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Article de méthode

Un protocole optimisé pour la génération d'organoïdes vasculaires à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines

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DOI :

10.3791/73561

⸱

3 septembre 2026

 ,  , 
1Center for Stem Cell and Translational Medicine, School of Life Science and Medical Engineering, Anhui University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole présente une méthode pour générer des organoïdes vasculaires à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines.

Résumé

Des organoïdes vasculaires dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) se sont imposés comme des modèles tridimensionnels puissants pour l'étude du développement vasculaire, des mécanismes des maladies et des réponses aux médicaments. Les protocoles actuels d'organoïdes vasculaires permettent la génération de réseaux endothéliaux-péricytaires s'auto-organisant ; toutefois, la variabilité d'un lot à l'autre, la formation inconstante des organoïdes et une couverture insuffisante par les péricytes peuvent compromettre la reproductibilité et la possibilité de passage à l'échelle. Cette étude présente un protocole optimisé pour la génération d'organoïdes vasculaires à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) offrant une meilleure reproductibilité et une plus grande cohérence structurelle. Les principales modifications incluent des conditions affinées de formation des corps embryonnaires, des concentrations et des délais d'administration optimisés des facteurs de croissance durant l'induction mésodermique et la spécification vasculaire, ainsi que des conditions de culture tridimensionnelle améliorées favorisant un recrutement robuste des péricytes et des interactions endothélio-péricytaires. Les organoïdes optimisés présentent des réseaux endothéliaux ramifiés, marqués positivement pour CD31, régulièrement entourés de péricytes positifs pour PDGFR-β, avec une variabilité d'un lot à l'autre significativement réduite par rapport au protocole initial. Des procédures détaillées, étape par étape, sont fournies pour la génération des organoïdes, la caractérisation par immunofluorescence en montage entier et l'évaluation du contrôle qualité. Cette méthode optimisée permet la production à grande échelle d'organoïdes vasculaires de haute qualité, adaptés à l'étude des interactions entre cellules vasculaires, à la modélisation des maladies et au criblage de composés, abaissant ainsi le seuil technique pour les laboratoires souhaitant adopter ce système de modélisation.

Introduction

Les organoïdes tridimensionnels (3D) se sont imposés comme des outils puissants pour modéliser le développement et les maladies humaines in vitro, offrant une biomimétique structurale et une pertinence physiopathologique supérieures par rapport aux modèles conventionnels de culture cellulaire bidimensionnelle1,2. Ces dernières années, des organoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) ont été établis avec succès pour plusieurs types de tissus, notamment l'intestin3, le cerveau4,5, le rein6, le foie7,8 et la rétine9. Toutefois, un défi majeur dans les études basées sur les organoïdes est l'insuffisance de vascularisation au cours de cultures à long terme, ce qui peut entraîner une hypoxie et une nécrose, freinant ainsi l'expansion et la différenciation des organoïdes10,11. Pour surmonter cette limitation, diverses stratégies de co-culture ont été introduites, notamment l'incorporation de cellules endothéliales ou de cellules souches mésenchymateuses afin de favoriser la formation de réseaux vasculaires12,13. Cependant, les cultures bidimensionnelles conventionnelles et les modèles animaux ne reproduisent pas fidèlement la biologie vasculaire humaine, tandis que les approches de co-culture ajoutent une complexité expérimentale supplémentaire14. Les organoïdes vasculaires capables de vascularisation autonome représentent donc une alternative prometteuse, pertinente pour l'humain15.

La formation du réseau vasculaire implique à la fois la vasculogenèse et l'angiogenèse, qui sont orchestrées par des interactions entre les cellules endothéliales et les cellules murales, telles que les péricytes et les cellules musculaires lisses vasculaires, et sont strictement régulées par plusieurs molécules de signalisation, notamment le VEGF (facteur de croissance endothélial vasculaire), le TGF-β (facteur de transformation de la croissance-β), le PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes) et les angiopoïétines16. En 2019, Wimmer et ses collègues ont mis au point une méthode permettant de générer directement à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) des organoïdes vasculaires tridimensionnels capables de s'auto-assembler17,18. Ce système génère simultanément des cellules endothéliales et des péricytes, conduisant à la formation de réseaux microvasculaires dotés de lumière et recouverts d'une membrane basale. En s'appuyant sur cette plateforme, les organoïdes vasculaires ont été utilisés pour modéliser une vasculopathie diabétique sous stimulation par une concentration élevée de glucose et par des cytokines pro-inflammatoires (TNF-α et IL-6) ; ces organoïdes reproduisent un épaississement de la membrane basale, caractéristique majeure de la pathologie microvasculaire diabétique17. De plus, ce modèle a été utilisé pour étudier des maladies vasculaires héréditaires et servir de plateforme pour le criblage de la toxicité vasculaire19. Plus récemment, plusieurs études centrées sur la méthodologie ont cherché à optimiser la génération d'organoïdes vasculaires. Par exemple, les progrès réalisés dans le séquençage de l'ARN au niveau de la cellule unique ont permis d'identifier des facteurs régulateurs clés, tels que MECOM et LEF1, fournissant ainsi un cadre moléculaire pour caractériser et optimiser la formation d'organoïdes vasculaires humains. En outre, Xu et al. ont introduit des micropuits afin de faciliter la formation homogène de corps embryonnaires et ont incorporé le cocktail CEPT pour améliorer la viabilité cellulaire, réduisant ainsi efficacement la variabilité d'un lot à l'autre20.

Afin d'améliorer l'homogénéité, la reproductibilité et le débit de production des organoïdes vasculaires, le protocole initial décrit par Wimmer et al.17,18 a été systématiquement optimisé pour remédier à plusieurs limitations majeures. Premièrement, le protocole d'origine repose sur l'agrégation naturelle dans des plaques à faible adhérence pour la formation de corps embryonnaires, ce qui peut entraîner une variabilité importante d'un lot à l'autre en ce qui concerne la taille des agrégats et, par conséquent, une efficacité de différenciation hétérogène. Dans le protocole optimisé, le polyvinyl alcool (PVA) est combiné à un agitation orbitale durant la formation des agrégats afin de favoriser une agrégation cellulaire uniforme et d'améliorer la constance de la taille des corps embryonnaires. Deuxièmement, le protocole initial prévoit un remplacement complet du milieu au cours de la phase de formation du réseau vasculaire, ce qui peut provoquer des fluctuations importantes des concentrations de facteurs de croissance et compromettre la formation prolongée de bourgeons vasculaires ainsi que le recrutement des péricytes. En revanche, le protocole optimisé conserve un tiers du milieu conditionné à chaque changement de milieu, afin de maintenir les facteurs pro-angiogéniques endogènes et de stabiliser l'environnement de culture. Troisièmement, le protocole initial exige plusieurs transferts de plaques durant l'isolement et la maturation des organoïdes, ce qui augmente la manipulation nécessaire et le risque de perte d'organoïdes. Le protocole optimisé évite ces étapes en transférant individuellement les organoïdes isolés dans les puits de plaques 96-puits à faible adhérence, simplifiant ainsi la procédure et augmentant le débit. Dans leur ensemble, ces améliorations fournissent des procédures détaillées étape par étape ainsi que des points de contrôle qualité essentiels, abaissant ainsi le seuil technique requis pour adopter ce système modèle et facilitant l'utilisation plus large des organoïdes vasculaires dans les études sur le développement vasculaire, les mécanismes des maladies et le criblage à haut débit de médicaments.

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Protocole

L'utilisation de cellules souches pluripotentes humaines dans cette étude a été approuvée par le Comité d'éthique biomédicale de l'Université d'Anhui (BECAHU_2026-010).

1. Entretien des cellules souches pluripotentes induites humaines

REMARQUE : Maintenir les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSCs) en conditions sans cellules nourricières. Effectuer toutes les manipulations dans une hotte de sécurité biologique de classe II en utilisant une technique aseptique.

  1. Préparation des plaques de culture revêtues de matrice de membrane basale
    1. Retirer un flacon de matrice de membrane basale de −20 °C et le décongeler à 4 °C pendant la nuit, environ 12 à 16 h. Éviter les cycles de congélation-décongélation répétés.
    2. Mélanger soigneusement la matrice de membrane basale décongelée dans des conditions stériles et la diviser en aliquots à usage unique (par exemple, 1 mL par tube). Conserver les aliquots à −20 °C jusqu’à 2 ans.
      NOTE : Garder la matrice de membrane basale, les pipettes, les embouts et les tubes au froid pendant la manipulation afin d’éviter la solidification prématurée. Éviter d’introduire des bulles d’air.
    3. Décongeler l’aliquot requis de matrice de membrane basale sur de la glace. Diluer la matrice de membrane basale au ratio 1:200 dans du DMEM prérefroidi (5 µL de matrice de membrane basale par 1 mL de DMEM ; concentration finale d’environ 5 µg/mL).
    4. Mélanger délicatement la solution par pipetage jusqu’à disparition complète des particules visibles.
    5. Ajouter 0,5 mL de matrice de membrane basale diluée dans chaque puits d’une plaque de 12 puits. Incliner et faire tourner doucement la plaque afin d’enrober uniformément toute la surface du fond.
    6. Incuber la plaque revêtue à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant au moins 2 h ou à 4 °C toute la nuit.
      NOTE : Conserver les plaques revêtues scellées à 4 °C pendant 1 à 2 semaines. Ramener la plaque à température ambiante et aspirer la solution de revêtement juste avant utilisation.
  2. Décongélation des hiPSCs
    1. Retirer un cryotube contenant des hiPSCs congelées de l’azote liquide et le placer immédiatement dans un bain-marie à 37 °C. Agiter doucement le tube et le retirer en moins de 1 min, lorsque quelques petits cristaux de glace seulement subsistent.
      NOTE : Éviter une exposition prolongée à la diméthylsulfoxyde (DMSO) à 37 °C et une décongélation incomplète, car ces deux facteurs peuvent réduire la viabilité cellulaire.
    2. Désinfecter l’extérieur du cryotube avec de l’éthanol à 70 % et l’ouvrir à l’intérieur de la hotte de sécurité biologique.
    3. Transférer lentement la suspension cellulaire goutte à goutte dans un tube conique de 15 mL contenant 3 mL de milieu de maintenance hPSC chimiquement défini préchauffé, ou un milieu de maintenance chimiquement défini équivalent. Mélanger délicatement pendant le transfert afin de diluer progressivement le DMSO et minimiser le stress osmotique.
    4. Centrifuger les cellules à 300 × g pendant 3 min à température ambiante (22–24 °C) à l’aide d’un rotor à godets oscillants.
    5. Aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot cellulaire. Resuspendre délicatement le culot dans 1 mL de milieu de maintenance hPSC chimiquement défini préchauffé.
      NOTE : Utiliser une pipette P1000 et pipeter doucement 2 à 3 fois pour minimiser les contraintes mécaniques et la formation de bulles.
  3. Ensemencement et culture des hiPSCs
    1. Retirer la plaque de 12 puits prérevêtue de l’incubateur et aspirer la solution de revêtement. Ne pas laver les puits.
    2. Ensemencer environ 1 × 105–2 × 105 cellules viables par puits pour une récupération standard après décongélation. Ajuster la densité selon la lignée de hiPSCs et les besoins expérimentaux.
    3. Distribuer lentement la suspension cellulaire le long de la paroi de chaque puits sans toucher la surface revêtue avec l’embout de pipette.
    4. Ajouter du Y-27632 à une concentration finale de 5 µM pour favoriser la survie et l’attachement cellulaire après décongélation.
      NOTE : Utiliser le Y-27632 uniquement dans le milieu initial d’ensemencement. Le remplacer par un milieu de maintenance hPSC chimiquement défini sans Y-27632 le jour suivant.
    5. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité saturée.
    6. Examiner l’attachement cellulaire et la morphologie après environ 16 à 24 h. Aspirer le milieu et le remplacer par du milieu de maintenance hPSC chimiquement défini frais, préchauffé et sans Y-27632.
    7. Renouveler le milieu quotidiennement ou tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence d’environ 70 % à 80 % pour le passage ou la différenciation.
      NOTE : Examiner les cultures quotidiennement. Utiliser des colonies présentant des bords compacts et bien délimités, un rapport noyau/cytoplasme élevé et une différenciation spontanée minimale.

2. Génération et différenciation d'agrégats de cellules souches pluripotentes induites humaines

REMARQUE : Maintenir les hiPSC en conditions sans cellules nourricières, dans un milieu de culture chimiquement défini pour cellules souches pluripotentes humaines, sur des plaques revêtues de matrice de membrane basale. Repiquer les cellules tous les 4 à 5 jours à l’aide de l’EDTA 0,02 %. Utiliser des cultures présentant une densité d’ensemencement et une taille de colonies appropriées, ainsi qu’une différenciation spontanée minimale, afin d’optimiser l’efficacité de la différenciation vasculaire.

  1. Préparation d'une suspension unicellulaire
    1. Aspirez le milieu de culture chimiquement défini pour les CESP et lavez les hiPSC avec 0,5 mL de DMEM par puits d'une plaque 6 puits.
    2. Aspirez le DMEM et ajoutez 0,5 mL d'EDTA à 0,02 % par puits. Incubez à température ambiante pendant 2 à 4 minutes et surveillez les cellules jusqu'à ce qu'elles commencent à s'arrondir.
    3. Détachez les cellules à l'aide d'une pipette P1000. Pipetez doucement 2 à 3 fois pour dissocier les agrégats en une suspension unicellulaire.
    4. Resuspendez les cellules dans 5 mL de milieu de culture chimiquement défini pour les CESP et transférez la suspension dans un tube conique de 15 mL.
    5. Mélangez 10 µL de la suspension cellulaire avec 10 µL de solution de bleu de trypan à 0,1 %. Chargez 10 µL du mélange dans une chambre de comptage et déterminez le nombre de cellules viables.
    6. Calculez le volume de suspension cellulaire nécessaire pour obtenir 5 × 105 cellules viables par puits.
    7. Centrifugez les cellules à 300 × g pendant 5 minutes à température ambiante (22–23 °C). Aspirez le surnageant.
    8. Resuspendez les cellules dans du milieu de culture chimiquement défini frais pour les CESP contenant 50 µM de Y-27632, à raison de 3 mL par puits.
  2. Formation des agrégats
    1. Ajoutez 3 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque 6 puits à attachement réduit. Ajoutez du PVA pour obtenir une concentration finale de 0,25 %.
    2. Placez la plaque sur un agitateur orbital à 50 tr/min et incubez à 37 °C pendant 1 jour.
    3. Vérifiez la formation d'agrégats aux bords lisses et d'un diamètre d'environ 50 à 100 µm ou plus avant de poursuivre.
    4. REMARQUE : Optimisez la durée d'agrégation selon les lignées d'hiPSC. Prolongez l'incubation à 2 à 3 jours si nécessaire pour obtenir des agrégats de la taille souhaitée.
  3. Induction du mésoderme
    1. Au jour 0, transférez les agrégats dans un tube conique de 15 mL à l'aide d'une pipette jetable stérile de 10 mL. Conservez la plaque initiale à attachement réduit pour le repiquage.
    2. Laissez les agrégats se déposer par gravité pendant environ 15 à 20 minutes.
    3. REMARQUE : Manipulez les agrégats délicatement et utilisez la sédimentation par gravité plutôt que la centrifugation afin de minimiser les dommages mécaniques.
    4. Aspirez soigneusement le surnageant une fois les agrégats déposés.
    5. Resuspendez les agrégats dans 3 mL par puits de milieu N2B27 supplémenté avec 12 µM de CHIR99021 et 30 ng/mL de BMP-4.
    6. Replaquez les agrégats dans la plaque à attachement réduit et incubez à 37 °C.
    7. Pipetez doucement les agrégats une fois par jour avec une pipette P1000 afin de limiter la fusion excessive des agrégats. Poursuivez l'induction du mésoderme pendant 3 jours.
  4. Induction de la lignée vasculaire
    1. Au jour 3, transférez les agrégats dans un tube conique de 15 mL et laissez-les se déposer par gravité. Conservez la plaque 6 puits initiale.
    2. Aspirez soigneusement le surnageant une fois les agrégats déposés.
    3. Resuspendez les agrégats dans 3 mL par puits de milieu N2B27 supplémenté avec 100 ng/mL de VEGF-A et 2 µM de forskoline.
    4. Replaquez les agrégats dans la plaque 6 puits à attachement réduit et incubez pendant 2 jours supplémentaires.

3. Génération de réseaux vasculaires et d'organoïdes

  1. Préparation de la matrice de collagène I–membrane basale
    1. Récupérez les agrégats générés dans une plaque 6-puits pour les inclure dans une plaque 12-puits. Utilisez environ 40 à 60 agrégats par puits.
    2. Préparez un mélange suffisant de matrice de collagène I–membrane basale pour ajouter deux couches de 0,5 mL à chaque puits de la plaque 12-puits.
    3. Préparez 12 mL de matrice pour une plaque 12-puits. Conservez tous les composants sur glace, préparez le mélange juste avant utilisation et évitez d'introduire des bulles d'air.
    4. Ajoutez 0,5 mL de matrice dans chaque puits de la plaque 12-puits. Faites tourner doucement la plaque pour répartir la matrice uniformément.
    5. Incubez la plaque à 37 °C pendant 2 h afin de permettre la solidification de la première couche de matrice.
  2. Inclusion des agrégats
    1. Transférez les agrégats dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette jetable stérile de 10 mL et laissez-les se déposer par gravité.
    2. Aspirez le surnageant et lavez les agrégats deux fois avec 1 mL de milieu N2B27. Éliminez autant que possible le milieu résiduel après le dernier lavage.
    3. Préparez un nouveau mélange de matrice de collagène I–membrane basale et maintenez-le sur glace.
    4. Resuspendez délicatement les agrégats lavés dans la matrice fraîchement préparée.
    5. Retirez la plaque 12-puits contenant la première couche solidifiée de l’incubateur.
    6. Ajoutez 0,5 mL de la matrice contenant les agrégats dans chaque puits.
    7. Balayez doucement la plaque pendant moins de 1 minute pour répartir uniformément les agrégats.
    8. Incubez immédiatement la plaque à 37 °C pendant 2 h afin de permettre la solidification de la seconde couche.
  3. Induction de la formation de bourgeons vasculaires
    1. Préchauffez le milieu N2B27 supplémenté avec 15 % de FBS, 100 ng/mL de VEGF-A et 100 ng/mL de FGF-2 à 37 °C.
    2. Ajoutez le milieu préchauffé supplémenté à chaque puits pour induire la différenciation vasculaire.
    3. Surveillez les cultures pendant les 1 à 3 jours suivants pour observer la formation de bourgeons vasculaires.
    4. REMARQUE : préchauffez le milieu à 37 °C avant de l’ajouter aux cultures afin de minimiser la déstabilisation de la matrice gélatineuse.
  4. Changement du milieu et entretien de la culture
    1. Effectuez le premier changement de milieu 3 jours après l’inclusion.
    2. Remplacez le milieu tous les deux jours par du milieu N2B27 frais contenant 15 % de FBS, 100 ng/mL de VEGF-A et 100 ng/mL de FGF-2.
    3. Conservez un tiers du milieu conditionné à chaque changement et remplacez les deux tiers restants par du milieu frais supplémenté.
  5. Poursuivez vers l’isolement des organoïdes vasculaires au jour 10.

4. Mise en place d'organoïdes vasculaires et préparation à la coloration

  1. Isolation de réseaux vasculaires individuels
    1. Insérez l'extrémité arrondie d'une spatule stérile le long du bord de la cavité et détachez délicatement la matrice gélatineuse du fond.
    2. Poursuivez en déplaçant la spatule du bord de la cavité vers le centre jusqu'à ce que toute la matrice gélatineuse flotte librement.
    3. Utilisez deux aiguilles stériles pour exciser des réseaux vasculaires individuels à partir du gel. Retirez autant de matrice excédentaire que possible sans endommager le réseau vasculaire.
  2. Culture d'organoïdes isolés
    1. Transférez chaque organoïde isolé directement dans une cavité individuelle d'une plaque 96 puits à faible adhérence à l'aide d'une pipette jetable stérile.
    2. Ajoutez 100 µL de milieu N2B27 supplémenté avec 15 % de FBS, 100 ng/mL de VEGF-A et 100 ng/mL de FGF-2 dans chaque puits.
    3. Incubez les organoïdes pendant 5 jours supplémentaires et remplacez le milieu supplémenté quotidiennement.
    4. Vérifiez que les organoïdes présentent une morphologie arrondie et entièrement encapsulée au jour 5 de maturation.
  3. Fixation des organoïdes vasculaires
    1. Transférez les organoïdes morphologiquement matures dans des tubes microcentrifuges de 2 mL. Traitez pas plus d'environ 60 organoïdes par tube.
    2. Aspirez soigneusement le milieu et ajoutez du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS.
    3. Fixez les organoïdes à température ambiante pendant 1 h.
      PRÉCAUTION : Le PFA est toxique et suspecté d'être cancérigène. Manipulez le PFA sous une hotte chimique en portant des équipements de protection individuelle adaptés.
    4. Aspirez le PFA et remplacez-le par du PBS.
      POINT D'ARRÊT : Conservez les organoïdes vasculaires fixés dans du PBS à 4 °C pendant jusqu'à 1 mois.

5. Coloration et imagerie confocale d'organoides vasculaires

  1. Blocage et perméabilisation
    1. Ajouter 2 mL de tampon de blocage dans chaque tube contenant des organoïdes vasculaires fixés.
    2. Placer les tubes verticalement sur un agitateur orbital et incuber avec agitation à température ambiante pendant 2 h afin de bloquer et de perméabiliser les organoïdes.
  2. Incubation avec l'anticorps primaire
    1. Aspirer le tampon de blocage et ajouter 50–100 µL d'anticorps primaire dilué au 1:100 dans le tampon de blocage.
    2. Placer les tubes à la verticale sur un agitateur et incuber avec agitation à 4 °C toute la nuit.
  3. Lavage et incubation avec l'anticorps secondaire
    1. Laver les échantillons trois fois avec du PBST pendant 10–15 min par lavage. Agiter les tubes placés verticalement pendant chaque lavage.
    2. Ajouter l'anticorps secondaire fluorescent dilué au 1:300 dans le tampon de blocage.
    3. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 2 h.
  4. Contre-coloration nucléaire et lavage final
    1. Laver les échantillons deux fois avec du PBST pendant 10–15 min par lavage.
    2. Ajouter la solution de Hoechst diluée au 1:5 000 dans du PBS et incuber à température ambiante pendant 10–15 min.
    3. Laver les échantillons avec du PBS pendant 10–15 min.
  5. Imagerie confocale
    1. Transférer les organoïdes marqués dans des boîtes d'imagerie confocale.
    2. Acquérir des images confocales en utilisant des paramètres d'imagerie constants pour tous les groupes expérimentaux.
  6. Analyse quantitative d'images d'organoïdes vasculaires
    REMARQUE : Effectuer l'analyse quantitative d'images à l'aide de Fiji/ImageJ et d'AngioTool. Maintenir des paramètres d'acquisition microscopique identiques pour tous les groupes expérimentaux.
    1. Mesure du diamètre des agrégats
      1. Acquérir des images en champ clair d'agrégats de hiPSC au jour 0 à l'aide d'un microscope inversé équipé d'une échelle calibrée. Imager des agrégats bien séparés et inclure une barre d'échelle.
      2. Importer chaque image dans Fiji/ImageJ. Tracer une ligne le long de la barre d'échelle à l'aide de l'outil Ligne droite et sélectionner Analyser > Définir l'échelle.
      3. Saisir la distance et l'unité connues (par exemple, 100 µm) et sélectionner Global pour appliquer l'étalonnage à toutes les images de la session.
      4. Tracer une ligne traversant le diamètre maximal de chaque agrégat à l'aide de l'outil Ligne droite. Sélectionner Analyser > Mesurer ou appuyer sur Ctrl+M et enregistrer le diamètre en µm.
      5. Mesurer au moins 30 agrégats par lot.
      6. Pour les agrégats non sphériques, délimiter chaque agrégat à l'aide de l'outil de sélection Ovale ou Polygone. Sélectionner Analyser > Définir les mesures > Diamètre de Feret et enregistrer la mesure.
      7. Exporter les mesures à partir du tableau Résultats et compiler les données dans un tableur.
      8. Calculer la moyenne, l'écart type (ET) et le coefficient de variation (CV) selon la formule CV = ET/moyenne × 100 % pour chaque lot.
    2. Mesure du diamètre des organoïdes
      1. Acquérir des images en champ clair d'organoïdes vasculaires matures au jour 15 à l'aide d'un microscope inversé équipé d'une échelle calibrée. Inclure une barre d'échelle dans chaque image.
      2. Importer chaque image dans Fiji/ImageJ et étalonner l'échelle comme décrit à l'étape
      3. Tracer une ligne traversant le diamètre maximal de chaque organoïde à l'aide de l'outil Ligne droite. Sélectionner Analyser > Mesurer ou appuyer sur Ctrl+M et enregistrer le diamètre en µm.
      4. Mesurer au moins 30 organoïdes par lot.
      5. Pour les organoïdes de forme irrégulière, mesurer les diamètres le plus long et le plus court et calculer leur moyenne, ou déterminer le diamètre de Feret comme décrit à l'étape 5.6.1.6.
      6. Exporter les mesures et calculer la moyenne, l'ET et le CV pour chaque lot.
    3. Quantification de la surface vasculaire positive pour CD31
      1. Acquérir des images en z-stacks confocales d'organoïdes entiers montés au jour 15 marqués pour CD31. Utiliser des réglages identiques de puissance laser, de gain, de décalage et de diaphragme pour tous les échantillons.
      2. Générer des projections d'intensité maximale (MIP) à partir des z-stacks à l'aide du logiciel du microscope ou de Fiji/ImageJ.
      3. Appliquer un seuil d'intensité pour segmenter le réseau vasculaire positif pour CD31 tout en excluant le signal de fond.
      4. Sélectionner Traiter > Bruit > Supprimer les valeurs aberrantes et utiliser un rayon de 2–5 pixels pour supprimer les petits artefacts. Sélectionner Traiter > Binaire > Remplir les trous pour combler les petits espaces au sein du réseau vasculaire.
      5. Sélectionner Analyser > Définir les mesures et activer Surface et Fraction de surface. Sélectionner Analyser > Mesurer pour déterminer la surface vasculaire.
      6. Calculer la surface vasculaire positive pour CD31 en pourcentage de la surface totale de l'organoïde.
      7. Analyser au moins trois organoïdes par lot provenant de trois lots indépendants. Exporter les mesures pour une analyse statistique.
    4. Quantification de la couverture des péricytes positifs pour PDGFR-β
      1. Acquérir des images en z-stacks confocales d'organoïdes entiers montés au jour 15 marqués pour CD31 et PDGFR-β. Générer des MIP à partir des z-stacks.
      2. Importer les MIP des canaux CD31 et PDGFR-β dans Fiji/ImageJ et vérifier l'alignement des images.
      3. Appliquer un seuil au canal CD31 pour générer un masque binaire définissant le réseau vasculaire.
      4. Appliquer un seuil au canal PDGFR-β en utilisant la même approche de segmentation pour générer un masque binaire du signal des péricytes.
      5. Sélectionner Traiter > Calculateur d'images et appliquer l'opération ET aux masques CD31 et PDGFR-β pour identifier les pixels superposés.
      6. Mesurer la surface du signal superposé.
      7. Calculer la couverture des péricytes selon la formule : (surface positive pour PDGFR-β dans les vaisseaux positifs pour CD31 / surface vasculaire totale positive pour CD31) × 100 %.
      8. Analyser au moins trois organoïdes par lot provenant de trois lots indépendants. Exporter les mesures pour une analyse statistique.
    5. Analyse de l'indice de ramification à l'aide d'AngioTool
      1. Acquérir des images en z-stacks confocales d'organoïdes entiers montés au jour 15 marqués pour CD31. Générer des MIP à partir des z-stacks.
      2. Lancer AngioTool et charger l'image MIP.
      3. Régler le diamètre des vaisseaux selon le diamètre typique observé sur les images.
      4. Ajuster le seuil d'intensité pour segmenter le réseau vasculaire tout en excluant le signal de fond. Régler la taille minimale des vaisseaux pour exclure les petits artefacts.
      5. Exécuter l'analyse et enregistrer la surface des vaisseaux, la densité vasculaire, la longueur totale des vaisseaux, le nombre de jonctions et l'indice de ramification.
      6. Vérifier l'image de sortie en confirmant que la vasculature est délimitée en jaune, le squelette vasculaire est affiché en rouge et les points de ramification sont marqués par des points bleus.
      7. Exporter les résultats quantitatifs d'AngioTool.
      8. Analyser au moins trois champs par lot provenant de trois lots indépendants et compiler les données pour une analyse statistique.

6. Analyse par PCR quantitative en temps réel d'organoïdes vasculaires

REMARQUE : effectuer toutes les étapes d'isolement de l'ARN et les procédures en aval dans des conditions exemptes de RNase.

  1. Extraction d'ARN
    1. Prélevez 5 à 10 organoïdes vasculaires matures du jour 15 dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL exempt de RNase. Éliminez complètement le milieu résiduel.
      NOTE : Regroupez plusieurs organoïdes si nécessaire afin d'obtenir suffisamment d'ARN.
    2. Ajoutez 350 µL de tampon de lyse supplémenté avec 1 % de β-mercaptoéthanol.
    3. Aspirez et expulsez les échantillons 10 à 15 fois jusqu'à ce que les organoïdes soient complètement lysés.
    4. Transférez le lysat dans une colonne de spin d'élimination de l'ADN génomique placée dans un tube de collecte. Centrifugez à 11 000 × g pendant 30 s à température ambiante.
    5. Jetez la colonne et conservez le flux sortant.
    6. Ajoutez un volume égal d'éthanol à 70 %, environ 350 µL, au flux sortant et mélangez soigneusement par pipetage.
    7. Transférez jusqu'à 700 µL du mélange dans une colonne de spin pour ARN placée dans un tube de collecte. Centrifugez à 11 000 × g pendant 30 s et jetez le flux sortant.
    8. Ajoutez 350 µL du tampon de lavage 1 sur la colonne. Centrifugez à 11 000 × g pendant 30 s et jetez le flux sortant.
    9. Préparez le mélange d'ADNase I en combinant 10 µL d'ADNase I avec 70 µL de tampon de digestion d'ADNase par échantillon.
    10. Ajoutez 80 µL du mélange d'ADNase I directement sur la membrane de la colonne et incubez 15 min à température ambiante.
    11. Ajoutez 350 µL du tampon de lavage 1 sur la colonne. Centrifugez à 11 000 × g pendant 30 s et jetez le flux sortant.
    12. Ajoutez 500 µL du tampon de lavage 2 sur la colonne. Centrifugez à 11 000 × g pendant 30 s et jetez le flux sortant.
    13. Répétez le lavage avec 500 µL de tampon de lavage 2.
    14. Centrifugez la colonne vide à 11 000 × g pendant 2 min pour sécher la membrane.
    15. Transférez la colonne dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL exempt de RNase. Ajoutez 30 à 50 µL d'eau exempt de RNase directement sur la membrane et incubez 1 min à température ambiante.
    16. Centrifugez à 11 000 × g pendant 1 min pour éluer l'ARN. Conservez l'ARN à −80 °C jusqu'à utilisation.
      NOTE : Évaluez la concentration et la pureté de l'ARN par spectrophotométrie. Utilisez un rapport A260/A280 compris entre 1,8 et 2,1 comme plage acceptable.
  2. Synthèse d'ADNc
    1. Préparez le mélange de réaction de transcription inverse sur de la glace.
    2. Combinez 600 ng d'ARN total avec 4 µL de mélange maître RT contenant la transcriptase inverse, le tampon, les dNTP et les amorces aléatoires. Ajoutez de l'eau exempt de RNase jusqu'à un volume final de 20 µL.
    3. Incubez la réaction à 37 °C pendant 15 min, puis à 85 °C pendant 5 s.
    4. Conservez l'ADNc obtenu à −20 °C jusqu'à utilisation.
  3. PCR quantitative en temps réel
    1. Préparez 9 µL de mélange maître de qPCR par réaction en combinant 5 µL de mélange maître SYBR Green 2×, 3 µL d'eau exempt de RNase et 1 µL d'amorces directe et inverse prémélangées à 10 µM chacune.
    2. Distribuez 9 µL de mélange maître dans chaque puits d'une plaque de qPCR à 96 puits.
    3. Ajoutez 1 µL d'ADNc dans chaque puits afin d'obtenir un volume final de réaction de 10 µL.
    4. Fermez la plaque avec un film adhésif optique et centrifugez à 1 000 × g pendant 1 min.
    5. Effectuez une dénaturation initiale à 95 °C pendant 30 s.
    6. Effectuez 40 cycles d'amplification de 95 °C pendant 5 s suivis de 60 °C pendant 30 s.
    7. Effectuez une analyse de courbe de fusion pour confirmer la spécificité de l'amplicon.
      NOTE : Analysez chaque échantillon en double ou en triple.
    8. Calculez l'expression relative du gène cible en utilisant la méthode 2−ΔΔCt. Normalisez les valeurs de Ct au gène de référence (par exemple, GAPDH) et calibrez l'expression par rapport aux échantillons d'hiPSC non différenciés.

7. Analyse statistique

  1. Présenter les données quantitatives sous forme de moyenne ± l'écart type (ET) à partir d'au moins trois réplicats biologiques indépendants (n ≥ 3) par condition.
  2. Traiter chaque lot indépendant comme un réplicat biologique pour les mesures du diamètre des agrégats et des organoïdes, et faire la moyenne des 30 structures individuelles mesurées dans chaque lot afin d'obtenir une moyenne au niveau du lot.
  3. Mesurer la surface vasculaire moyenne, la couverture par les péricytes et l'indice de ramification à partir de plusieurs organoïdes ou champs au sein de chaque lot afin d'obtenir une valeur par lot, puis utiliser ces valeurs par lot pour les comparaisons statistiques.
  4. Comparer le protocole optimisé avec le protocole original de Wimmer à l'aide d'un test t de Student non apparié bilatéral t-test.
  5. Définir la signification statistique comme p < 0,05. Indiquer les niveaux de signification comme p < 0.05, p < 0,01, et p < 0,001, selon le cas.
  6. Effectuer toutes les analyses statistiques à l'aide du logiciel de statistique, version 10.

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Résultats

Le protocole optimisé décrit ici permet la génération d'organoides vasculaires matures à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) en environ 15 jours, en utilisant une stratégie de différenciation étagée (Figure 1A). Brièvement, des agrégats de hiPSC ont été formés dans des plaques à faible attachement supplémentées avec 0,25 % de PVA sur un agitateur orbital (jour −1). L'induction du mésoderme a été initiée au jour 0 à l'aide de CHIR99021 (12 µM) et de BMP-4 (30 ng...

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Discussion

Le protocole optimisé décrit ici introduit plusieurs améliorations clés au système de différenciation d'organoides vasculaires initialement établi par Wimmer et al.18, dans le but d'améliorer l'homogénéité, la reproductibilité et l'intégrité structurelle de la génération d'organoides vasculaires. Par rapport au protocole d'origine, la méthode optimisée apporte des améliorations significatives selon les aspects suivants. Premièrement, l'optimisation des conditions de formation des agrégats améliore...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas avoir d'intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (NSFC) dans le cadre du Young Scientists Fund (C) (n° 32200655) et du programme général (n° 32270847). Les auteurs remercient également la plateforme de services publics de l'Université d'Anhui pour son soutien.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Filtre à bouteille de 0,22 μmNalgeneFPE204030Pour la filtration stérile des milieux et des tampons
Tubes coniques de 15 mLSparkJadeGD0001Stérile
Tubes microcentrifuges de 2 mLEppendorf22363204Stérile
2-Mercaptoéthanol (1000×)Gibco21985023À utiliser sous hotte
Alexa Fluor 488 AffiniPure F2 Fragment âne anti-IgG de lapin (H+L)LableadY1104Anticorps secondaire ; diluer à 1:300
Alexa Fluor 594 AffiniPure F(ab′)2 Fragment âne anti-IgG de chèvre (H+L)LableadY1007Anticorps secondaire ; diluer à 1:300
Anticorps anti-CD31Cell Signaling3528sAnticorps primaire ; diluer à 1:100 dans le tampon de blocage
Anticorps anti-PDGFR βZenbio347269Anticorps primaire ; diluer à 1:100 dans le tampon de blocage
Compteur cellulaire automatiséLife TechnologiesCountess™ IIInclut des lames-chambres de comptage
Supplément B27 (50×)Gibco17504044Pour le milieu N2B27 ; décongeler à 4ºC, aliquoter et stocker à −20ºC, éviter les cycles de congélation-décongélation
Centrifugeuse de bancZonkiaSC-3610Avec rotor à godets oscillants
Cabinet de sécurité biologique (Classe II)Thermo FisherNANA
BMP4ProteintechHZ-1045Reconstituer dans de l’eau ddH2O stérile à 100 ng/μL, aliquoter et stocker à −20 °C
Albumine sérique bovine (BSA)Biosharp9048-46-8Pour le tampon de blocage
CHIR99021MCEHY-10182Préparer un stock à 10 mM dans le DMSO, stocker à −20ºC jusqu’à 1 an
Incubateur à CO2Fisher ScientificLS-CO15037 ºC, 5 % CO2, humidifié
Plaque d’imagerie confocaleBiosharpBS-20-GJMPour l’imagerie après coloration
Microscope confocalLEICANAÉquipé d’objectifs 10×, 20×, 63× et du logiciel ZEN
DMEMVivacellC3113-0500Pour la dilution de Matrigel et la solution de collagène I
DMEM/F-12, supplément GlutaMAXGibco10565018Pour la dilution de Matrigel et le milieu N2B27
EDTA (0,5 M, pH 8,0)InvitrogenAM9260GDiluer avec du PBS à 0,02 % pour le passage
Sérum de veau fœtal (FBS)Gibco10270-106Pour le milieu de différenciation complet N2B27 (15 % final)
FGF-2NovoproteinC046Préparer un stock à 1 mg/mL dans du PBS stérile, aliquoter et stocker à −20ºC
ForskolineR&D Systems1099Préparer un stock à 10 mM dans du DMSO, stocker à −20ºC
HEPES (1 M)Gibco15630080Pour la solution de collagène I
HoechstBeyotimeC1071S-4Préparer un stock à 1 mg/mL dans de l’eau déionisée, aliquoter et stocker à −20ºC
Microscope inverséLEICADMIL LEDPour l’observation routinière des cellules
Matrigel (réduit en facteurs de croissance)STEEMABM05Stocker à −20ºC après aliquotation, éviter les cycles de congélation-décongélation ; manipuler sur glace
Solution d’acides aminés non essentiels MEM (NEAA, 100×)Gibco11140035Pour le milieu N2B27
Supplément N2 (100×)Gibco17502048Pour le milieu N2B27 ; stocker à −20ºC à l’abri de la lumière
Milieu NeurobasalGibco21103049Pour le milieu N2B27
Eau sans nucléase (sans DNase/RNase)LableadDoo55WJPour la préparation d’ARN/cADN et la qPCR
Agitateur orbitalJoan LabNAPour les étapes de lavage
Paraformaldéhyde (solution à 4 %)ServicebioG1101Diluer dans du PBS à 4 % pour la fixation ; utiliser sous hotte
Pénicilline-Streptomycine (100×)Gibco15140122Pour le milieu N2B27
Milieu PGM1CellapyA1517001Milieu d’expansion des hiPSC ; stocker à 4ºC à l’abri de la lumière, stable pendant 2 semaines
Supplément PGM1 (25×)CellapyA1517101À utiliser avec le milieu basal PGM1
Alcool polyvinylique (PVA)Sigma-AldrichP8136Dissoudre dans le PGM1 à 0,25 % (p/v) pour favoriser l’agrégation
PureCol (collagène de type I bovin, 3 mg/mL)Advanced BioMatrix5005Pour le mélange collagène I-Matrigel ; tester le lot pour sa capacité de polymérisation
Cycleur thermique qPCRThermo FisherStepOnePlus™Avec fonction courbe de fusion ; pour la détection en temps réel par PCR
Kit de transcription inverseAccurate BiologyAG11706Pour la synthèse de cADN à partir d’ARN total ; contient un mélange maître RT avec transcriptase inverse, tampon, dNTPs et amorces aléatoires
Kit d’extraction d’ARNYeasen19221ES50Pour l’isolement d’ARN total à partir d’organoides vasculaires ; inclut des colonnes d’élimination d’ADN génomique et de l’ADNase I sans RNase
Bicarbonate de sodium (7,5 %)Gibco25080094Pour la solution de collagène I
Désoxycholate de sodiumSigma-AldrichD6750Préparer une solution à 1 % (p/v) dans de l’eau déionisée pour le tampon de blocage
Hydroxyde de sodium (1,0 N)Sigma-AldrichS2770Pour l’ajustement du pH de la solution de collagène I
Pipettes jetables stériles (10 mL)Bkmamlab110205007Individuellement emballées, stériles
Pointes de pipette filtrantes stériles (1000, 200, 20 μL)BiozymVT0270/VT0250/VT0220Stériles, avec filtre
Aiguille stérile (30 G)NANAPour la dissection des réseaux vasculaires
Spatule stérile (extrémité ronde)Fisher Scientific21-401-5En acier inoxydable
SYBR Green Master MixAccurate BiologyAG11733Concentration 2× pour qPCR ; contient une ADN polymérase thermostable, tampon, dNTPs et colorant SYBR Green
Plaque de culture tissulaire traitée 12 puitsBD Falcon353043Pour l’encapsulation en gel et la culture de réseaux vasculaires
Plaque de culture tissulaire traitée 6 puitsEppendorf30720113Standard, traitée TC
Triton X-100Sigma-AldrichT9084Pour le tampon de blocage
Bleu de trypan (0,4 %)Thermo Fisher15250061Pour le comptage cellulaire
Tween 20Sigma-AldrichP7949Pour la solution de lavage PBS-T à 0,05 %
Plaque 6 puits à attachement ultra-faibleCorning3471Pour la formation d’agrégats et la différenciation
Plaque 96 puits ronde à fond plat, à attachement ultra-faibleBeyotimeFULA962-6pcsPour la culture en suspension d’organoides vasculaires
VEGF-AProteintechHZ-1038Préparer un stock à 1 mg/mL dans du PBS stérile, aliquoter et stocker à −20ºC
Bain-marieBlue pardHWS-2437ºC
Y-27632MCEHY-10071Préparer un stock à 10 mM dans du PBS stérile ou du DMSO, stocker à −20ºC ; concentrations de travail : 5 μM (décongélation), 50 μM (formation d’agrégats)

Références

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