvantes et les biomarqueurs de lésions rénales dans des conditions de clairance réduite du formate dépendante du folate^8,9,10,21.

Plusieurs limites ont affecté l'interprétation. La généralisation directe à l'intoxication clinique par le méthanol était restreinte par le modèle animal expérimental et les différences métaboliques interspécifiques. Le méthotrexate peut indépendamment influencer les résultats rénaux, inflammatoires et oxydatifs³³, et l'absence d'un groupe témoigné au méthanol seul a empêché une séparation complète des effets du méthanol des interactions potentielles entre le MTX et le méthanol. Les concentrations sériques ou tissulaires de méthanol, de formaldéhyde, de formiate, d'éthanol et de fomépizole n'ont pas été mesurées, et l'activité de l'ADH dans la fraction cytosolique rénale brute n'a pas été évaluée ; par conséquent, la sensibilisation métabolique, la formation de métabolites toxiques, l'exposition à l'antidote et l'inhibition du métabolisme du méthanol n'ont pas pu être vérifiées directement, et des analyses de corrélation avec les résultats biochimiques rénaux n'ont pas pu être réalisées. Les paramètres acido-basiques, notamment le pH, le bicarbonate, l'excès de base et l'écart anionique, n'ont pas été mesurés. Le suivi de 48 h a permis d'évaluer uniquement les effets rénaux aigus, sans établir la récupération rénale, la persistance ou la réversibilité des lésions, ni les modifications structurelles chroniques. La coloration de Masson a été évaluée histomorphologiquement sans mesure quantitative de la surface positive au collagène, et les marqueurs moléculaires ou biochimiques de la fibrose, notamment l'expression de l'actine α du muscle lisse, la teneur en collagène et la concentration en 4-hydroxyproline, n'ont pas été analysés. L'évaluation histopathologique par un seul pathologiste, aveugle aux groupes, n'a pas permis d'évaluer l'accord inter-observateurs, et la gradation semi-quantitative des lésions est restée potentiellement sujette à une classification dépendante de l'observateur. Les régimes d'antidotes n'étaient pas pharmacologiquement équivalents ; les concentrations d'antidotes mesurées par ELISA dans le tissu rénal n'ont pas été normalisées à la concentration totale en protéines ; les analyses moléculaires de la fonction mitochondriale et des voies de mort cellulaire n'ont pas été réalisées ; la taille de l'échantillon était limitée ; et seuls des rats mâles ont été inclus. De futures études devraient inclure des groupes témoins au méthanol seul et au MTX seul, des régimes d'antidotes comparables, des mesures sériées des concentrations de méthanol, de formiate et d'antidotes, l'activité rénale de l'ADH, des mesures acido-basiques, une évaluation quantitative de la fibrose, un suivi plus long et une validation clinique correctement conçue. En conclusion, l'exposition au méthanol dans ce modèle de rat prétraité au méthotrexate a été associée à une fonction rénale altérée, à une augmentation des biomarqueurs de lésions rénales et inflammatoires, à un profil défavorable lié au redox et à des lésions histopathologiques. Les deux groupes traités par antidote ont montré des profils d'issue rénale plus favorables que le groupe MTX + méthanol. Le fomépizole a montré un profil descriptif plus uniformément favorable dans tous les domaines évalués ; toutefois, l'absence de différences biochimiques directes significatives entre les groupes d'antidotes, la nature descriptive des comparaisons histopathologiques, les régimes d'antidotes inéquivalents et l'absence de mesures toxicocinétiques ont empêché de conclure à une supériorité par rapport à l'éthanol. Ces résultats sont limités au modèle de rat prétraité au méthotrexate et n'établissent pas les effets rénaux de l'un ou l'autre antidote après une exposition au méthanol sans prétraitement au méthotrexate ou dans l'intoxication humaine par le méthanol. Des études supplémentaires intégrant des mesures toxicocinétiques directes, des évaluations mécanistiques, des régimes d'antidotes dosés de manière comparable et un suivi plus long sont nécessaires pour évaluer la reproductibilité et la pertinence plus large de ces résultats.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Formol tamponné neutre à 10 %	Merck	Non enregistré	Fixation des tissus pour le traitement histopathologique.
Éthanol absolu (≥99,8 %)	Sigma-Aldrich, USA	Non enregistré	Dilué avec de l'eau distillée stérile pour obtenir une solution finale à 20 % (v/v) ; administré en une seule dose par gavage oral de 0,5 g/kg, 4 h après l'administration de méthanol.
Centrifugeuse de banc	Nüve	NF048	Préparation des échantillons et centrifugation.
Anticorps conjugué à la biotine	Composants du kit ELISA BT Lab	Inclus dans le kit	Anticorps de détection
Kit CAT (catalase)	Otto Scientific	Otto3051	Mesure colorimétrique de l'activité de la catalase (CAT) dans le sang anticoagulé à l'EDTA.
cOmplete Mini Cocktail d'inhibiteurs de protéases sans EDTA	Roche / Sigma-Aldrich	11836170001	Ajouté au tampon d'homogénéisation lors de la préparation des homogénats de tissu rénal pour les analyses ELISA.
Kit de créatinine	Otto Scientific	OttoBC139	Évaluation des taux sériques de créatinine.
Homogénéisateur numérique	Daihan Scientific	HG-15D	Homogénéisation des tissus
ELx50 Auto Strip Washer	Bio-Tek Instruments, USA	ELx50	Lavage pour ELISA
Lecteur de microplaques ELx800	Bio-Tek Instruments, USA	ELx800	Mesure de l'absorbance pour les tests ELISA et colorimétriques ; l'absorbance ELISA a été lue à 450 nm.
Éosine Y (jaunâtre)	Merck	1.15935.0025	Coloration histopathologique
Fomepizole (4-méthylpyrazole)	Hüsnü Arsan A.., Ankara, Türkiye	Non enregistré	Préparé dans une solution stérile de chlorure de sodium à 0,9 % à une concentration finale de 10 mg/mL ; administré par voie intrapéritonéale en dose de charge de 15 mg/kg, 4 h après l'administration de méthanol, suivie de doses d'entretien de 10 mg/kg à 12, 24 et 36 h après l'administration de méthanol.
Kit GSH (glutathion)	Otto Scientific	Otto3053	Mesure colorimétrique des niveaux de glutathion réduit (GSH) dans le sang anticoagulé à l'EDTA.
Solution d'hématoxyline de Harris	BSLAB	BS-002	Coloration histopathologique
Acide chlorhydrique (HCl)	Merck	7647-01-0	Réglage du pH
IBM SPSS Statistics	IBM Corp.	IBM SPSS Statistics Version 29.0	Analyse statistique ; RRID : SCR_016479.
Chlorhydrate de kétaamine (Ketalar)	Pfizer, USA	Non enregistré	Anesthésie générale avant le prélèvement de sang et de tissu rénal.
Microscope optique	Nikon Eclipse	Ni-U	Examen histopathologique
Kit de coloration trichrome de Masson	MOSLAB (Medical Olympus Sanayi Tic. Ltd. ti., Türkiye)	BKMTO001	Coloration histopathologique
Kit MDA (malondialdéhyde)	Otto Scientific	Otto1001	Mesure colorimétrique des niveaux de malondialdéhyde (MDA) dans le sérum comme indicateur de la peroxydation lipidique.
Méthanol (≥99,8 %)	Sigma-Aldrich, USA	322415	Administré par voie orale (3 g/kg) pour induire une intoxication expérimentale au méthanol.
Méthotrexate (Emthexate 500 mg/5 mL)	Teva Pharma Belgium	Non enregistré	Formulation commerciale à 100 mg/mL diluée avec une solution stérile de chlorure de sodium à 0,9 % pour obtenir une concentration finale de travail de 0,06 mg/mL ; administrée par gavage oral à 5 mL/kg, correspondant à 0,3 mg/kg, une fois par jour pendant 7 jours consécutifs.
Analyseur de chimie Mindray	Mindray	BS-400	Mesure de l'urée et de la créatinine sériques.
Paraffine, grade histologique	Non enregistré	Non enregistré	Inclusion des tissus.
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Merck	P4417	Rinçage/lavage des tissus
Kit ELISA Rat Cystatine-C	BT Lab, Chine	E0145Ra	Quantification des niveaux de cystatine C dans les homogénats de tissu rénal ; sensibilité analytique, 0,25 ng/mL ; plage de détection, 0,5–100 ng/mL.
Kit ELISA Rat IL-1β	BT Lab, Chine	E0119Ra	Quantification des niveaux d'IL-1β dans les homogénats de tissu rénal ; sensibilité analytique, 0,08 ng/mL ; plage de détection, 0,2–60 ng/mL.
Kit ELISA Rat IL-6	BT Lab, Chine	E0135Ra	Quantification des niveaux d'IL-6 dans les homogénats de tissu rénal ; sensibilité analytique, 0,052 ng/L ; plage de détection, 0,1–40 ng/L.
Kit ELISA Rat KIM-1	BT Lab, Chine	E0549Ra	Quantification des niveaux de KIM-1 dans les homogénats de tissu rénal ; sensibilité analytique, 0,01 ng/mL ; plage de détection, 0,05–10 ng/mL.
Kit ELISA Rat TNF-α	BT Lab, Chine	E0764Ra	Quantification des niveaux de TNF-α dans les homogénats de tissu rénal ; sensibilité analytique, 2,51 ng/L ; plage de détection, 5–1 000 ng/L.
Solution de lyse et d'extraction RIPA	Thermo Scientific	89900	Homogénéisation et lyse du tissu rénal pour les analyses ELISA.
Kit SOD (superoxyde dismutase)	Otto Scientific	Otto3047	Mesure colorimétrique de l'activité de la superoxyde dismutase (SOD) dans le sérum.
Citrate de sodium	Merck	03-04-6132	Préparation de tampon
Hydroxyde de sodium (NaOH)	Merck	1310-73-2	Réglage du pH
Aiguille en acier inoxydable pour alimentation (cannule orale 22 G)	Instech Laboratories, USA	Non enregistré	Cannule en acier inoxydable réutilisable utilisée pour l'administration par gavage oral chez les rats.
Solution d'arrêt	Composants du kit ELISA BT Lab	Inclus dans le kit	Arrêt de la réaction ELISA
Peroxydase streptavidine	Thermo Scientific	SHRP248-B	Système de détection ELISA
Solution substrat TMB	Composants du kit ELISA BT Lab	Inclus dans le kit	Substrat chromogène
Tris-HCl	Thermo Scientific	1185-53-1	Préparation de tampon
Kit urée	Otto Scientific	OttoBC157	Mesure des taux sériques d'urée.
Concentré de tampon de lavage	Composants du kit ELISA BT Lab	Inclus dans le kit	Lavage des plaques
Rats albinos Wistar	Laboratoire de recherche sur les animaux expérimentaux de l'Université Ahi Evran, , Türkiye	Numéro de licence d'élevage/production : 184	Mâles ; âgés de 8–12 semaines ; poids corporel, 220 ± 20 g
Chlorhydrate de xylazine (Rompun)	Bayer, Allemagne	Non enregistré	Anesthésie générale avant le prélèvement de sang et de tissu rénal.
Xylène, grade histologique	Non enregistré	Non enregistré	Traitement et clarification histologiques des tissus.