L'objectif de ce protocole est de normaliser la collecte d'échantillons fécaux humains et l'extraction automatisée de l'acide désoxyribonucléique à l'aide d'un appareil de traitement par particules magnétiques.
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Flux de travail standardisé pour la collecte d'échantillons fécaux humains et l'extraction automatisée de l'acide désoxyribonucléique à l'aide d'un processeur à particules magnétiques
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11 septembre 2026
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le séquençage du microbiote intestinal est devenu une approche importante pour étudier la dynamique des communautés microbiennes dans les états sains et pathologiques. Des modifications de la composition microbienne ont été associées à plusieurs troubles liés au mode de vie et au vieillissement, notamment le diabète, la leucémie et les maladies neurodégénératives. Étant donné que différents micro-organismes présentent des caractéristiques physiologiques et des exigences environnementales distinctes, la collecte, le transport et le traitement standardisés des échantillons fécaux sont essentiels pour préserver l'intégrité des échantillons et minimiser la variabilité technique. Les variations introduites lors de la manipulation préanalytique et de l'extraction de l'acide désoxyribonucléique (ADN) peuvent influencer les analyses ultérieures du microbiote et affecter l'interprétation des données. L'objectif de ce protocole est de fournir un flux de travail standardisé pour la collecte d'échantillons fécaux humains et l'extraction automatisée d'ADN à l'aide du kit d'isolement d'acides nucléiques MagMAX Microbiome Ultra (kit d'extraction d'acides nucléiques) et du système KingFisher Flex (système automatisé de traitement de particules magnétiques). Ce flux de travail intègre une manipulation contrôlée des échantillons avec une extraction automatisée d'acides nucléiques afin de réduire la variabilité manuelle et d'améliorer la cohérence des procédures. Le protocole comprend la collecte, le stockage, la préparation, l'extraction automatisée et la récupération d'acides nucléiques à partir d'échantillons fécaux complexes. Des résultats représentatifs démontrent une récupération réussie d'ADN adapté à des applications en aval, notamment le séquençage du gène de l'ARN ribosomique 16S (ARNr) et le séquençage métagénomique « shotgun ». Ce flux de travail standardisé permet un traitement reproductible des échantillons, facilite l'adaptation à grande échelle pour les études sur le microbiote et favorise une plus grande cohérence entre les expériences. La démonstration visuelle fournit des indications pratiques pour la mise en œuvre du traitement standardisé des échantillons fécaux et de l'extraction automatisée d'acides nucléiques dans le cadre de la recherche sur le microbiote intestinal.
Introduction
Le microbiote intestinal est un écosystème microbien complexe qui influence le métabolisme, l'immunité et la fonction neurologique de l'hôte, et qui est de plus en plus impliqué dans diverses maladies, notamment les troubles métaboliques, la maladie de Parkinson, le cancer et les maladies neurodégénératives1,2. Il joue un rôle important dans le maintien de la physiologie de l'hôte en influençant le métabolisme, la fonction immunitaire, l'absorption des nutriments et la résistance aux micro-organismes pathogènes3,4. Des mesures fiables et reproductibles du microbiote sont essentielles pour transformer ces associations en connaissances mécanistiques et en applications cliniques. Les progrès réalisés dans les technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS) ont révolutionné notre compréhension des communautés microbiennes complexes présentes dans le tractus gastro-intestinal. Toutefois, les variables préanalytiques, telles que les procédures de collecte des échantillons fécaux, les conditions de stockage, la manipulation, le transport et les méthodes d'extraction de l'acide désoxyribonucléique (ADN), peuvent modifier sélectivement la structure de la communauté microbienne, le rendement en ADN et les résultats du séquençage5,6. De telles incohérences méthodologiques compliquent souvent les comparaisons entre études.
Parmi les étapes préanalytiques critiques, l'extraction de l'ADN représente l'un des déterminants les plus influents sur la qualité des données microbiomiques7,8. Un protocole d'extraction idéal doit produire de façon reproductible de l'ADN de haute qualité et de haut poids moléculaire, avec une contamination minimale, sur un grand nombre d'échantillons. Les plateformes automatisées d'extraction des acides nucléiques peuvent améliorer la reproductibilité, réduire les erreurs liées à la manipulation manuelle, diminuer le risque de contamination et augmenter le débit. Les performances de ces plateformes d'extraction automatisées dépendent fortement des paramètres du protocole, notamment l'homogénéisation des échantillons, les conditions de battement par billes, la chimie de lyse, les conditions d'incubation et la manipulation des billes magnétiques9,10. Par conséquent, la mise en place d'un protocole standardisé intégrant une collecte uniforme d'échantillons fécaux et une extraction automatisée de l'ADN est essentielle pour générer des jeux de données microbiomiques fiables et reproductibles.
Ici, nous présentons un protocole normalisé pour la collecte, la manipulation et l'extraction automatisée de l'ADN à partir d'échantillons fécaux humains, en utilisant le kit d'extraction des acides nucléiques et le dispositif automatisé de traitement des particules magnétiques décrits ci-dessus. Le protocole met l'accent sur une manipulation contrôlée des échantillons, une lyse mécanique et chimique efficace, l'élimination des inhibiteurs et des mesures de contrôle qualité adaptées aux applications en aval, notamment le séquençage des amplicons du gène de l'ARN ribosomique 16S (ARNr), le séquençage du génome entier, la réaction de polymérase en chaîne (PCR) quantitative et le séquençage métagénomique « shotgun ». La démonstration visuelle fournit des indications pratiques pour le traitement standardisé des échantillons fécaux et l'extraction automatisée des acides nucléiques, afin de soutenir des recherches reproductibles et évolutives sur le microbiote intestinal.
Protocole
L'étude a été menée conformément aux directives du comité d'éthique institutionnel de la SKAN Research Trust et a été approuvée par ce comité (numéro d'approbation : SKAN/IEC/2025/04). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants avant le prélèvement des échantillons.
REMARQUE : Tous les réactifs, consommables et équipements sont répertoriés dans le Tableau des matériaux.
1. Préparer le kit de prélèvement d'échantillon fécal
- Préparer un kit de prélèvement d'échantillon fécal comprenant un collecteur fécal stérile, un tube de prélèvement stérile à vis (capacité de 30 à 50 mL) muni d'une spatule, un tube de prélèvement pré-rempli de tampon de stabilisation, des gants jetables, un matériau absorbant, un sac de transport scellable étiqueté « risque biologique » et une fiche d'instructions (Figure 1).
- Identifier chaque tube de prélèvement à l’aide d’un code unique, de la date et de l’heure de prélèvement, en utilisant un stylo indélébile ou une étiquette préimprimée.
- Inclure une fiche d'instructions décrivant la procédure de prélèvement, les précautions de manipulation, les conditions de stockage et les exigences de transport.
REMARQUE : Le tampon de stabilisation est fourni pré-rempli dans le tube de collecte fécale dans le cadre du kit de prélèvement fécal. Le fabricant ne divulgue pas la composition ni le volume du tampon de stabilisation. Prélever environ 2 à 5 g de matériel fécal directement dans le tube de prélèvement pré-rempli, conformément aux instructions du fabricant.
Figure 1. Composants du kit de prélèvement d'échantillons fécaux.
Le kit de prélèvement d'échantillons fécaux comprend des gants jetables, un collecteur fécal stérile, un tube de prélèvement fécal stérile avec bouchon à vis et spatule intégrée, un sac de transport scellable portant la mention « danger biologique », et une brochure d'instructions remise aux participants pour le prélèvement, la manipulation, le stockage et le transport des échantillons fécaux. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
2. Préparer le participant au prélèvement d'échantillon
- Demander au participant de se laver les mains avant le prélèvement de l'échantillon.
- Demander au participant de vider sa vessie avant la défécation afin d'éviter toute contamination de l'échantillon fécal par l'urine.
3. Prélever l'échantillon fécal à l'aide d'un collecteur fécal
- Placer un récepteur fécal stérile sur la cuvette des toilettes pour éviter tout contact entre l'échantillon fécal et l'eau des toilettes.
- Pour les récepteurs fécaux adhésifs, déplier soigneusement l'appareil le long des bords indiqués sans le déchirer. Suivre les instructions du fabricant fournies avec le récepteur fécal, et fixer l'appareil solidement à la partie arrière de la cuvette des toilettes afin de créer une surface de collecte stable.
- Pour les récepteurs fécaux non adhésifs, positionner l'appareil en travers de la cuvette des toilettes conformément aux instructions du fabricant afin d'assurer un support stable.
- S'assurer que le récepteur fécal n'entre pas en contact avec l'eau des toilettes pendant la collecte de l'échantillon.
- Demander au participant d'effectuer son évacuation directement sur le récepteur fécal.
- Enfiler les gants jetables fournis dans le kit de prélèvement avant de manipuler l'échantillon.
- Ouvrir le tube de prélèvement stérile et utiliser la spatule attachée pour prélever du matériel fécal à partir d'au moins quatre à cinq régions distinctes des selles, y compris la surface externe et le noyau interne. Cette méthode fournit généralement environ 2–5 g de matériel fécal, ce qui est suffisant pour l'extraction de l'ADN.
- Éviter de prélever du matériel fécal ayant touché les bords du récepteur fécal ou toute autre surface externe.
- Fermer hermétiquement le tube de prélèvement immédiatement après la collecte de l'échantillon.
- Mélanger soigneusement l'échantillon fécal avec le tampon de stabilisation en agitant vigoureusement à la main le tube fermé jusqu'à ce que l'échantillon soit uniformément en suspension et qu'aucun gros agrégat ne subsiste.
- Placer le tube de prélèvement scellé dans le sac de transport étanche, étiqueté comme risque biologique, contenant du matériau absorbant.
- Retirer soigneusement le récepteur fécal et le jeter dans les toilettes avec les selles, en veillant à ce que le contenu ne se renverse pas. Tirer la chasse d'eau pour éliminer ensemble le récepteur fécal et les selles.
4. Stocker et transporter les échantillons fécaux
- Conserver les échantillons conformément aux spécifications du tampon de stabilisation utilisé.
- Conserver les échantillons à température ambiante si le tampon de stabilisation permet une conservation en conditions ambiantes. Sinon, conserver les échantillons à 4 °C pour une conservation à court terme (≤24–48 h) ou à −20 °C à −80 °C pour une conservation à long terme.
- Conserver les échantillons conformément aux recommandations du fabricant. Les échantillons recueillis à l’aide du tampon de stabilisation utilisé dans cette étude sont stables jusqu’à 2 ans à température ambiante.
- Transporter les échantillons dans des sacs étanches pour matières biologiques dangereuses contenant un matériau absorbant afin d’éviter les fuites et la contamination.
- Conserver les échantillons dans les conditions de température recommandées pendant le transport. Utiliser des contenants isolés et des éléments de refroidissement si nécessaire.
- S’assurer de respecter les directives institutionnelles de biosécurité et la réglementation locale applicable au transport d’échantillons biologiques.
5. Recevoir et enregistrer les échantillons
- Examiner chaque échantillon dès sa réception au laboratoire pour vérifier l'étiquetage correct, l'intégrité du tube et la présence éventuelle de fuites.
- Attribuer un identifiant propre au laboratoire, si nécessaire, et enregistrer la date et l'heure de prélèvement, les conditions de stockage et la durée du transport.
- Exclure les échantillons présentant des fuites, un étiquetage incorrect ou une intégrité compromise.
6. Préparer les plaques
REMARQUE : Préparer toutes les plaques avant de commencer le protocole d'extraction. Effectuer toutes les étapes impliquant des réactifs et des échantillons biologiques dans un environnement propre et en portant des équipements de protection individuelle appropriés, notamment une blouse de laboratoire, des gants et une protection oculaire. Figure 2 présente le processeur automatisé de particules magnétiques (Figure 2A), les positions de chargement des plaques (Figure 2B), l'adaptateur pour plaque profonde (Figure 2C), la centrifugeuse compatible avec les plaques (Figure 2D), l'appareil de battage par billes (Figure 2E), le support amortisseur (Figure 2F), le support de plaque (Figure 2G), la plaque à billes 96-puits (Figure 2H), la plaque profonde (Figure 2I), et la plaque d'élution (Figure 2J).
Figure 2. Équipements et consommables utilisés pour l'extraction automatisée de l'acide désoxyribonucléique (ADN) fécal.
(A) Procédé automatisé de traitement des particules magnétiques. (B) Position de chargement de la plaque dans le procédé automatisé de traitement des particules magnétiques. (C) Adaptateur de plaque à puits profonds pour la centrifugation. (D) Centrifugeuse compatible avec les plaques. (E) Homogénéisateur à billes. (F) Support amortisseur utilisé pendant la fragmentation par billes. (G) Support de plaque à puits profonds (adaptateur) pour la fragmentation par billes. (H) Plaque à 96 puits avec billes fournie avec le kit d'extraction des acides nucléiques. (I) Plaque à puits profonds à 96 puits. (J) Plaque d'élution à 96 puits. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
- Retirer la plaque de peignes de pointe de son emballage et la garder prête pour le chargement sur l'instrument.
- Préparer la plaque d'élution (Figure 2J) en ajoutant 200 µL de tampon d'élution fourni avec le kit d'extraction des acides nucléiques dans chaque puits d'une plaque 96 puits. Sceller la plaque avec un film adhésif transparent afin d'éviter toute contamination. Garder la plaque scellée jusqu'à son chargement dans le processeur automatisé de particules magnétiques. Étiqueter la plaque comme étant la plaque d'élution.
- Préparer la plaque de lavage 4 en ajoutant 1 mL d'éthanol à 80 % dans chaque puits d'une plaque à puits profonds. Sceller la plaque avec un film adhésif pour éviter l'évaporation et la contamination.
- Préparer la plaque de lavage 3 en ajoutant 1 mL d'éthanol à 80 % fraîchement préparé dans chaque puits d'une plaque à puits profonds distincte. Sceller la plaque avec un film adhésif.
- Préparer la plaque de lavage 2 en ajoutant 1 mL de tampon de lavage dans chaque puits d'une plaque à puits profonds. Sceller la plaque avec un film adhésif.
- Préparer la plaque de lavage 1 en ajoutant 1 mL de tampon de lavage dans chaque puits d'une plaque à puits profonds. Sceller la plaque avec un film adhésif.
7. Mettre en place le processeur automatisé de particules magnétiques
- Allumez le processeur automatisé de particules magnétiques. Vérifiez que la tête magnétique 96 puits profonds appropriée et le bloc chauffant 96 puits profonds sont installés.
- Exécutez le protocole de vérification de l'appareil adéquat (par exemple, le protocole Check_96dw_tip) en utilisant un peigne de pointes propres et une plaque de puits compatible vide avant le traitement des échantillons.
- Confirmez que le programme d'extraction requis est disponible sur le processeur automatisé de particules magnétiques.
REMARQUE : L'utilisation d'une tête magnétique ou d'un bloc chauffant inapproprié peut réduire le rendement en acides nucléiques et endommager l'appareil.
8. Réaliser la lyse de l'échantillon
- Préparez une carte de plaque pour enregistrer la position de chaque échantillon dans la plaque 96 puits.
- Effectuez une centrifugation de la plaque 96 puits contenant les billes (Figure 2H) à 2 750 × g pendant 10 s à l’aide d’une centrifugeuse compatible plaque (Figure 2D) et d’un adaptateur (Figure 2C) afin de regrouper les billes au fond de chaque puits.
NOTE : Cette étape permet d’éviter la perte de billes lors du retrait du scellé de la plaque. - Retirez soigneusement le scellé de la plaque sans perturber les billes.
- Ajoutez 800 µL de tampon de lyse dans chaque puits de la plaque à billes.
- Évitez d’aspirer les billes lors de la pipette.
- Décongelez les échantillons fécaux congelés à température ambiante jusqu’à décongélation complète. Mélangez délicatement les échantillons pour les homogénéiser, puis passez immédiatement à l’extraction de l’ADN. Évitez les cycles répétés de congélation-décongélation car ils peuvent réduire la qualité et le rendement de l’ADN.
NOTE : Pour les échantillons frais, vortexez chaque tube d’échantillon fécal contenant la solution de stabilisation pendant 5 à 10 s afin d’assurer une homogénéisation complète. - Transférez 200 µL de chaque échantillon homogénéisé dans le puits correspondant de la plaque à billes.
- Utilisez une pipette monocanal équipée de pointes larges stériles filtrées (coupées) pour transférer les échantillons. Évitez les pipetages répétés afin de minimiser la perte de billes et la réduction subséquente du rendement en ADN.
- Scellez hermétiquement la plaque avec un film adhésif, en veillant à ce que tous les puits et les bords de la plaque soient complètement scellés.
9. Réaliser la lyse mécanique (broyage par billes)
- Fixer la plaque scellée dans l'instrument de broyage par billes (Figure 2E) à l'aide du support de plaque approprié (Figure 2G) et du support amortisseur (Figure 2F).
- Équilibrer l'instrument en plaçant une plaque de poids équivalent en face de la plaque d'échantillon.
- Régler l'instrument sur 30 Hz pendant 2 min et démarrer le cycle.
- Laisser le cycle se dérouler sans interruption.
- Retirer soigneusement la plaque à la fin du cycle sans perturber le scellage.
REMARQUE : Utiliser le support amortisseur pour éviter d'endommager la plaque pendant le broyage par billes.
10. Réaliser le traitement post-lyse
- Centrifuger la plaque à 2 750 × g pendant 5 min à température ambiante en utilisant une configuration équilibrée.
- Transférer soigneusement 400 µL du surnageant de chaque puits vers une nouvelle plaque à puits profonds désignée comme la Plaque d'Échantillons.
- Éviter de transférer des billes lors de cette étape.
REMARQUE : La Plaque d'Échantillons ne contient pas de billes et ne nécessite pas de pré-centrifugation. - Fermer hermétiquement la Plaque d'Échantillons si l'on ne poursuit pas immédiatement.
REMARQUE : Conserver la plaque de lysat scellée à 4 °C pendant la nuit, si nécessaire. Sinon, conserver la Plaque d'Échantillons scellée à −20 °C pendant jusqu'à 3 mois. Décongeler les échantillons à température ambiante avant tout traitement ultérieur.
11. Préparer le mélange de billes de liaison
- Préparez le mélange de billes de liaison immédiatement avant utilisation en combinant 500 µL de tampon de liaison aux acides nucléiques avec 20 µL de billes magnétiques par échantillon. Mélangez soigneusement pour obtenir une suspension homogène.
- Calculez le volume total de mélange de billes de liaison nécessaire en fonction du nombre d'échantillons.
- Pour une plaque complète de 96 puits, préparez le mélange de billes de liaison en ajoutant 48,00 mL de tampon de liaison aux acides nucléiques et 1,92 mL de billes magnétiques dans un tube conique stérile. Mélangez soigneusement pour obtenir un volume final de 49,92 mL (520 µL par puits).
REMARQUE : Préparez un volume suffisant pour un ou deux puits supplémentaires afin de compenser les variations liées au pipetage. - Mélangez doucement la suspension de billes de liaison par retournement jusqu'à obtention d'une suspension homogène.
- Transférez le mélange de billes de liaison dans un réservoir de réactif propre.
- Juste avant le dosage, remettez en suspension les billes magnétiques en pipetant la suspension de haut en bas trois à quatre fois afin d'éviter la décantation des billes.
- Distribuez 520 µL du mélange de billes de liaison dans chaque puit de la plaque d'échantillons préparée à l'aide d'une pipette multicanal.
- Pipetez lentement en raison de la viscosité de la solution, et évitez la formation de bulles. Remettez délicatement en suspension le mélange de billes de liaison dans le réservoir de réactif avant chaque étape de distribution afin de maintenir une répartition uniforme des billes dans tous les puits.
12. Modifier le programme d'instrument MagMAX_Microbiome_Stool_Flex (programme d'extraction modifié)
- Téléchargez et installez le logiciel BindIt (logiciel d’édition de protocole) conformément aux instructions du fabricant.
- Téléchargez le programme d’instrument à partir du site web du fabricant.
- Lancez le logiciel d’édition de protocole et laissez-le s’initialiser.
- Cliquez sur Ouvrir et sélectionnez le programme d’instrument téléchargé.
- Modifiez les paramètres du protocole comme décrit dans Tableau 1.
- Enregistrez le protocole modifié puis fermez le logiciel.
- Connectez l’ordinateur au processeur automatisé de particules magnétiques à l’aide d’un câble série USB ou RS-232C.
REMARQUE : Assurez-vous que le processeur automatisé de particules magnétiques est éteint avant de connecter l’ordinateur. - Activez le processeur automatisé de particules magnétiques et laissez-le terminer son initialisation.
- Lancez le logiciel d’édition de protocole et vérifiez qu’il détecte le processeur automatisé de particules magnétiques.
- Transférez le programme d’extraction modifié vers le processeur automatisé de particules magnétiques.
- Confirmez le transfert réussi du programme d’extraction modifié, puis éteignez le processeur automatisé de particules magnétiques.
| Étape | Action | Paramètres |
| 1 | Liaison | Mélanger ; 5 cycles de collecte ; 37°C |
| 2 | Collecter les billes | 5 cycles de collecte magnétique |
| 3 | Lavage 1 | Mélanger pendant 20 s × 3 cycles ; 37°C |
| 4 | Lavage 2 | Mélanger pendant 20 s × 3 cycles ; 37°C |
| 5 | Lavage 3 | Mélanger pendant 20 s × 2 cycles ; 37°C |
| 6 | Lavage 4 | Mélanger ; 1 cycle ; 37°C |
| 7 | Séchage | Sécher à l'air pendant 2 min |
| 8 | Élution | 75°C ; 6 cycles de mélange ; préchauffage activé |
| 9 | Collecter les billes | 3 cycles de collecte magnétique |
| 10 | Transférer l'éluate | Transférer l'acide nucléique purifié vers la plaque d'élution |
Tableau 1 : Programme d'extraction automatisé pour le processeur de particules magnétiques.
Résumé du programme d'extraction automatisé exécuté par le processeur automatisé de particules magnétiques lors de l'extraction de l'acide désoxyribonucléique (ADN). Le programme comprend la liaison des acides nucléiques, la collecte des billes magnétiques, des étapes de lavage successives, le séchage à l'air, l'élution et le transfert de l'ADN purifié vers la plaque d'élution. Les paramètres de fonctionnement pour chaque étape automatisée sont indiqués.
13. Réaliser l'extraction automatisée des acides nucléiques
- Allumez le processeur automatisé de particules magnétiques (Figure 2A) en activant d'abord l'alimentation principale, puis en appuyant sur le bouton d'alimentation de l'appareil. Attendez que le système ait terminé son initialisation.
- À l'aide du panneau de commande de l'appareil, sélectionnez le programme d'extraction modifié et lancez l'analyse.
- Lorsque l'appareil y invite, insérez la plaque de peignes à embouts en position 7 et appuyez sur Démarrer pour continuer. Reportez-vous au Tableau 2 pour connaître les positions de chargement des plaques (Figure 2B).
- Retirez le film scellant de la plaque d'élution et insérez-la en position 6, en veillant à l'orientation correcte (le puits A1 aligné avec la position indiquée). Appuyez sur Démarrer pour continuer.
- Retirez le film scellant de la plaque de lavage 4 contenant de l'éthanol à 80 %, insérez la plaque en position 5 avec l'orientation correcte, puis appuyez sur Démarrer.
- Retirez le film scellant de la plaque de lavage 3 contenant de l'éthanol à 80 %, insérez la plaque en position 4, puis appuyez sur Démarrer.
- Retirez le film scellant de la plaque de lavage 2, insérez la plaque en position 3, puis appuyez sur Démarrer.
- Retirez le film scellant de la plaque de lavage 1, insérez la plaque en position 2, puis appuyez sur Démarrer.
- Lorsque l'appareil y invite, insérez la plaque d'échantillons en position 1, en veillant à l'orientation correcte.
- Fermez le couvercle de l'appareil et appuyez sur Démarrer pour lancer l'extraction automatisée.
- Laissez le programme s'exécuter sans interruption jusqu'à son achèvement (environ 35 à 40 min).
REMARQUE : Le Tableau 1 résume le programme d'extraction automatisée exécuté par l'appareil.
| Plaque | Position | Type de plaque | Réactif | Volume par puits |
| Plaque d'échantillons | 1 | Plaque 96 puits profonds | Mélange de lysat d'échantillon et de billes de liaison | 920 µL |
| Plaque de lavage 1 | 2 | Plaque 96 puits profonds | Solution de lavage | 1,000 µL |
| Plaque de lavage 2 | 3 | Plaque 96 puits profonds | Solution de lavage | 1,000 µL |
| Plaque de lavage 3 | 4 | Plaque 96 puits profonds | Éthanol à 80 % | 1,000 µL |
| Plaque de lavage 4 | 5 | Plaque 96 puits profonds | Éthanol à 80 % | 1,000 µL |
| Plaque d'élution | 6 | Plaque 96 puits | Solution d'élution | 200 µL |
| Plaque de peigne de pointes | 7 | Plaque standard à puits profonds | Peigne de pointes 96 puits profonds | N/A |
Tableau 2 : Configuration du chargement des plaques pour l'extraction automatisée des acides nucléiques.
Positions de chargement des plaques, types de plaques, réactifs et volumes de réactifs utilisés pour l'extraction automatisée de l'ADN à l'aide du dispositif de traitement par particules magnétiques. La plaque d'échantillons contient le mélange de lysat d'échantillon et de billes de liaison. N/D indique qu'aucun réactif liquide n'a été ajouté à la plaque de peignes à embouts.
14. Éluer et conserver les acides nucléiques
- Ouvrir l'instrument après la fin de la course et retirer soigneusement la plaque d'élution afin d'éviter de renverser les éluats.
REMARQUE : Si un entraînement visible de billes magnétiques est présent dans la plaque d'élution, transférer les éluats dans une plaque standard de 96 puits et placer la plaque sur un support magnétique pendant 5 à 10 minutes. Transférer le surnageant clarifié vers une nouvelle plaque de 96 puits ou des tubes correctement étiquetés à l’aide d’une pipette multicanal. - Transférer l'ADN élué vers des tubes ou des plaques de stockage correctement étiquetés.
- Conserver l'ADN élué à 4 °C pour une utilisation à court terme, à −20 °C pour un stockage allant jusqu’à 6 mois, ou à −80 °C pour un stockage à long terme.
15. Effectuer le nettoyage après l'exécution
- Retirer toutes les plaques et peignes de pointes utilisés du processeur automatisé de particules magnétiques.
- Jeter toutes les pièces consommables conformément aux directives institutionnelles de biosécurité et d'élimination des déchets chimiques.
- Nettoyer tout déversement à l’aide d’un désinfectant de laboratoire approprié.
- Éteindre le processeur automatisé de particules magnétiques, puis couper l’alimentation électrique principale.
Résultats
Des échantillons fécaux provenant de sept participants ont été correctement collectés à l’aide du protocole de prélèvement décrit, produisant des spécimens d’une masse suffisante et d’une consistance appropriée pour les analyses ultérieures. Les échantillons ont été conservés à température ambiante après leur prélèvement. La majorité des échantillons présentaient une texture et une coloration homogènes, conformes à des conditions adéquates de collecte et de conservation, tandis qu’un petit sous-ensemble montrait une légère variabilité de consistance, qui pourrait refléter une variation biologique entre les participants. Aucune contamination ni fuite n’a été observée durant le transport, et tous les échantillons ont été analysés dans la fenêtre de stabilité validée du kit de prélèvement (jusqu’à 2 ans à température ambiante), ce qui confirme la robustesse et la fiabilité du protocole de collecte (Figure 1).
Le protocole automatisé d'extraction de l'ADN a été réalisé à l'aide du processeur automatisé de particules magnétiques (Figure 2A), de la configuration de chargement des plaques (Figure 2B), de l'adaptateur pour plaque à puits profonds (Figure 2C), de la centrifugeuse compatible avec les plaques (Figure 2D), de l'appareil de broyage par billes (Figure 2E), du support amortisseur (Figure 2F), du support de plaque (Figure 2G), de la plaque à billes (Figure 2H), de la plaque à puits profonds (Figure 2I) et de la plaque d'élution (Figure 2J), selon le programme d'extraction automatisé résumé dans le Tableau 1 et la configuration de chargement des plaques présentée dans le Tableau 2. La concentration et la pureté de l'ADN ont été évaluées sur des échantillons fécaux représentatifs, et les résultats sont résumés dans le Tableau 3. La concentration d'ADN a été mesurée à l'aide du test Qubit d'ADN double brin à haute sensibilité (test fluorométrique de quantification de l'ADN) sur un fluoromètre Qubit (instrument de quantification fluorométrique de l'ADN), conformément aux instructions du fabricant. Les échantillons ont été mélangés avec la solution de travail, incubés pendant 2 min à température ambiante, puis mesurés conjointement avec les deux étalons du test. Les rapports d'absorbance A260/A280 et A260/A230 ont été déterminés à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop (spectrophotomètre à microvolume). Les concentrations d'ADN variaient entre 36 et 87 ng/µL, tous les échantillons ayant été élutés dans un volume constant de 200 µL, permettant ainsi une comparaison directe du rendement total en ADN entre les différentes préparations (Tableau 3).
| Échantillon | Concentration d'ADN (ng/µL) | A260/A280 | A260/A230 | Volume d'élution (µL) | Rendement total d'ADN (ng) |
| Échantillon A | 62 | 1.83 | 1.71 | 200 | 12 400 |
| Échantillon B | 36 | 1.89 | 1.51 | 200 | 7 200 |
| Échantillon C | 87 | 1.92 | 1.85 | 200 | 17 400 |
| Échantillon D | 50 | 2.03 | 1.87 | 200 | 10 000 |
| Échantillon E | 55 | 1.97 | 1.81 | 200 | 11 000 |
| Échantillon F | 85 | 1.99 | 1.88 | 200 | 17 000 |
| Échantillon G | 44 | 2.01 | 1.51 | 200 | 8 800 |
| Extraction témoin | 0 | — | — | 200 | 0 |
Tableau 3 : Récupération et pureté représentatives de l'ADN après extraction automatisée à partir d'échantillons fécaux humains.
Concentration représentative d'ADN, pureté (rapports d'absorbance A260/A280 et A260/A230), volume d'élution et rendement total d'ADN mesurés après extraction automatisée d'ADN à partir d'échantillons fécaux humains. La concentration d'ADN a été déterminée par un dosage fluorométrique. L'extraction du témoin sans matrice a servi de contrôle négatif et n'a produit aucun ADN détectable.
Les résultats représentatifs ont démontré une variabilité de la récupération de l'ADN parmi les échantillons. Des concentrations plus élevées d'ADN ont été obtenues pour l'échantillon A (62 ng/µL), l'échantillon F (85 ng/µL) et l'échantillon C (87 ng/µL), tandis que des concentrations intermédiaires ont été observées pour l'échantillon D (50 ng/µL) et l'échantillon E (55 ng/µL). Les échantillons B et G ont donné les concentrations les plus faibles en ADN (36 ng/µL et 44 ng/µL, respectivement). Les rapports d'absorbance A260/A280 variaient entre 1,83 et 2,03, tandis que les rapports d'absorbance A260/A230 allaient de 1,51 à 1,88 (Tableau 3). Cette variation est attendue pour les spécimens fécaux et peut refléter des différences dans la composition des échantillons et la variabilité biologique, en plus de la variabilité technique liée au traitement des spécimens. Le témoin d'extraction n'a produit aucune ADN détectable, indiquant l'absence de contamination détectable durant la procédure d'extraction. L'amplification représentative du gène bactérien 16S ARNr presque complet a généré l'amplicon PCR attendu d'environ 1,5 kb dans les échantillons d'ADN fécal, tandis que le témoin sans matrice n'a montré aucune amplification (Figure 3).
Figure 3. Électrophorèse sur gel d'agarose des amplicons de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) du gène bactérien de l'ARN ribosomique 16S (ARNr).
Gel d'agarose représentatif montrant l'amplification du gène bactérien de l'ARNr 16S presque complet (~1,5 kb) à l'aide des amorces universelles 27F et 1525R après extraction de l'ADN à partir d'échantillons fécaux humains. Bande M : échelle d'ADN de 100 paires de bases (pb) ; Bande 1 : contrôle sans matrice (témoin négatif) ; Bandes 2–8 : échantillons représentatifs d'ADN fécal montrant l'amplicon PCR attendu d'environ 1,5 kb. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
La réussite de ce protocole se démontre par la récupération d'ADN mesurable, adapté à des applications moléculaires en aval, notamment des tests basés sur la PCR, le séquençage du gène ARNr 16S, le séquençage métagénomique en shotgun et la préparation de bibliothèques. L'ensemble de ces résultats représentatifs montre que le protocole permet de façon constante la récupération d'ADN à partir d'échantillons fécaux humains, tout en illustrant la variabilité pouvant exister entre spécimens biologiques.
Discussion
Le protocole décrit ici fournit un flux de travail normalisé pour le prélèvement d'échantillons fécaux humains et l'extraction automatisée de l'ADN dans les études du microbiome. Les étapes critiques comprennent un prélèvement représentatif des régions multiples des selles, une homogénéisation complète avec le tampon de stabilisation, un stockage et un transport adéquats dans les conditions recommandées, une lyse mécanique efficace et une manipulation soigneuse durant l'extraction automatisée. Le respect rigoureux de ces étapes réduit au minimum la variabilité technique et favorise une récupération reproductible de l'ADN. Des études antérieures ont également identifié le prélèvement des échantillons, les conditions de stockage, l'homogénéisation et l'extraction de l'ADN comme des sources majeures de variabilité dans les analyses du microbiome, soulignant l'importance de flux de travail normalisés pour obtenir des résultats reproductibles5,6,7,8. Les résultats représentatifs montrent un prélèvement réussi des échantillons sans contamination visible ni fuite, ainsi qu'une récupération mesurable d'ADN pour tous les échantillons testés.
Plusieurs facteurs procéduraux peuvent influencer la récupération de l'ADN et doivent être pris en compte lors de la mise en œuvre. Une lyse mécanique ou chimique insuffisante, une homogénéisation incomplète, une liaison inefficace des acides nucléiques ou une perte d'échantillon lors des étapes de transfert et de lavage peuvent réduire le rendement en ADN. Les variations de la composition fécale, de la biomasse microbienne et de la consistance des échantillons peuvent également contribuer à des différences dans la récupération de l'ADN entre les spécimens. Par conséquent, une exécution minutieuse du protocole, en particulier lors de l'homogénéisation des échantillons, du battage à billes et de l'extraction automatisée, est essentielle pour obtenir des résultats reproductibles. Le dépannage doit porter principalement sur la vérification de la préparation des réactifs, du réglage des instruments, du chargement des plaques et de l'exécution du programme d'extraction automatisé avant le traitement des échantillons. Des recommandations similaires ont été rapportées dans des études évaluant les flux de travail analytiques du microbiome et les méthodologies d'extraction de l'ADN5,6,7,8,11.
La principale limitation de cette méthode réside dans la variabilité observée du rendement en ADN entre les échantillons biologiques. Comme le montrent les résultats représentatifs, les différences de concentration en ADN peuvent refléter à la fois une variation biologique intrinsèque entre les échantillons fécaux et une variation technique introduite lors du traitement des échantillons. Par conséquent, la concentration en ADN ne doit pas être considérée comme le seul indicateur de la performance de l'extraction. Des mesures supplémentaires de la qualité et de l'adéquation de l'ADN peuvent être nécessaires selon l'application moléculaire ultérieure prévue. Afin d'évaluer davantage la qualité et l'adéquation de l'ADN pour des analyses moléculaires en aval, le gène bactérien de l'ARNr 16S a été amplifié par PCR à l'aide des amorces universelles 27F et 1525R. L'amplification réussie du fragment attendu d'environ 1,5 kb du gène de l'ARNr 16S a été confirmée par électrophorèse sur gel d'agarose (Figure 3), démontrant ainsi que l'ADN extrait était de qualité suffisante pour des applications en aval, notamment le séquençage et d'autres tests moléculaires. Des études comparatives antérieures ont également montré que le rendement en ADN ne corrèle pas nécessairement avec la performance en séquençage en aval ou avec la précision du profilage du microbiome8,11.
Par rapport aux protocoles d'extraction manuels, les processeurs automatisés de particules magnétiques réduisent l'intervention manuelle, standardisent les conditions d'extraction et permettent un traitement à haut débit tout en minimisant la variabilité dépendante de l'opérateur9,10. Toutefois, les variations de consistance des selles et de la biomasse microbienne peuvent influencer l'efficacité de la lyse et le rendement en ADN. De plus, les micro-organismes dotés de parois cellulaires robustes peuvent ne pas être complètement lysés, ce qui pourrait affecter la représentation de certains taxons. Malgré ces limitations, l'extraction automatisée constitue une approche fiable et efficace pour les études à grande échelle du microbiote intestinal5,6,7,8,9,10. Le présent protocole associe une collecte standardisée des échantillons fécaux à un flux de travail automatisé d'extraction de l'ADN, offrant ainsi une méthode pratique et reproductible pour les études du microbiome nécessitant un traitement cohérent d'un grand nombre d'échantillons. Des méthodologies standardisées comme celle-ci facilitent la reproductibilité entre les études et conviennent bien aux applications moléculaires en aval, notamment le profilage du microbiome, le séquençage métagénomique et d'autres analyses basées sur le séquençage5,6,7,8,9,10.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier ou non financier en conflit.
Remerciements
Nous remercions sincèrement le SKAN Research Trust (Inde) pour avoir fourni les ressources et un environnement collaboratif qui ont rendu ce travail possible. Nous remercions également le Dr Anushree Kogje pour son aide dans la vérification des faits et son soutien éditorial.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Éthanol à 80 % (préparé à partir d'éthanol absolu) | Merck | ET00161000 | Préparer frais à partir d'éthanol absolu comme décrit dans le protocole. |
| Matériau absorbant | Kimtech | 34256 | Inclus dans le sac de transport. |
| Film adhésif pour sceller les plaques | Applied Biosystems | 4306311 | Film adhésif transparent MicroAmp. |
| Procédé automatisé de traitement des particules magnétiques (système de purification KingFisher Flex avec tête 96 puits profonds) | Thermo Fisher Scientific | 5400630 | Système automatisé d'extraction des acides nucléiques. |
| Sac de transport étanche avec étiquette de danger biologique | Zymo Research | R1180 | Sac de transport étanche pour échantillons. |
| Logiciel BindIt | Thermo Fisher Scientific | 5189009 | Logiciel utilisé pour modifier et transférer le protocole d'extraction automatisé. |
| Tube de prélèvement avec spatule intégrée (30–50 mL) | Zymo Research | R1180 | Tube de prélèvement stérile à bouchon vissé. |
| Support amortisseur | QIAGEN | 69984 | Jeu d'adaptateurs TissueLyser (utilisé comme support amortisseur lors du broyage par billes). |
| Plaque à puits profonds (96 puits) | Thermo Fisher Scientific | 95040460 | Plaque KingFisher Deepwell 96. |
| Gants jetables | Zymo Research | R1180 | Recommandés sans poudre. |
| Tampon d'élution | Applied Biosystems | A42357 | Fourni avec le kit d'isolement d'acides nucléiques MagMAX Microbiome Ultra. |
| Récupérateur fécal | Zymo Research | R1180 | Dispositif de prélèvement stérile. |
| Bloc chauffant (96 puits profonds) | Thermo Fisher Scientific | Supplied with instrument | Composant du système de purification KingFisher Flex. |
| Blouse de laboratoire | Fournisseur local | N/A | Équipement de protection individuelle. |
| Tampon de lyse | Applied Biosystems | A42357 | Fourni avec le kit d'isolement d'acides nucléiques MagMAX Microbiome Ultra. |
| Billes magnétiques | Applied Biosystems | A42357 | Fournies avec le kit d'isolement d'acides nucléiques MagMAX Microbiome Ultra. |
| Tête magnétique (96 puits profonds) | Thermo Fisher Scientific | Included with 5400630 | Tête magnétique 96 puits profonds fournie avec le système KingFisher Flex. |
| Support magnétique (96 puits) | Thermo Fisher Scientific | 12332D | Requis uniquement si un entraînement des billes magnétiques est observé. |
| Pipette multicanal | Eppendorf | 3125000052 | Compatible avec les plaques 96 puits. |
| Spectrophotomètre NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Utilisé pour déterminer les rapports A260/280 et A260/230. |
| Tampon de fixation des acides nucléiques | Applied Biosystems | A42357 | Fourni avec le kit d'isolement d'acides nucléiques MagMAX Microbiome Ultra. |
| Stylo-feutre indélébile | Sharpie | 3002 | En alternative, utiliser des étiquettes préimprimées. |
| Embouts de pipette, filtrés stériles (10 µL) | Tarsons | 528100 | Embouts filtres gradués stériles. |
| Embouts de pipette, filtrés stériles (200 µL) | Tarsons | 528104 | Embouts filtres gradués stériles. |
| Embouts de pipette, filtrés stériles (1 000 µL) | Tarsons | 529106 | Embouts filtres stériles ; couper pour préparer des embouts à grand orifice là où indiqué dans le protocole. |
| Adaptateur de plaque pour centrifugeuse | Eppendorf | 5820710004 | Adaptateur de plaque profonde rotor A-2-DWP-AT. |
| Centrifugeuse compatible avec plaque | Eppendorf | 5810 | Compatible avec l'adaptateur rotor A-2-DWP-AT. |
| Support de plaque pour broyage par billes | QIAGEN | 69984 | Jeu d'adaptateurs TissueLyser 2 × 96. |
| Étiquettes préimprimées (facultatif) | Brady | BBP12 | Alternative au stylo-feutre indélébile. |
| Test Qubit dsDNA HS | Thermo Fisher Scientific | Q33231 | Test fluorométrique utilisé pour la quantification de l'ADN. |
| Fluoromètre Qubit | Thermo Fisher Scientific | Q33327 | Instrument utilisé pour la quantification fluorométrique de l'ADN. |
| Réservoir de réactif | Thermo Fisher Scientific | 8093 | Réservoir de réactif Matrix. |
| Tampon de stabilisation de l'échantillon | Zymo Research | R1180 | Kits de prélèvement fécal DNA/RNA Shield. |
| Tube conique stérile | HiMedia | TCP106H | Utilisé pour la préparation du mélange de billes de liaison. |
| Homogénéisateur à billes TissueLyser III | QIAGEN | 9003240 | Appareil de lyse mécanique. |
| Plaque peigne d'embouts | Thermo Fisher Scientific | 97002534 | Peigne 96 embouts KingFisher pour aimants à puits profonds. |
| Tampon de lavage | Applied Biosystems | A42357 | Fourni avec le kit d'isolement d'acides nucléiques MagMAX Microbiome Ultra. |
Références
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