La présente étude a reanalysé des données anonymisées et accessibles publiquement et n'a impliqué aucun nouveau recrutement, intervention ni prélèvement d'échantillons. Par conséquent, une approbation éthique institutionnelle et un nouveau consentement éclairé n'étaient pas requis pour cette analyse secondaire. L'approbation éthique et le consentement éclairé pour les études initiales ont été rapportés par les producteurs de données respectifs.
Conception de l'étude et logique du flux de travail
Nous avons mené une étude bioinformatique rétrospective utilisant des données publiques déposées dans le Gene Expression Omnibus20,21. Aucun nouvel échantillon de patient, expérience de culture cellulaire, modèle animal ou validation en laboratoire n’a été généré. Le flux de travail a adopté une conception basée sur un ancrage préalable. La série GSE117827 a été utilisée pour l’estimation de l’ampleur de l’effet, la construction de modules, l’analyse de concordance entre compartiments et l’analyse du gradient des symptômes. Des jeux de données indépendants n’ont été introduits qu’après la fixation de l’appartenance aux modules. Le flux de travail comprenait un ancrage par paires de compartiments, un mappage HGNC et un filtrage des gènes codant pour des protéines, la construction séparée de modules nasaux et sanguins, une validation sur tissus appariés et longitudinale, un étalonnage clinique, ainsi que des analyses de robustesse. Les analyses confirmatoires comprenaient des tests verrouillés sur tissus appariés et longitudinaux. Les analyses d’overlap des gènes, de gradient des symptômes, de programmes marqueurs et de variance étaient exploratoires ou descriptives.
Cohorte d'ancrage et contraste principal
GSE117827 contient des profils d'expression provenant de prélèvements nasaux et de sang total de 26 enfants : 9 cas symptomatiques de picornavirus, 5 détections asymptomatiques de picornavirus, 6 cas symptomatiques de VRS et 6 témoins asymptomatiques négatifs pour les virus17. Deux cas de VRS ne disposaient pas d'échantillons sanguins. Le plan expérimental complet d'ancrage comprenait donc 50 échantillons, et le contraste principal entre infectés et témoins comprenait 40 échantillons après exclusion des détections asymptomatiques de picornavirus de la construction des modules. Pour le contraste principal, les échantillons symptomatiques de picornavirus et les échantillons symptomatiques de VRS ont été étiquetés comme infectés, tandis que les échantillons asymptomatiques négatifs pour les virus ont été étiquetés comme témoins. Les détections asymptomatiques de picornavirus n'ont pas été considérées comme des témoins, car la détection virale en l'absence de symptômes est biologiquement distincte de la santé sans présence virale. Ces échantillons ont été exclus de la construction des modules et utilisés ultérieurement pour une analyse du gradient de symptômes.
Cartographie et prétraitement des sondes
GSE117827 a été profilé sur GPL23126. Les identifiants de regroupement des transcrits ont été associés aux symboles génétiques à l'aide du fichier d'annotation Clariom D Human na36, hg38 distribué via la plateforme GEO GPL24539. Seuls les symboles approuvés par HGNC ont été conservés.22. Les sondes témoins, les sondes ERCC, les groupes de transcrits non cartographiés et les symboles non approuvés ont été supprimés. Les multiples groupes de transcrits associés à un même symbole approuvé ont été regroupés par expression médiane. Après filtration et regroupement, 27 685 gènes étaient disponibles pour l'analyse d'ancrage. Un log₂La transformation (x + 1) a été appliquée uniquement lorsque le 95e percentile de la matrice d'expression dépassait 50, indiquant une échelle d'intensité non logarithmique. Les gènes présentant plus de 20 % de valeurs manquantes ont été supprimés ; les valeurs manquantes restantes ont été remplacées par la médiane intra-gène. Chaque gène a ensuite été standardisé sur l'ensemble des échantillons de ce jeu de données en tant que z = (x − moyenne)/écart type de l'échantillon (ddof = 1). Les gènes de variance nulle se sont vu attribuer une valeur standardisée de 0. La construction des modules a été restreinte aux entrées classées comme gènes codant des protéines dans le jeu de données complet de l'HGNC.
Analyse de la taille de l'effet et construction des modules
Les compartiments nasaux et sanguins ont été analysés séparément. Les échantillons viraux symptomatiques ont été comparés aux témoins négatifs pour le virus à l’aide de différences moyennes standardisées de Hedges g et de tests de Welch bilatéraux23. Hedges g a été calculé comme la différence moyenne entre infectés et témoins divisée par l’écart-type regroupé, puis multiplié par la correction pour petits échantillons 1 − 3/(4df − 1), où df = ninfected + ncontrol − 2. Les tests de Welch ont été appliqués en tenant compte de variances inégales. Les taux de faux positifs (FDR) de Benjamini–Hochberg ont été calculés pour l’ensemble des gènes testés dans chaque compartiment24. Aucun gène codant pour une protéine n’ayant satisfait dans la petite cohorte d’ancrage à la combinaison stricte préétablie de FDR < 0,05 et Hedges g > 0,8, les gènes à effet positif ont été classés d’abord par valeur de P de Welch bilatérale croissante, puis par Hedges g décroissant, le symbole du gène servant de critère de départage déterministe en cas d’égalité. Les 50 gènes en tête formaient chaque module principal. Un nombre de 50 gènes a été choisi a priori comme taille modérée de module permettant de conserver une largeur biologique tout en limitant la perte de gènes manquants entre différentes plates-formes. Cette taille de module n’a pas été ajustée selon l’AUROC externe. Des analyses de sensibilité utilisant 10, 25, 50, 100 et 200 gènes ont donné le même résultat qualitatif de séparation de la cohorte d’ancrage. L’objectif visait la reproductibilité au niveau du module, et non la découverte de gènes individuels.
Concordance entre compartiments
Les estimations de Hedges g au niveau nasal et sanguin ont été appariées par gène et comparées à l'aide de corrélations de Pearson et de Spearman. Le chevauchement entre les 50 premiers modules nasaux et les 50 premiers modules sanguins a été résumé par le nombre de correspondances et par l'indice de Jaccard. Les gènes en chevauchement ont été interprétés comme des candidats exploratoires de chevauchement de classement entre compartiments, plutôt que comme des biomarqueurs conservés validés.
Validation externe appariée aux tissus
La validation par score de module a utilisé des jeux de données publiques indépendants dotés de groupes sources interprétables. La validation des voies respiratoires supérieures comprenait les échantillons de lavage nasal RSV du jeu GSE41374 et les jeux de données SARS-CoV-2 GSE152075 et GSE156063. La validation sanguine comprenait GSE171110 et deux unités du jeu GSE38900 normalisées séparément : GPL10558 (36 échantillons ; 28 RSV et 8 témoins) et GPL6884 (138 échantillons ; 107 RSV et 31 témoins). Pour chaque jeu de données externe, les sondes ont été associées aux symboles HGNC, et les symboles en double ont été regroupés par expression médiane. La même transformation, le même filtrage des valeurs manquantes, l'imputation médiane et les règles de standardisation z par gène appliquées au jeu de données d'ancrage ont été utilisées dans chaque jeu de données. Un score de module a été calculé comme la moyenne non pondérée des valeurs d'expression standardisées des gènes du module représenté. L'AUC-ROC, la précision moyenne et la FDR du test de Welch ont été rapportées comme des métriques de portabilité, et non comme des estimations de la performance diagnostique clinique.
Grands ensembles de données cliniques de référence et de perturbation ex vivo
Deux ensembles de données provenant de sang total ont été utilisés comme cohortes de référence clinique plutôt que comme cohortes de découverte. Dans GSE63990, les échantillons ont été attribués selon les métadonnées d'état d'infection déposées à une infection respiratoire virale (n = 117), une infection respiratoire bactérienne (n = 73) ou une maladie non infectieuse (n = 90) ; les échantillons ne portant pas l'un de ces libellés sans ambiguïté ont été exclus18. Dans GSE40012, les champs de diagnostic déposés ont été regroupés en pneumonie à influenza A (n = 39), pneumonie bactérienne sans influenza (n = 61), SIRS sans pneumonie (n = 40), témoins sains (n = 36) ou pneumonie mixte bactérienne/influenza (n = 14)19. Les échantillons de pneumonie mixte bactérienne/influenza ont été décrits mais exclus des comparaisons binaires de référence.
GSE53543 contient 196 profils de PBMC ex vivo provenant de 98 individus. Chaque individu a fourni un échantillon avec milieu seul et un échantillon exposé au rhinovirus 16 pendant 24 h ; les identifiants des sujets ont confirmé l'existence de 98 paires complètes. Le critère principal évalué était l'AUROC parmi les 98 échantillons stimulés et les 98 échantillons non stimulés, car l'AUROC est une métrique de séparation par rang. L'appariement des sujets a été conservé dans les métadonnées et utilisé dans une analyse de sensibilité appariée des différences de scores. Cette expérience a été analysée séparément des infections cliniques naturelles et n'a pas été utilisée pour étayer des affirmations diagnostiques cliniques.
Les matrices brutes des séries GEO ont été téléchargées pour GSE63990, GSE40012 et GSE53543. La plateforme GPL571 a été utilisée pour GSE63990, GPL6947 pour GSE40012 et GPL10558 pour GSE53543. Les sondes ont été associées aux symboles approuvés par HGNC, et les doublons ont été regroupés par expression médiane. Les matrices normalisées déposées ont été utilisées. La règle générale du 95e centile a déclenché le log₂(x + 1) transformation uniquement pour les matrices sur une échelle non logarithmique. GSE53543 était déjà en échelle logarithmique₂-transformés, normalisés selon le rang et ajustés en fonction du jour de traitement par les investigateurs initiaux, aucune transformation logarithmique supplémentaire n'a donc été appliquée. Après élimination des gènes présentant plus de 20 % de valeurs manquantes et imputation par la médiane des valeurs manquantes restantes, chaque gène a été z-normalisée pour tous les échantillons au sein de son jeu de données. La couche de référence comprenait 470 échantillons cliniques de sang total et 196 échantillons de PBMC ex vivo.
Évaluation comparative des signatures de référence
Les modules nasaux et sanguins d'ancrage ont été évalués par rapport à trois ensembles de référence non pondérés. L'ensemble officiel de 33 ARNm de Pandya a été transcrit à partir du tableau supplémentaire 1 du rapport original du classificateur5. Le comparateur Andres-Terre comprenait 33 gènes orientés vers l'interféron, sélectionnés à partir de la signature multivirus rapportée3. Le comparateur Hallmark comprenait un sous-ensemble de 33 gènes constituant le noyau de la réponse à l'interféron-alpha, associé à l'ensemble MSigDB HALLMARK_INTERFERON_ALPHA_RESPONSE25,26. Les listes complètes des gènes pour les trois ensembles de référence sont fournies dans les données supplémentaires 1. Ces scores de référence ne reproduisent pas les classificateurs pondérés d'origine. Pour chaque jeu de données, un score a été calculé comme la moyenne non pondérée des scores z par gène disponibles ; au moins trois gènes représentés étaient requis, et le nombre de gènes représentés a été indiqué. Les comparaisons d'évaluation comprenaient virus contre bactéries, virus contre non infectieux, virus contre bactéries-ou-non-infectieux, virus contre sain/témoin, et bactéries contre sain/témoin, lorsque les groupes requis étaient disponibles. L'AUC-ROC et la précision moyenne ont été interprétées comme des métriques d'évaluation comparative. Les valeurs P du test de Welch ont été ajustées selon la procédure de Benjamini–Hochberg pour toutes les combinaisons valides jeu de données-comparaison-module dans le tableau d'évaluation comparative.
Validation longitudinale indépendante
Les jeux de données appariés aigu par rapport au congé GSE97741 et GSE97742 ont été utilisés uniquement pour la validation longitudinale27. Les échantillons étiquetés comme infection simple par le VRS (RSVsi) ou rhinovirus (hRV) dans les métadonnées déposées ont constitué l'analyse principale ; les co-infections par le VRS (RSVco) ont été conservées uniquement dans les résultats supplémentaires. Les étiquettes aiguës et de congé ont été extraites des titres des échantillons. Les échantillons ont été appariés par jeu de données, compartiment, groupe viral et identifiant du sujet, et seuls les sujets possédant les deux points temporels ont été conservés. Le groupe combiné principal comprenait 38 paires RSVsi et 30 paires hRV (68 paires par compartiment).
Aucune sélection de gènes, affinement de module ou réglage de seuil n'a été utilisé pour GSE97741 ou GSE97742. Ces jeux de données ont été réservés à la validation externe. Les identifiants de sondes ont été associés aux symboles HGNC approuvés, et les symboles en double ont été regroupés par expression médiane. La même règle de transformation logarithmique au 95e percentile, le même filtre des valeurs manquantes, l'imputation médiane et les procédures de standardisation par gène au sein de chaque jeu de données selon le score z ont été appliquées avant le calcul des scores de module fixes de GSE117827.
Pour chaque tissu et module, les scores aigus et de sortie ont été appariés par sujet et groupe viral. La différence entre aigu et sortie a été calculée pour chaque paire. Le dz de Cohen a été calculé comme la moyenne des différences appariées divisée par son écart-type échantillonnal. Des tests t appariés bilatéraux et des tests de Wilcoxon des rangs signés bilatéraux ont été rapportés, accompagnés de l’AUC-ROC pour la séparation des scores aigus et de sortie. Les valeurs de FDR de Benjamini–Hochberg ont été calculées sur l’ensemble des 20 tests t appariés valides dans la sortie longitudinale complète (deux jeux de données, deux sources de modules et cinq résumés de groupes viraux prédéfinis).
Analyse du gradient des symptômes et analyse a posteriori
Une fois l'appartenance aux modules fixée, les détections de picornavirus asymptomatiques exclues de GSE117827 ont été utilisées uniquement pour l'analyse du gradient des symptômes. Le score clinique ordinal était de 0 pour les témoins négatifs au virus, de 1 pour les détections asymptomatiques de picornavirus et de 2 pour les infections symptomatiques. La corrélation de Spearman a évalué la tendance ordinale, tandis que le test de Kruskal-Wallis a évalué les différences globales entre les trois groupes. Des tests a posteriori de Mann-Whitney U bilatéraux ont comparé les trois paires de groupes. Une correction de Benjamini-Hochberg a été appliquée séparément à l'intérieur de chaque compartiment à sa famille de trois comparaisons par paires.
Enrichissement fonctionnel
Les gènes des modules nasaux et sanguins ont été analysés avec Enrichr à l'aide de gseapy, en utilisant les bibliothèques MSigDB Hallmark 2020, Reactome 2022 et GO Biological Process 2023.25,26,28,29,30,31. Enrichr a utilisé son cadre standard de sur-représentation basé sur le test exact de Fisher. Valeurs corrigées par la méthode de Benjamini-Hochberg telles que rapportées par la bibliothèque P valeurs < 0,05 ont été considérés comme significatifs. Les huit termes les plus significatifs par module parmi les trois bibliothèques interrogées ont été classés par valeur ajustée P valeur. Les résultats d'enrichissement ont été utilisés uniquement à des fins d'interprétation.
Analyses de robustesse, de programme de marqueurs et de variance
Les analyses de robustesse ont vérifié si les résultats dépendaient de la taille des modules ou d'une sélection aléatoire. Des tailles de modules de 10, 25, 50, 100 et 200 gènes ont été évaluées. Pour l'analyse nulle basée sur des gènes aléatoires, l'univers éligible comprenait les gènes codant des protéines selon HGNC présents dans la matrice GSE117827 traitée. Cinq cents ensembles de 50 gènes ont été échantillonnés sans remise en utilisant une graine aléatoire NumPy de 20260622. La réélection par rééchantillonnage a été restreinte aux 1 000 gènes codant des protéines ayant un effet positif et classés aux premiers rangs dans l'analyse d'ancrage initiale pour chaque compartiment. À chaque rééchantillonnage, les gènes codant des protéines positifs ont été classés par valeur P de Welch bilatérale croissante, puis par différence moyenne décroissante. Les 50 gènes situés en tête ont été sélectionnés. La stabilité des gènes a été calculée comme le nombre de sélections divisé par 100. Les 20 gènes ayant la fréquence de sélection la plus élevée dans chaque compartiment ont été affichés.
Les scores des programmes de marqueurs ont été utilisés comme aides descriptives plutôt que comme estimations des fractions cellulaires. Six programmes soigneusement sélectionnés ont été évalués : épithélial (EPCAM, KRT8, KRT18, KRT19, MUC1, KRT5, KRT14, SCGB1A1, FOXJ1), monocyte/macrophage (LYZ, LST1, S100A8, S100A9, FCGR3A, FCGR1A, CD14, MS4A7, CTSS), neutrophile (S100A8, S100A9, MPO, ELANE, CEACAM8, FCGR3B, OLFM4, MMP8), T/NK (CD3D, CD3E, TRAC, NKG7, GNLY, PRF1, GZMB, KLRD1, IL7R), B/plasmocyte (MS4A1, CD79A, CD79B, MZB1, JCHAIN, IGHG1, SDC1) et myéloïde interféron (SIGLEC1, IFI27, IFI44L, ISG15, MX1, OAS1, RSAD2, IFIT3). Chaque score de programme a été calculé comme la moyenne des z-scores par gène disponibles, au moins trois gènes devant être représentés. Les valeurs de P de Spearman ont été ajustées à l’aide de la procédure de Benjamini–Hochberg sur l’ensemble des corrélations entre jeu de données, module et programme. L’eta-carré unidirectionnel a été calculé comme le rapport de la somme des carrés intergroupes divisée par la somme totale des carrés pour chaque paire module-facteur. Les lignes manquantes pour le facteur pertinent ont été exclues de ce calcul. Cette analyse était descriptive et n’a pas corrigé les facteurs mutuellement corrélés.
Reproductibilité
Toutes les analyses ont été réalisées à l'aide de workflows scriptés en Python 3.12.13, les versions des packages logiciels étant indiquées dans le Tableau des matériaux. Les procédures randomisées ont utilisé une graine fixe de 20260622. Les matrices d'expression publiques de GEO ont été traitées selon une structure de projet cohérente, séparant les données brutes, les données traitées, les résultats statistiques, les tableaux et les figures. Les définitions des modules, les registres de curation des échantillons, les estimations des tailles d'effet, les statistiques de validation, les résultats d'enrichissement, les analyses de robustesse et les données sources des figures ont été conservées afin de permettre une vérification indépendante. Le code d'analyse, les spécifications des dépendances et les données dérivées associées sont disponibles conformément à la déclaration sur la disponibilité des données.