Cette étude identifie cinq biomarqueurs liés à la cuproptose et à la ferroptose dans la rectocolite ulcéreuse grâce à une approche intégrée combinant apprentissage automatique, séquençage de l'ARN au niveau cellulaire unique et validation expérimentale, offrant ainsi des perspectives pour le diagnostic clinique et l'immunothérapie ciblée.
Article de recherche
Ciblage de la ferroptose et de la cuproptose dans la rectocolite hémorragique : résultats issus d'une bio-informatique complète et d'une validation expérimentale
Dans cet article
Résumé
Résumé
La colite ulcéreuse (CU) est un trouble intestinal persistant dont la pathogenèse n'est pas entièrement définie et dont la prévalence ainsi que les taux d'hospitalisation augmentent dans les pays récemment industrialisés. Dans la CU, la mort excessive des cellules épithéliales intestinales perturbe la barrière muqueuse et déclenche des réponses inflammatoires. La ferroptose et la cuproptose sont deux formes récemment décrites de mort cellulaire régulée. La plupart des études sur la CU ont examiné ces processus séparément ; toutefois, leurs rôles combinés dans la progression de la CU restent insuffisamment caractérisés. Afin d'étudier leurs rôles synergiques dans la pathogenèse de la CU, nous avons utilisé une approche progressive combinant un profilage transcriptomique à grande échelle pour identifier des cibles candidates, suivie d'une validation dans des modèles in vitro. Les gènes différentiellement exprimés (DEG) ont été croisés avec les gènes associés à la ferroptose (FRG) et les gènes associés à la cuproptose (CRG). Les cibles communes ont été priorisées à l'aide d'un consensus d'algorithmes d'apprentissage automatique et d'une analyse de réseau de co-expression génique pondérée (WGCNA). Cinq biomarqueurs — LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 et CD274 — se sont révélés fortement surexprimés dans la CU. Une analyse unicellulaire a caractérisé leur expression à travers différents types cellulaires, montrant que LCN2 et NOS2 étaient principalement enrichis dans les cellules épithéliales. La pertinence mécanistique de ces marqueurs a été évaluée davantage par des tests in vitro. Le traitement par des inhibiteurs de la ferroptose ou de la cuproptose a atténué l'inflammation associée à la CU et modulé l'expression des biomarqueurs dans des modèles cellulaires Caco-2. Ces résultats identifient cinq biomarqueurs associés à la progression de la CU et fournissent des preuves expérimentales appuyant leur potentiel d'application en diagnostic clinique et en intervention thérapeutique.
Introduction
La colite ulcéreuse (CU) est une maladie inflammatoire chronique de l'intestin à évolution récidivante, associée à un fardeau mondial croissant et à des coûts de traitement à long terme importants1,2. Bien que les aminosalicylates, les corticostéroïdes, les traitements biologiques et les petites molécules aient élargi les options thérapeutiques, l'obtention d'une rémission durable reste difficile pour de nombreux patients3,4. Ce besoin clinique non satisfait souligne l'importance d'identifier des marqueurs moléculaires reproductibles et des mécanismes accessibles susceptibles de favoriser un diagnostic précoce et une thérapie guidée par les mécanismes5.
La ferroptose est une forme dépendante du fer de mort cellulaire régulée, induite par la peroxydation lipidique, l'épuisement du glutathion et l'altération de l'activité de la GPX46. Des niveaux élevés de fer et de malondialdéhyde dans la rectocolite ulcéreuse sont compatibles avec une lésion épithéliale ferroptotique, tandis que l'activation expérimentale de l'axe SLC7A11–GSH–GPX4 ou l'inhibition directe de la ferroptose peut protéger la barrière intestinale7,8.
La cuproptose, décrite en 2022, est déclenchée lorsque le cuivre se lie à des protéines mitochondriales lipoylées, entraînant une agrégation des protéines et un stress protéotoxique9. Étant donné que l'intestin joue un rôle central dans la régulation du cuivre, la perturbation de cette voie pourrait amplifier les lésions épithéliales oxydatives et inflammatoires dans la rectocolite ulcéreuse10.
La ferroptose et la cuproptose pourraient converger par le biais d'un déséquilibre des ions métalliques, du métabolisme mitochondrial, de l'appauvrissement en glutathion et du stress oxydatif11. Cependant, on ignore encore si cette interaction produit une signature moléculaire reproductible dans la colite ulcéreuse et si une telle signature répond à une inhibition spécifique des voies impliquées.
L'hypothèse de l'étude était que la communication désordonnée entre la ferroptose et la cuproptose dans la CU converge vers une signature reproductible de biomarqueurs pouvant être priorisée à partir de jeux de données transcriptomiques en masse et unicellulaires, et atténuée par une inhibition spécifique des voies dans un modèle de lésion de l'épithélium intestinal. En conséquence, des analyses bioinformatiques multicohortes, un apprentissage automatique, une analyse unicellulaire et des expériences ciblées sur des cellules Caco-2 ont été combinées afin d'identifier et d'évaluer fonctionnellement des biomarqueurs candidats (Figure 1).
Figure 1 : Flux de travail de l'étude. Flux de travail intégré pour le criblage transcriptomique multicohorte, la priorisation de biomarqueurs basée sur l'apprentissage automatique et les réseaux, la localisation au niveau cellulaire unique et la validation par inhibiteurs dans les cellules Caco-2. RC : rectocolite ulcéreuse ; GEO : Gene Expression Omnibus ; WGCNA : analyse de réseau de co-expression génique pondérée ; PPI : interaction protéine-protéine ; ROC : caractéristique de fonctionnement du récepteur ; GSEA : analyse d'enrichissement des ensembles de gènes. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Protocole
Cette étude a utilisé des ensembles de données accessibles au public et des lignées cellulaires humaines disponibles commercialement. Aucun participant humain, tissu humain nouvellement collecté ou animal vertébré n'a été impliqué ; par conséquent, aucune approbation par un comité d'éthique institutionnel n'était requise. Les outils de recherche, logiciels et ressources en ligne utilisés dans le protocole sont répertoriés dans le Tableau des matériaux.
1. Traitement des données pour l'analyse d'expression différentielle
Pour établir les cohortes de découverte et de validation transcriptomiques, la base de données Gene Expression Omnibus (GEO) a été interrogée à l’aide du terme « ulcerative colitis ». Quatre jeux de données — GSE87466, GSE92415, GSE107499 et GSE75214 — ont été utilisés comme ensemble d’apprentissage, tandis que GSE47908 a été réservé à la validation externe. Les jeux de données d’apprentissage ont été normalisés et corrigés par lot à l’aide de ComBat dans Sangerbox 3.0, tandis que le jeu de données de validation a été traité indépendamment.
Un total de 583 gènes liés à la ferroptose (FRG) a été obtenu à partir de FerrDB et complété par des gènes rapportés dans la littérature afin de réduire le biais d'une source unique12. Un ensemble de 96 gènes liés à la cuproptose (CRG) a été compilé à partir d'études publiées12,13,14. L'expression différentielle a été analysée à l'aide de limma avec des seuils de |variation du log₂| > 1 et une valeur P ajustée selon Benjamini–Hochberg < 0,05. Les graphiques diagnostiques de la normalisation, de la correction par lot, de l'expression différentielle et du regroupement sont fournis dans la figure supplémentaire 1. La composition des échantillons, les plateformes et les attributions des cohortes sont indiquées dans le tableau supplémentaire 1.
2. Identification des gènes différentiellement exprimés dans la FC au cours de la RC
Une analyse de corrélation de Pearson a été réalisée en utilisant des seuils de |r| > 0,5 et P < 0,05 afin d'identifier les gènes liés à la ferroptose (FRGs) et les gènes liés au cuproptose (CRGs) coexprimés. L'ensemble génique obtenu a été croisé avec les gènes différentiellement exprimés (DEGs) afin d'identifier les gènes différentiellement exprimés coexprimés impliqués dans le cuproptose–ferroptose (CF-DEGs).
3. Analyse d'enrichissement
Des analyses d'enrichissement de l'ontologie génique (GO) et de l'Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG) ont été réalisées à l'aide de clusterProfiler et de la plateforme Bioinformatics.com.cn. Un seuil de significativité défini par une valeur P ajustée selon Benjamini–Hochberg < 0,05 a été utilisé. Les graphiques d'enrichissement sont fournis dans la Figure supplémentaire 2.
4. Analyse de réseau de co-expression génique pondéré (WGCNA)
La structure modulaire sous-jacente aux profils d'expression génique a été analysée à l'aide de l'analyse de réseau de co-expression génique pondérée (WGCNA). Des échantillons anormaux ont été identifiés et exclus par regroupement hiérarchique combiné à la fonction goodSamplesGenes. Une puissance de seuil doux (β) appropriée a ensuite été déterminée afin de satisfaire le critère de topologie sans échelle pour la construction du réseau.
Les données d'expression traitées ont été utilisées pour construire une matrice de superposition topologique (TOM) destinée à l'analyse de la co-expression génique. À l'aide de l'approche de découpage dynamique de l'arbre, les gènes présentant des profils d'expression fortement cohérents ont été regroupés en modules géniques, chacun contenant au moins 100 gènes. Les associations entre les eigengènes des modules (ME) et les phénotypes ont été analysées afin d'identifier les modules liés au processus de la maladie et d'extraire les jeux de gènes correspondants. Les diagnostics de dépistage WGCNA sont fournis dans la figure supplémentaire 3.
5. Sélection des biomarqueurs
Pour hiérarchiser les candidats en vue d'un suivi expérimental, trois algorithmes d'apprentissage automatique ont été appliqués en parallèle¹⁵. Une régression par l'opérateur de sélection et de réduction absolue (LASSO) a été utilisée pour la sélection des caractéristiques, une forêt aléatoire avec ntree = 500 a permis de classer l'importance des gènes, et une machine à vecteurs de support avec élimination récursive des caractéristiques (SVM-RFE) a été employée pour identifier le sous-ensemble de caractéristiques présentant l'erreur de validation croisée la plus faible. Le diagnostic complet du criblage est fourni dans la figure supplémentaire 5.
L'importance des gènes a été évaluée en fonction de la contribution de chaque gène à la précision de la classification, et les gènes les mieux classés ont été regroupés afin de constituer un ensemble préliminaire de gènes¹⁶. L'algorithme SVM-RFE a effectué un criblage des caractéristiques et une optimisation du modèle par élimination itérative des caractéristiques, permettant ainsi d'identifier le sous-ensemble optimal de caractéristiques pour la classification¹⁷. Les gènes communs aux trois algorithmes ont été considérés comme des biomarqueurs candidats identifiés par apprentissage automatique.
Les gènes différentiellement exprimés associés à la CF ont été utilisés pour construire un réseau d'interactions protéine–protéine (PPI), et CytoHubba a permis de classer les nœuds centraux. L'intersection des modules clés de WGCNA, des trois sorties d'apprentissage automatique et de l'ensemble central du réseau PPI a permis d'identifier cinq biomarqueurs candidats intégrés : LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 et CD274. Ces gènes ont été classés comme des candidats diagnostiques associés à la colite ulcéreuse. Des expériences ultérieures avec des inhibiteurs ont ensuite classé LCN2, IDO1, CXCL2 et NOS2 comme des marqueurs sensibles à l'inhibition de la ferroptose, et CD274 comme un marqueur sensible à l'inhibition de la cuproptose. Ces gènes n'ont pas été considérés comme des régulateurs en amont prouvés de l'une ou l'autre voie.
6. Développement du modèle prédictif et évaluation multiméthode
Afin d'évaluer le potentiel clinique de translation de la signature génique identifiée, un nomogramme a été construit à l'aide du package rms pour évaluer la performance diagnostique. La performance du modèle a été évaluée à l'aide d'une courbe de calibration, du test de Hosmer–Lemeshow (HL) et de l'indice de concordance de Harrell (C-index).
L'étalonnage du modèle a été évalué à l'aide du test de Hosmer-Lemeshow (HL) et de l'erreur absolue moyenne (MAE). Une valeur P > 0,05 et une MAE < 0,1 ont été établies comme seuils pour un ajustement et une précision du modèle acceptables, respectivement. Des courbes caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC) ont été générées, et l'aire sous la courbe (AUC) a été calculée afin d'évaluer les performances prédictives du nomogramme pour la CU. Un jeu de données indépendant a été utilisé pour évaluer la généralisabilité et la stabilité du modèle.
7. Analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes (GSEA)
Dans le jeu d'apprentissage, une analyse de corrélation de Spearman a été réalisée entre chaque biomarqueur et tous les autres gènes. Les résultats de corrélation ont été classés afin de générer un ensemble de gènes ordonné. Une analyse d'enrichissement des ensembles de gènes (GSEA) a été effectuée en utilisant l'ensemble de gènes c2.cp.kegg_medicus.v2025.1.Hs.symbols de la base de données Molecular Signatures Database (MSigDB) comme référence. Les voies biologiques ayant une valeur P < 0,05 ont été considérées comme significativement enrichies.
8. Analyse du paysage immunitaire
L'outil CIBERSORT et la matrice de signature LM22 ont été utilisés pour effectuer une analyse de déconvolution des données d'expression et estimer les proportions des 22 sous-types de cellules immunitaires. Une analyse de corrélation de Spearman a ensuite été réalisée pour évaluer les associations entre les cinq biomarqueurs et les sous-types de cellules immunitaires.
9. Analyse du réseau régulatoire
Les informations relatives à la régulation des gènes par les facteurs de transcription (TF) et les microARN (miARN) ont été obtenues à partir des bases de données intégrées ChEA3 et TarBase 9.0 via la plateforme NetworkAnalyst. Les miARN associés à au moins deux nœuds ont été inclus dans le réseau régulateur.
10. Séquençage ARN unicellulaire
Les jeux de données unicellulaires de la maladie de Crohn GSE116222, comprenant trois échantillons sains et trois échantillons atteints de la maladie de Crohn, et GSE214695, comprenant six échantillons sains et six échantillons atteints de la maladie de Crohn, ont été intégrés. Les cellules ont été conservées si elles contenaient entre 200 et 5 000 gènes détectés, >1 000 identifiants moléculaires uniques, < 30 % des transcrits mitochondriaux, < 3 % de transcrits d'hémoglobine, et < 50 % des transcrits ribosomaux. La fonction NormalizeData a été utilisée pour la normalisation, et Harmony a été utilisée pour la correction par lot avant le regroupement et l'annotation.
Après filtration, les données ont été normalisées à l'aide de la fonction NormalizeData. Harmony a été utilisée pour minimiser les effets de lot entre les échantillons. L'approximation uniforme des variétés et la projection (UMAP) ainsi que l'embedding stochastique t-distribué des voisins les plus proches (t-SNE) ont été utilisées pour la réduction de dimensionnalité et le regroupement cellulaire afin de caractériser les structures locales et globales au sein de la population cellulaire. Un total de 31 712 cellules de haute qualité a été conservé pour des analyses supplémentaires. Les types cellulaires ont été annotés selon les gènes marqueurs canoniques des cellules.
Une analyse de pseudotemporel a été réalisée à l'aide de Monocle 2 afin d'étudier les changements dans les états des cellules épithéliales et myéloïdes provenant de tissus atteints de rectocolite ulcéreuse. Les trajectoires développementales cellulaires et les différences entre groupes ont été évaluées, et les profils d'expression des biomarqueurs le long de la trajectoire pseudotemporelle ont été visualisés.
CellChat a été utilisé pour évaluer la communication cellule-cellule entre les sous-populations épithéliales et myéloïdes. Les profils d'expression spécifiques aux sous-populations ont été intégrés afin d'inférer les probabilités d'interaction et les principales voies de signalisation entre les cellules épithéliales et myéloïdes, et de caractériser leurs réseaux régulateurs intercellulaires potentiels.
11. Expériences sur les cellules
Les cellules humaines de carcinome colorectal Caco-2 ont été cultivées dans un milieu de Dulbecco modifié (Eagle) contenant 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine, à 37 °C en atmosphère à 5 % de CO₂. Les cellules Caco-2 ont été choisies comme modèle reproductible de monolame épithéliale pour les tests de barrière intestinale et de lésion inflammatoire ; toutefois, leur origine cancéreuse limite l’extrapolation directe à l’épithélium colique non cancéreux. Les informations concernant les passages cellulaires n’étaient pas disponibles dans les dossiers expérimentaux archivés.
Un modèle in vitro d'inflammation-lésion a été établi en exposant les cellules à 1 µg/mL de lipopolysaccharide (LPS) pendant 24 h. Les cellules ont été réparties entre un groupe témoin recevant le véhicule diméthylsulfoxyde, un groupe LPS seul, un groupe LPS + 4 µM de ferrostatine-1 ou un groupe LPS + 40 µM de tétrathiomolybdate, avec des concentrations finales de solvant appariées. Le groupe LPS seul a servi de témoin positif de lésion/modèle pour les comparaisons de récupération par inhibition.
- Viabilité cellulaire
La viabilité cellulaire a été évaluée à l’aide d’un test de viabilité cellulaire conformément aux instructions du fabricant. Après une incubation à 37 °C pendant environ 2 h, l’absorbance à 450 nm a été mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaques. - Mesure des niveaux de MDA et de Fe²⁺
Les niveaux intracellulaires de malondialdéhyde (MDA) et de Fe2⁺ ont été mesurés à l’aide des kits d’analyse correspondants, conformément aux instructions des fabricants. La quantité totale de protéines a été déterminée par un dosage à l’acide bichinconinique, et chaque résultat a été normalisé par rapport à la teneur en protéines de l’échantillon correspondant. - Dosage au moyen d’une sonde fluorescente spécifique des ions cuivre
Après élimination du milieu de culture, une sonde fluorescente spécifique du Cu2⁺ a été ajoutée à une concentration finale de 1 µM et incubée pendant 30 min à 37 °C. Les images ont été acquises immédiatement sans lavage à l’aide d’un microscope à fluorescence inversé, avec des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 510 et 578 nm, respectivement. Les paramètres d’acquisition ont été maintenus constants entre les groupes, et l’échelle de la barre de mesure des images a été calibrée à 50 µm. - RT-qPCR
L’ARN total a été isolé à l’aide d’un réactif d’extraction d’ARN à base de phénol–guanidinium. L’ADN complémentaire a été synthétisé à partir de 1 µg d’ARN à l’aide d’un kit de synthèse du brin complémentaire, et des réactifs basés sur le vert SYBR ont été utilisés pour la PCR en temps réel. Chaque réaction a été réalisée en triple exemplaire technique. Les séquences des amorces sont indiquées dans le Tableau 2 supplémentaire, et l’abondance relative des ARN messagers a été calculée selon la méthode 2⁻ΔΔCt.
12. Analyse statistique
La normalité et l'homogénéité des variances ont été évaluées à l'aide des tests de Shapiro–Wilk et de Levene centré sur la médiane, respectivement. Les données satisfaisant aux deux hypothèses ont été analysées à l'aide d'un test t non apparié bilatéral ou d'une analyse de la variance à un facteur suivie du test de différence honnêtement significative de Tukey. Lorsqu'une des hypothèses n'était pas respectée, le test t de Welch ou l'analyse de la variance de Welch suivie de comparaisons de Games–Howell a été utilisé.
Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart type. Les nombres réels de réplicats biologiques, les valeurs P exactes bilatérales et les vérifications des hypothèses sont indiqués dans le Tableau supplémentaire 3. La feuille source archivée de la Figure 13 contient moins de réplicats témoins pour les panneaux A (n = 4), C (n = 4) et F (n = 2), tandis que toutes les autres combinaisons de panneaux/groupes contiennent n = 6.
Les analyses computationnelles ont été réalisées à l'aide de R et des pipelines limma, WGCNA, clusterProfiler, glmnet, randomForest, e1071, pROC, rms, Seurat v4, Harmony, Monocle 2, CellChat, et Cytoscape/CytoHubba. Les ressources en ligne comprenaient FerrDB, GEO, STRING, ChEA3, TarBase 9.0, NetworkAnalyst, CIBERSORT/LM22, MSigDB, Bioinformatics.com.cn et Sangerbox 3.0.
Résultats
Identification et annotation fonctionnelle des gènes coexprimés dans la cuproptose et la ferroptose
Quatre jeux de données d'entraînement comprenant 421 échantillons de CU et 97 contrôles sains ont été intégrés. Un total de 551 gènes différentiellement exprimés, dont 362 surexprimés et 189 sous-exprimés, ont été identifiés. L'analyse de corrélation a révélé 444 gènes corrélés à la ferroptose et à la cuproptose, et l'intersection avec les gènes différentiellement exprimés a produit 32 gènes différentiellement exprimés co-exprimés liés à la cuproptose et à la ferroptose (CF-DEG).
Les 32 gènes différentiellement exprimés chez les patients atteints de mucoviscidose (CF-DEG) étaient enrichis dans les réponses aux lésions tissulaires, aux ions cuivre, au transport des acides gras, au lipopolysaccharide, à la maladie inflammatoire de l'intestin, à la signalisation de NF-κB, à la signalisation de TNF et à la ferroptose (Tableau supplémentaire 4).
Priorisation des biomarqueurs fondamentaux par apprentissage automatique intégré et WGCNA
L'analyse de réseau de co-expression génique pondéré (WGCNA) a identifié MEpurple, MEbrown et MEblack comme les modules les plus fortement associés à la CU. Ensemble, les modules sélectionnés contenaient 1 426 gènes (Tableau supplémentaire 5).
L'opérateur de sélection et de réduction absolue minimale (LASSO), la machine à vecteurs de support avec élimination récursive de caractéristiques (SVM-RFE) et la forêt aléatoire ont sélectionné respectivement 21, 32 et 19 caractéristiques. Treize gènes étaient communs aux trois modèles. L'intégration du consensus issu de l'apprentissage automatique, du noyau d'interaction protéine-protéine classé par CytoHubba et des modules WGCNA sélectionnés a permis d'obtenir cinq biomarqueurs candidats associés à la colite ulcéreuse : LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 et CD274.
Évaluation diagnostique et enrichissement des voies des signatures de biomarqueurs
Les cinq biomarqueurs candidats étaient tous positivement corrélés et surexprimés dans la colite ulcéreuse dans la cohorte d'apprentissage (Figure 2A, B). Chaque marqueur a atteint une aire sous la courbe caractéristique de fonctionnement du récepteur > 0,80 dans le groupe d'entraînement et > 0,75 dans la cohorte de validation indépendante GSE47908 (Figure 2C–E).
Le nomogramme à cinq gènes a montré une bonne calibration, avec une valeur P de Hosmer-Lemeshow > 0,05 et une erreur absolue moyenne < 0,1, ainsi qu'une bonne discrimination dans la cohorte analysée, avec une aire sous la courbe et un indice de concordance de 0,945, et un intervalle de confiance à 95 % pour l'indice de concordance de 0,922 à 0,968 (Figure 3).
L'analyse d'enrichissement des ensembles de gènes a associé les cinq candidats aux voies de signalisation JAK–STAT, interféron–RIPK1/3 et récepteur Toll-like–NF-κB (Figure 4).
Figure 2 : Expression des biomarqueurs candidats et performance diagnostique. (A) Carte thermique de corrélation. (B, C) Expression des biomarqueurs et courbes caractéristiques de fonctionnement du récepteur dans la cohorte d'apprentissage. (D, E) Expression des biomarqueurs et courbes caractéristiques de fonctionnement du récepteur dans la cohorte de validation GSE47908. ROC : caractéristique de fonctionnement du récepteur ; AUC : aire sous la courbe ; UC : colite ulcéreuse. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Développement et évaluation du nomogramme pour la CU. (A) Nomogramme à cinq gènes. (B) Courbe de calibration. (C) Courbe caractéristique de fonctionnement du récepteur. ROC : caractéristique de fonctionnement du récepteur ; CU : colite ulcéreuse ; AUC : aire sous la courbe ; indice C : indice de concordance. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse d'enrichissement des ensembles de gènes des cinq biomarqueurs candidats. (A–E) Résultats de l'analyse d'enrichissement des ensembles de gènes pour LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 et CD274, respectivement. GSEA : analyse d'enrichissement des ensembles de gènes. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Analyse du paysage de l'immunomicroenvironnement et du réseau régulateur
Les échantillons de CU ont montré des proportions accrues de neutrophiles, de lymphocytes T CD4⁺ à mémoire activés, de macrophages M1 et de mastocytes activés, accompagnées d'une diminution concomitante de macrophages M2, de mastocytes au repos et de cellules dendritiques au repos. Ces profils ont été reproduits dans le groupe de validation (Figure 5A–E).
Les cinq candidats étaient corrélés positivement aux neutrophiles, aux lymphocytes T CD4⁺ mémoire activés et aux macrophages M1, et négativement aux mastocytes au repos et aux macrophages M2 (Figure 5F–J). Le réseau gène-miARN comprenait 98 nœuds et 146 arêtes. hsa-miR-34a-5p et hsa-miR-16-5p présentaient la plus forte connectivité en tant que biomarqueurs, tandis que AR et RELA étaient les facteurs de transcription les plus connectés (Figure 6).
Figure 5 : Analyse de l'infiltrat immunitaire. (A) Composition en cellules immunitaires. (B) Différences intergroupes dans les proportions des cellules immunitaires. (C) Carte thermique de corrélation entre les cellules immunitaires. (D, E) Infiltration des cellules immunitaires dans les cohortes d'apprentissage et de validation. (F–J) Corrélations entre les biomarqueurs candidats et les populations de cellules immunitaires. UC : colite ulcéreuse. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Réseaux prévus de microARN et de facteurs de transcription. (A) Réseau gène–microARN. Les cercles indiquent les biomarqueurs candidats et les carrés indiquent les microARN. (B) Réseau facteur de transcription–gène. Les losanges indiquent les biomarqueurs candidats et les triangles inversés indiquent les facteurs de transcription. microARN : microARN ; FT : facteur de transcription. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Dynamique d'expression spatiotemporelle à une résolution unicellulaire
Après le contrôle de qualité, 31 712 cellules ont formé 22 grappes annotées comme neuf populations cellulaires majeures (Figure 7A–C). Les proportions de cellules épithéliales et de plasmocytes étaient plus élevées dans la CU. LCN2 et NOS2 étaient enrichis dans les cellules épithéliales, tandis que IDO1, CXCL2 et CD274 étaient enrichis dans les cellules myéloïdes (Figure 7D–G).
Le sous-groupement des cellules épithéliales a identifié 11 sous-ensembles, avec une expansion des colonocytes inflammatoires et un enrichissement en LCN2 et NOS2 dans ce sous-ensemble (Figure 8). Le sous-groupement des cellules myéloïdes a identifié sept sous-ensembles, avec une augmentation des monocytes, une réduction des macrophages et un enrichissement en IDO1, CXCL2 et CD274 dans les monocytes (Figure 9).
Les colonocytes inflammatoires se sont accumulés tardivement au cours de la trajectoire épithéliale, avec une expression croissante de LCN2 et de NOS2 (Figure 10). Les monocytes ont présenté une trajectoire distincte associée à la colite ulcéreuse, avec une expression dynamique de IDO1, CXCL2 et CD274 (Figure 11).
Les colonocytes inflammatoires ont montré une signalisation sortante la plus forte et une communication importante avec les monocytes. Le couple ligand–récepteur APP–CD74 était prédominant entre ces sous-populations (Figure 12).
Figure 7 : Expression des biomarqueurs candidats au sein des populations cellulaires. (A) Regroupements cellulaires. (B) Marqueurs d'annotation. (C) Neuf populations cellulaires annotées. (D, E) Distribution et proportions des cellules dans les échantillons sains et ceux de rectocolite ulcéreuse. (F, G) Expression des biomarqueurs candidats visualisée par UMAP et graphique en bulles. RCU : rectocolite ulcéreuse ; UMAP : approximation uniforme des variétés et projection. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Sous-regroupement des cellules épithéliales et expression des candidats. (A) Regroupements initiaux des cellules épithéliales. (B) Marqueurs d'annotation. (C) Sous-ensembles de cellules épithéliales annotés. (D) Proportions des sous-ensembles dans les échantillons sains et ceux atteints de rectocolite ulcéreuse. (E) Expression de LCN2 et de NOS2 dans les sous-ensembles de cellules épithéliales. t-SNE : plongement stochastique t-distribué de voisins proches ; UC : rectocolite ulcéreuse. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Sous-groupement des cellules myéloïdes et expression des candidats. (A) Grappes initiales de cellules myéloïdes. (B) Marqueurs d'annotation. (C) Sous-ensembles de cellules myéloïdes annotés. (D) Proportions des sous-ensembles dans les échantillons sains et ceux de rectocolite ulcéreuse. (E) Expression de IDO1, CXCL2 et CD274 dans les sous-ensembles de cellules myéloïdes. t-SNE : embedding stochastique de voisins t-distribué ; UC : rectocolite ulcéreuse. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 10 : Analyse du pseudotemps des cellules épithéliales. (A) Trajectoire du pseudotemps et attribution des états. (B) Répartition des cellules épithéliales saines et de celles issues de patients atteints de rectocolite ulcéreuse (UC) le long de la trajectoire. (C) Dynamique d'expression de LCN2 et de NOS2 en fonction du pseudotemps. UC : rectocolite ulcéreuse. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 11 : Analyse de la pseudo-temporalité des cellules myéloïdes. (A) Trajectoire en pseudo-temps et attribution des états. (B) Répartition des cellules myéloïdes saines et de celles issues de patients atteints de rectocolite ulcéreuse (UC) le long de la trajectoire. (C) Dynamique d'expression de IDO1, CXCL2 et CD274 en fonction du pseudo-temps. UC : rectocolite ulcéreuse. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 12 : Communication épithéliale–myéloïde. (A) Nombre et force des interactions. (B) Forces de signalisation sortante et entrante. (C) Interactions impliquant des colonocytes inflammatoires. (D) Carte thermique de la force de communication. (E) Paires ligand–récepteur impliquant des colonocytes inflammatoires. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
In vitro validation expérimentale d'interventions ciblant la ferroptose et la cuproptose
L'exposition au lipopolysaccharide (LPS) a réduit la viabilité des cellules Caco-2 et augmenté l'expression de l'IL-6 et de l'IL-1β par rapport au témoin traité au véhicule (Figure 13A–C et Figure supplémentaire 5).
Le LPS a augmenté les concentrations de Fe2⁺, de malondialdéhyde et l'abondance en ARN messager de LCN2, IDO1, CXCL2 et NOS2, tandis que la ferrostatine-1 a inversé chacun de ces changements induits par le LPS (Figure 13D–I). Pour les comparaisons entre LPS et LPS + ferrostatine-1, les valeurs P exactes bilatérales variaient de 9,45 × 10⁻5 à 0,0027 après moyenne des réplicats techniques au sein de chaque réplicat biologique.
Le LPS a réduit la viabilité et augmenté l'IL-6, l'IL-1β, FDX1/DLAT, CD274 et la fluorescence sensible au cuivre, tandis que le tétrathiomolybdate a inversé ces modifications (Figure 14 A–E). Pour les comparaisons entre LPS et LPS + tétrathiomolybdate, les valeurs P exactes bilatérales variaient de < 1 × 10⁻15 à 0,0008.
Dans leur ensemble, les analyses ont identifié cinq candidats diagnostiques associés à la colite ulcéreuse, localisé leur expression au niveau des populations épithéliales et myéloïdes, et montré que LCN2, IDO1, CXCL2 et NOS2 répondaient à l'inhibition de la ferroptose, tandis que CD274 réagissait à la chélation du cuivre dans les cellules Caco-2.
Figure 13 : Le ferrostatine-1 atténue les modifications inflammatoires associées au LPS et liées à la ferroptose dans les cellules Caco-2. (A) Viabilité cellulaire. (B, C) Expression des ARN messagers de l'IL-6 et de l'IL-1β. (D, E) Niveaux intracellulaires de malondialdéhyde et de Fe2⁺. (F–I) Expression des ARN messagers de LCN2, IDO1, CXCL2 et NOS2. Les mesures techniques réalisées en triplets ont été moyennées au sein de chaque réplicat biologique indépendant ; les barres d'erreur indiquent l'écart type. Les nombres disponibles de réplicats biologiques étaient de Control n = 4 dans A et C, Control n = 2 dans F, et n = 6 pour toutes les autres combinaisons de panneaux/groupes. Les valeurs exactes de P bilatérales et les vérifications des hypothèses sont indiquées dans le Tableau supplémentaire 5. Fer-1 : ferrostatine-1 ; LPS : lipopolysaccharide ; MDA : malondialdéhyde. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 14 : Le tétraithiomolybdate atténue les modifications inflammatoires et liées à la cuproptose associées au LPS dans les cellules Caco-2. (A) Viabilité cellulaire. (B, C) Expression de l'ARN messager de l'IL-6 et de l'IL-1β. (D) Expression de l'ARN messager de FDX1 et de DLAT. (E) Expression de l'ARN messager de CD274. (F) Fluorescence intracellulaire de Cu2⁺ ; échelle = 50 µm. Les mesures techniques réalisées en triplets ont été moyennées pour chacune des six répétitions biologiques indépendantes par groupe ; les barres d'erreur indiquent l'écart type. Les valeurs exactes de P bilatérales et les vérifications des hypothèses sont indiquées dans le Tableau supplémentaire 5. TTM : tétraithiomolybdate ; LPS : lipopolysaccharide. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Les données brutes et traitées, les scripts d'analyse et les feuilles de calcul sources des expériences sur les cellules sont accessibles publiquement à l'adresse https://doi.org/10.5281/zenodo.21202720.
Figure supplémentaire 1 : Prétraitement des données et diagnostics de l'expression différentielle. (A–F) Répartitions des échantillons avant (A–C) et après (D–F) correction du biais technique. (G) Graphique en volcan de l'expression différentielle des gènes. (H) Carte thermique des profils d'expression normalisés. DEGs : gènes différentiellement exprimés ; GEO : Gene Expression Omnibus.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Analyse d'enrichissement des CF-DEGs. (A) Enrichissement de l'ontologie génique. (B) Enrichissement de l'Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes. CF-DEGs : gènes différentiellement exprimés co-exprimés dans la cuproptose et la ferroptose ; GO : ontologie génique ; KEGG : Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 3 : Diagnostics de dépistage WGCNA. (A) Sélection du seuil doux. (B) Regroupement par eigengènes de modules. (C) Dendrogramme gène-module. (D) Associations module-trait. (E–G) Relations entre la significativité des gènes et l'appartenance au module pour les modules violet, brun et noir. WGCNA : analyse du réseau de coexpression génique pondéré ; UC : colite ulcéreuse.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 4 : Dépistage multistade de biomarqueurs. (A, B) Sélection de caractéristiques par LASSO. (C, D) Sélection de caractéristiques par SVM-RFE. (E, F) Classement des caractéristiques par forêt aléatoire. (G) Consensus entre les trois modèles. (H, I) Réseau d'interactions protéine-protéine et nœuds centraux identifiés par CytoHubba. (J) Intégration des résultats issus de l'apprentissage automatique, de l'analyse WGCNA et du réseau PPI. (K) Localisations chromosomiques des cinq candidats. LASSO : opérateur de sélection et de réduction absolue minimale ; SVM-RFE : élimination récursive de caractéristiques par machine à vecteurs de support ; RF : forêt aléatoire ; PPI : interaction protéine-protéine ; WGCNA : analyse de réseau de coexpression génique pondérée.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 5 : Validation du modèle LPS dans les cellules Caco-2. (A) Viabilité cellulaire. (B, C) Expression de l'ARN messager des cytokines IL-6 et IL-1β. Les mesures techniques réalisées en triplicat ont été moyennées à partir de six réplicats biologiques indépendants par groupe ; les barres d'erreur indiquent l'écart type. LPS : lipopolysaccharide.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 1 : jeux de données GEO utilisés pour la découverte et la validation. Numéros d'accès des jeux de données, plates-formes, composition des échantillons et affectation des cohortes pour les jeux de données GEO inclus dans les analyses de découverte et de validation. GEO : Gene Expression Omnibus.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 2 : Séquences des amorces pour la PCR quantitative par transcription inverse. Séquences d'amorces utilisées pour l'analyse par PCR quantitative par transcription inverse des gènes évalués dans cette étude.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 3 : Détails statistiques pour les figures 13, 14 et la figure supplémentaire 1. Nombre de réplicats biologiques, vérifications des hypothèses, méthodes d'analyse statistique et valeurs P exactes pour les comparaisons expérimentales indiquées.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 4 : Gènes différentiellement exprimés coexprimés dans la cuproptose et la ferroptose. Liste des gènes différentiellement exprimés en commun (CF-DEG) identifiés par l'intersection des gènes corrélés à la ferroptose et à la cuproptose avec les gènes différentiellement exprimés.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 5 : Gènes des modules WGCNA sélectionnés pour le criblage de biomarqueurs. Liste des gènes contenus dans les modules WGCNA sélectionnés pour le criblage ultérieur de biomarqueurs. WGCNA : analyse de réseau de coexpression génique pondérée.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Cette étude a combiné des analyses transcriptomiques globales, l'apprentissage automatique, des analyses unicellulaires et des expériences ciblées sur des cellules afin d'examiner les interactions entre la ferroptose et la cuproptose dans la rectocolite ulcéreuse (UC). Cinq candidats diagnostiques associés à l'UC se sont révélés reproductibles dans les cohortes de découverte et de validation, étaient principalement localisés dans les compartiments épithélial et myéloïde, et présentaient une expression sensible à l'inhibition de voies dans les cellules Caco-2. Ces résultats appuient un protocole en étapes dans lequel une priorisation computationnelle oriente une validation biologique ciblée, tout en évitant d'affirmer de manière plus forte que les cinq gènes sont des régulateurs en amont établis de la ferroptose ou de la cuproptose.
Les gènes différentiellement exprimés dans la FC étaient enrichis dans les réponses au lipopolysaccharide, à la gestion du cuivre, au transport des lipides, à la signalisation NF-κB/TNF et à la ferroptose, établissant un lien cohérent entre le stress oxydatif dépendant des métaux et l'inflammation de la muqueuse10,19.
Les cinq candidats occupent des contextes complémentaires liés à l'inflammation et au stress métallique. LCN2 relie le piégeage du fer, le dyséquilibre microbien et l'axe de la ferroptose LCN2–ALOX1520,21,22,23 ; IDO1 relie le métabolisme du tryptophane, l'inflammation muqueuse et une régulation perturbée du fer24,25,26 ; et CXCL2 relie la signalisation IL-17/IL-22, le recrutement des neutrophiles et la peroxydation lipidique27,28,29,30. NOS2 exerce des effets dépendants du contexte, mais peut amplifier les lésions oxydatives et la sensibilité à la ferroptose lorsqu'il est surexprimé31,32,33,34,35,36. CD274 est un marqueur épithélial régulateur de l'immunité dont la relation avec FDX1 et la sensibilité aux ionophores de cuivre suggère une réponse à la cuproptose plutôt qu'un contrôle établi de la voie37,38,39. Les expériences avec des inhibiteurs ont confirmé ces classifications : le ferrostatine-1 a réduit les niveaux de LCN2, IDO1, CXCL2 et NOS2, tandis que le tétrathiomolybdate a réduit CD274.
L'analyse immunitaire a en outre associé la signature candidate aux macrophages M1, aux neutrophiles, aux lymphocytes T CD4⁺ à mémoire activés et aux mastocytes activés, tous capables de maintenir une lésion épithéliale par l'intermédiaire de cytokines, d'espèces réactives de l'oxygène et de signaux perturbant la barrière40,41,42,43,44. RELA, hsa-miR-34a-5p et hsa-miR-16-5p se sont révélés comme des régulateurs en amont plausibles, tandis que les preuves d'un rôle direct du récepteur des androgènes dans la colite ulcéreuse restent limitées45,46,47,48,49,50. Ces résultats doivent être interprétés comme des hypothèses au niveau du réseau, destinées à guider de futures expériences de perturbation, plutôt que comme une preuve de régulation directe.
L'analyse au niveau cellulaire a localisé LCN2 et NOS2 dans les colonocytes inflammatoires, et IDO1, CXCL2 et CD274 dans les populations myéloïdes riches en monocytes. Les colonocytes inflammatoires étaient prévus comme des centres de communication, avec la paire ligand–récepteur épithélium–myéloïde APP–CD74 parmi les plus importantes51,52,53,54,55,56. Cette résolution au niveau des types cellulaires restreint le contexte biologique dans lequel les cinq candidats doivent être testés, et soutient l'utilisation de systèmes de co-culture ou d'organoïdes associés à des cellules immunitaires comme prochaine étape expérimentale.
Plusieurs limites restreignent l'interprétation. Caco-2 est une lignée cellulaire d'adénocarcinome colorectal et ne reproduit pas complètement l'épithélium colique non cancéreux, l'hétérogénéité des patients, les interactions stroma-immunitaires ou la rectocolite ulcéreuse chronique ; par conséquent, une validation dans des cellules épithéliales intestinales primaires, des organoïdes dérivés de patients, des systèmes de co-culture et des modèles d'inflammation intestinale in vivo est nécessaire. Le tableur source de l'Figure 13 archivé manquait également de certaines données de réplicats contrôles dans les panneaux A, C et F, réduisant ainsi la précision pour ces comparaisons ; tous les nombres de réplicats disponibles et les valeurs P exactes sont indiqués dans le Tableau Supplémentaire 5. Enfin, l'âge, le sexe, l'exposition aux traitements et d'autres covariables cliniques n'étaient pas uniformément disponibles dans les cohortes publiques. Des cohortes prospectives multicentriques et une perturbation directe des cinq candidats seront nécessaires pour établir l'utilité diagnostique et des rôles causaux. Dans le cadre de ces limites, l'étude fournit un ensemble transparent et ancré expérimentalement d'hypothèses reliant la mort cellulaire dépendante des métaux, la communication épithélio-myéloïde et la rectocolite ulcéreuse. Des recherches comparables en pharmacologie des réseaux dans le cancer de la prostate illustrent la valeur génératrice d'hypothèses du triage computationnel des cibles, mais ne constituent pas une validation spécifique à la rectocolite ulcéreuse57. De même, la récente discussion sur la ferroptose dans l'arthrose et la dégénérescence osseuse reflète un intérêt thérapeutique plus large pour la modulation de la ferroptose, bien que les mécanismes spécifiques à chaque maladie ne puissent être directement extrapolés à la rectocolite ulcéreuse58. La validation dans des cohortes externes et les expériences avec des inhibiteurs ont donc été utilisées pour renforcer, sans exagérer, les associations issues de l'analyse bioinformatique.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le projet Young Qihuang Scholar de l'Administration nationale de la médecine traditionnelle chinoise (subvention no 2022256). Nous remercions tous les membres des équipes de recherche de l'Université de médecine traditionnelle chinoise du Liaoning et du Troisième hôpital affilié de l'Université de médecine traditionnelle chinoise du Liaoning pour leur soutien technique ainsi que pour leurs contributions à la gestion des données et à l'analyse bioinformatique.
OpenAI Codex (OpenAI) a été utilisé lors de la révision uniquement pour aider à la correction en anglais, au formatage du document et à la vérification de la qualité des figures. Tout le contenu scientifique, les analyses, les citations et la présentation finale ont été examinés et vérifiés par les auteurs, qui assument l'entière responsabilité du manuscrit.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Kits d'analyse des protéines BCA | Institut de biotechnologie Beyotime | P0010 | Quantification des protéines pour la normalisation. |
| Bioinformatics.com.cn | Bioinformatics.com.cn | Plateforme en ligne ; consultée en 2026 | Plateforme de visualisation et d'analyse GO/KEGG. |
| Ligne cellulaire Caco-2 | ATCC | HTB-37 | Ligne cellulaire d'adénocarcinome colorectal humain utilisée pour le modèle de lésion épithéliale. |
| Kits Cell Counting Kit-8 | GLPBio | GK10001 | Dosage de viabilité cellulaire mesuré à 450 nm. |
| CIBERSORT avec signature LM22 | Développeurs de CIBERSORT | LM22 | Déconvolution de 22 fractions de cellules immunitaires. |
| ChEA3 | Laboratoire Ma'ayan | Plateforme en ligne ; consultée en 2026 | Enrichissement des facteurs de transcription et prédiction de réseaux régulateurs. |
| Incubateur CO2 | Non enregistré | N/A | Incubateur humidifié utilisé pour la culture à 37 °C et 5 % de CO2. |
| Sonde fluorescente Cu2+ | BIOFOUNT | CAS 98907-26-7 | Détection de fluorescence intracellulaire du Cu2+ . |
| Cytoscape avec CytoHubba | Consortium Cytoscape | Version non enregistrée | Visualisation des interactions protéine-protéine et classement des nœuds centraux. |
| Milieu de culture Eagle modifié de Dulbecco | Gibco | 11965092 | Milieu de culture des cellules Caco-2. |
| Diméthylsulfoxyde | Non enregistré | N/A | Témoin véhicule. |
| Sérum de veau fœtal | Non enregistré | N/A | Supplément du milieu à 10 %. |
| Kits d'analyse du Fe2+ | Abcam | ab83366 | Mesure du Fe2+ intracellulaire. |
| FerrDB | Développeurs de FerrDB | Base de données en ligne ; consultée en 2026 | Source de gènes liés à la ferroptose. |
| Ferrostatine-1 | Sigma-Aldrich | SML0583 | Inhibiteur de la ferroptose ; concentration finale de 4 µM. |
| Harmony | Institut Broad/communauté | Version non enregistrée | Correction par lots pour les données unicellulaires. |
| Microscope à fluorescence inversé | Olympus | IX71 | Imagerie de fluorescence du Cu2+ avec excitation/émission à 510/578 nm. |
| Lipopolysaccharide | Non enregistré | N/A | Stimulus de lésion inflammatoire à 1 µg/mL pendant 24 h. |
| Kits d'analyse du malondialdéhyde | Institut de biotechnologie Beyotime | S0131S | Mesure de la peroxydation lipidique. |
| Lecteur de microplaques | Non enregistré | N/A | Mesure de l'absorbance à 450 nm. |
| Monocle | Bioconductor/communauté | Version 2 | Analyse de pseudotemps unicellulaire. |
| Base de données Molecular Signatures Database | Institut Broad | c2.cp.kegg_medicus.v2025.1.Hs | Jeu de gènes de référence pour l'analyse GSEA. |
| NetworkAnalyst | Développeurs de NetworkAnalyst | Plateforme en ligne ; consultée en 2026 | Intégration des réseaux de facteurs de transcription et de miARN. |
| Pénicilline–streptomycine | Non enregistré | N/A | 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine. |
| R | Fondation R pour l'informatique statistique | Version non enregistrée | Environnement d'analyse bioinformatique. |
| Ensemble de packages R | CRAN/Bioconductor | Builds des packages non enregistrés | Flux de travail avec limma, WGCNA, clusterProfiler, glmnet, randomForest, e1071, pROC et rms. |
| Système de PCR en temps réel | Non enregistré | N/A | Appareil de RT-PCR en temps réel utilisant le SYBR Green. |
| Kits de synthèse d'ADN complémentaire de premier brin RevertAid | Thermo Fisher Scientific | K1622 | Synthèse d'ADN complémentaire de premier brin à partir de 1 µg d'ARN. |
| Sangerbox | Développeurs de Sangerbox | 3.0 | Normalisation et correction par lots avec ComBat. |
| Seurat | Laboratoire Satija/communauté | Version 4 | Contrôle qualité, normalisation, regroupement et visualisation des données unicellulaires. |
| Logiciel d'analyse statistique | Non enregistré | N/A | Analyse statistique des expériences cellulaires initiales. |
| STRING | Consortium STRING | Base de données en ligne ; consultée en 2026 | Construction de réseaux d'interactions protéine–protéine. |
| Réactifs de PCR en temps réel au SYBR Green | Takara | RR820A | PCR quantitative en temps réel. |
| TarBase | Outils DIANA | 9.0 | Interactions miARN–gène validées expérimentalement. |
| Tétrathiomolybdate | Sigma-Aldrich | 323446 | Chélateur du cuivre ; concentration finale de 40 µM. |
| Réactif TRIzol | Takara | 9108 | Extraction d'ARN total. |
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