Article de méthode

Ex Vivo Modèle d'infarctus du myocarde dans le cœur de souris perfusé avec un liquide cristalloïde

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DOI :

10.3791/73840

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27 octobre 2026

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1Department of Cardiology, The People's Hospital of Danyang, Affiliated Danyang Hospital of Nantong University, 2Institute of Molecular Cardiology, Medical Faculty and University Hospital Düsseldorf, Heinrich Heine University of Düsseldorf, 3Department of Cardiac Surgery, Heinrich Heine University Düsseldorf

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit un modèle ex vivo d'infarctus du myocarde dans le cœur de souris isolé perfusé par cristalloïde. Cette approche contourne les variables systémiques, permettant ainsi aux chercheurs d'évaluer directement les effets cardiaques en l'absence de facteurs extrinsèques pouvant fausser la survie des cardiomyocytes, et de tester des interventions pharmaceutiques localisées.

Résumé

L'infarctus du myocarde expérimental (IM) est couramment modélisé chez les animaux par une occlusion transitoire de l'artère coronaire descendante antérieure (AD) ou, au niveau cellulaire, par des protocoles d'hypoxie-reoxygénation. Comme modèle alternatif d'ischémie au niveau organique, le cœur perfusé selon Langendorff demeure un outil fondamental pour étudier les effets des perturbations physiologiques et des interventions pharmacologiques sur la cardioprotection. Ici, nous présentons la méthodologie de base et les règles fondamentales nécessaires à la mise en place d'un modèle d'ischémie/reperfusion myocardique régional chez le cœur de souris isolé. En bref, après un arrêt cardioplégique, la ligature de l'AD était réalisée suite à un bref lavage par du PBS glacé. Le cœur était ensuite monté sur un appareil de Langendorff et perfusé avec un tampon oxygéné riche en nutriments à 37 °C, sous une pression de perfusion constante de 110 cmH₂O. La durée d'ischémie myocardique était induite pendant 30, 45, 60, 90 et 120 min, suivie de 90 min de reperfusion. La viabilité des cardiomyocytes et la taille de l'infarctus étaient évaluées à l'aide de la coloration microscopique au chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC). Nous avons démontré que le modèle d'IM ex vivo produisait de manière fiable des lésions myocardiques reproductibles, caractérisées par une perte progressive de cardiomyocytes viables dans la zone d'infarctus à mesure que la durée d'ischémie s'allongeait. En outre, au moins 30 min de reperfusion étaient nécessaires pour obtenir une délimitation claire du myocarde infarci par le TTC. Cette approche contourne les variables systémiques, permettant ainsi aux chercheurs d'évaluer directement les effets cardiaques en l'absence d'influences régulatrices extrinsèques, telles que les facteurs humoraux circulants et l'infiltration des cellules immunitaires, qui pourraient fausser l'évolution de l'IM, et de tester des interventions pharmaceutiques localisées. Ainsi, le modèle d'IM ex vivo représente une plateforme utile pour étudier les mécanismes cardioprotecteurs agissant directement sur les cardiomyocytes.

Introduction

Un infarctus du myocarde (IM) survient lorsque le flux sanguin coronaire s'interrompt, entraînant une mort tissulaire et une altération fonctionnelle sévère. Bien qu'il soit généralement étudié chez des organismes entiers, le terme peut désigner un IM régional limité à des structures cardiaques spécifiques, ou bien des modèles expérimentaux ex vivo de cœur isolé (par exemple, la perfusion Langendorff) utilisés pour étudier les infarctus en l'absence d'influence systémique1. Ainsi, le cœur perfusé selon Langendorff sert de modèle expérimental solide et bien établi pour l'étude des lésions ischémiques myocardiques depuis plus de 50 ans2.

Le modèle d'infarctus du myocarde (IM) ex vivo sur cœur isolé présente plusieurs avantages, notamment un contrôle précis de l'environnement expérimental et la possibilité d'évaluer les effets directs d'interventions, telles que des agents pharmacologiques, sur le myocarde indépendamment des influences systémiques, y compris les facteurs humoraux circulants, les composants sanguins et la régulation neurohumorale3. En réduisant ces facteurs de confusion, le modèle ex vivo offre une approche plus prévisible et reproductible que les modèles in vivo et permet ainsi une étude rigoureuse des processus pathologiques et des voies moléculaires impliqués dans l'IM4.

Chez les cœurs isolés, l'ischémie myocardique peut être induite de manière globale ou régionale5. Dans le modèle d'infarctus du myocarde (IDM) global, le flux de perfusat à travers toute la circulation coronaire est complètement interrompu, tandis que dans le modèle d'IDM régional, seule l'artère coronaire descendante antérieure (LAD) est occluse de façon transitoire par ligature, entraînant une lésion ischémique limitée au myocarde situé en aval du site de ligature. Bien que le modèle d'IDM global soit techniquement simple à réaliser, il présente plusieurs limitations qui restreignent son utilisation dans les études de cardioprotection6. L'une des principales limitations est que la durée de l'ischémie est limitée par la tolérance durable de l'ensemble du cœur, rendant difficile l'induction d'une ischémie prolongée et aboutissant à une probabilité d'infarctus transmur comparable à celle observée dans des situations in vivo7. De plus, bien que les modèles ex vivo offrent généralement une excellente reproductibilité lorsque les durées d'ischémie et de reperfusion sont soigneusement contrôlées, ces protocoles varient considérablement d'un laboratoire à l'autre. Cette variabilité souligne le besoin d'une meilleure standardisation et caractérisation du cœur de souris isolé, d'autant plus que de nombreux détails méthodologiques essentiels restent insuffisamment décrits dans la littérature8.

D'autre part, le modèle d'infarctus du myocarde (IDM) régional est techniquement plus difficile à mettre en place. Nous présentons ici plusieurs modifications et stratégies pratiques permettant d'optimiser l'induction d'un IDM ex vivo fiable dans le cœur isolé de souris, en particulier pour évaluer des interventions pharmacologiques visant la cardioprotection9,10. Ainsi, ce protocole modifié d'IDM ex vivo utilisant le cœur de souris perfusé selon Langendorff fournit une plateforme efficace pour évaluer directement la survie du myocarde après des interventions thérapeutiques.

Protocole

Le modèle de cœur isolé perfusé décrit ici est une expérience aiguë non curative, approuvée par les autorités locales (O1019/25, LANUV de Rhénanie-du-Nord-Westphalie, Allemagne). Toutes les procédures ont été réalisées conformément aux lignes directrices ARRIVE et au Guide NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Le matériel et les produits chimiques nécessaires aux expériences sont listés dans le Tableau des matériaux.

1. Mise en place d'un système de rétroperfusion de Langendorff pour le cœur isolé de souris

REMARQUE : Un système non circulaire, entraîné par gravité, a été conçu pour délivrer un perfusat cristalloïde oxygéné (tampon de Krebs-Henseleit, KHB) au cœur isolé de souris à une pression constante de 110 cmH2O (Figure 1A).

  1. Nettoyer la verrerie Langendorff avec de l'acide chlorhydrique 0,1 M/L, de l'éthanol 100 %, puis rincer à l'eau distillée avant d'assembler le système.
  2. Préparer tous les produits chimiques nécessaires à la préparation de 2 L de KHB modifié selon les concentrations finales suivantes (mM) : 116,02 NaCl, 4,63 KCl, 1,10 MgSO4·7H2O, 1,21 KH2PO4, 2,52 CaCl2·2H2O, 24,88 NaHCO3, 8,30 D-glucose, 2,0 pyruvate de sodium.
  3. Dissoudre tous les produits chimiques sauf le CaCl₂ dans de l'eau doublement distillée dans un ballon de 2 L, sous bulle constante de carbogène (95 % O₂ / 5 % CO₂) pendant au moins 10 min afin d'équilibrer le pH à 7,4.
  4. Ajouter ensuite le CaCl₂ à la solution afin d'éviter toute précipitation.
  5. Poursuivre la saturation de la solution avec du carbogène pendant 10 min supplémentaires.
  6. Filtrer la solution de KHB sous vide à l'aide d'un filtre membranaire de 0,2 µm afin d'éliminer les particules fines pouvant obstruer la microvasculature coronaire.
  7. Transférer la solution de KHB filtrée dans un réservoir en verre de 2 L placé dans un bain-marie préchauffé maintenu à 37 °C.
  8. Relier le réservoir de KHB à la colonne de verre sous pression, permettant au KHB oxygéné de remplir continuellement la colonne sous l'effet de la pression générée par le gaz carbogène dans le réservoir.
  9. S'assurer que le système de tubulure de sortie ne contient aucune bulle d'air.
  10. Équilibrer la solution de KHB avec du carbogène pendant 30 min supplémentaires avant le début de l'expérience.

2. Isolement et cannulation du cœur

REMARQUE : Des souris mâles C57BL/6J pesant 20–25 g ont été utilisées dans les présents expériences. Toutes les procédures expérimentales doivent être correctement documentées conformément aux réglementations locales, y compris la justification, la date et la méthode d'euthanasie.

  1. Placer délicatement la souris dans une chambre d'induction contenant 5 % d'isoflurane (v/v) pour l'induction de l'anesthésie.
  2. Confirmer la profondeur de l'anesthésie par l'absence totale de réponse à une pression ferme sur l'orteil, puis transférer la souris sur la table d'opération. Euthanasier immédiatement la souris par dislocation cervicale, comme en témoignent l'absence de respiration et la perte du tonus musculaire dans la partie inférieure du corps.
  3. Couper la cage thoracique bilatéralement vers le sternum afin d'exposer complètement le cœur et l'aorte ascendante.
  4. Attraper les tissus extracardiaques avec une pince et exciser le cœur.
  5. Placer le cœur dans un petit bécher prérefroidi contenant 50 mL de solution de KHB glacée pendant au moins 30 secondes afin d'induire un arrêt cardioplégique.
    NOTE : Étant donné que l'activité cardiaque est très sensible à la température, le cœur est complètement arrêté par immersion dans la solution de KHB glacée.
  6. Transférer le cœur sur un tampon de coton prérefroidi et humidifié avec la solution de KHB, placé dans un plat métallique, où un système de canule relié à un robinet à trois voies a été mis en place. (Figure 1B).
    NOTE : Le système de perfusion doit être exempt de bulles d'air.
  7. Préparer un nœud demi-carré lâche à l'aide d'un fil de soie 5-0 à l'extrémité distale de la canule.
  8. Dissecter soigneusement le thymus, les tissus conjonctifs et les tissus extracardiaques résiduels (y compris les poumons et l'œsophage) afin d'exposer et de tailler la racine aortique.
    NOTE : Veiller à conserver une longueur suffisante de l'aorte ascendante pour une canulation réussie.
  9. Monter le cœur sur la canule et le fixer à l'aide du fil préalablement mis en place.
  10. Rincer le cœur avec 5 mL de PBS glacé pour éliminer le sang résiduel de la circulation coronaire.

3 Ischémie et reperfusion myocardiques ex vivo

REMARQUE : Une ischémie myocardique globale a été induite en arrêtant simplement la perfusion du cœur, tandis qu'une ischémie myocardique régionale a été créée par une ligature transitoire de l'artère descendant antérieure (LAD) sous un stéréomicroscope.

  1. Positionner l'artère descendante antérieure (LAD) au centre du champ de vision en faisant tourner délicatement le cœur grâce à l'ajustement du tampon de coton sous-jacent. La LAD devient transparente et clairement distinguable du myocarde environnant lors de la perfusion par du PBS.
  2. Faire passer sous la LAD une aiguille effilée portant un fil de polypropylène 8–0, à 1 mm sous la marge inférieure de l'oreillette gauche.
    NOTE : Veiller à ce que la LAD se situe exactement entre les deux points de perforation afin d'éviter toute lésion vasculaire due à la ligature.
  3. Placer un morceau de compresse souple sur la LAD.
  4. Serrer fermement le fil pour interrompre la perfusion au-delà du site de ligature.
  5. Transférer le cœur canulé vers l'appareil de Langendorff et commencer une perfusion rétrograde.
  6. Immerger le cœur dans le bain d'organes à double paroi contenant de l'eau afin de maintenir une température constante (37 °C) pendant toute la durée de l'expérience.
  7. Surveiller le débit coronaire maximal et en régime permanent (Tableau 1).
  8. Aux moments précisés d'ischémie myocardique (voir la section Résultats), arrêter la perfusion et retirer le cœur canulé de l'appareil de perfusion.
  9. Immerger immédiatement le cœur dans du tampon de Krebs-Henseleit glacé (KHB, 4 °C) afin d'arrêter complètement la contraction cardiaque.
  10. Replacer le cœur sur le tampon de coton dans le plat métallique pré-refroidi et relâcher la ligature de la LAD.
  11. Pour les études d'intervention pharmacologique, injecter 5 µL d'interleukine-6 (IL-6, 0,1 mg/mL) dans la paroi antérieure infarcie à l'aide d'une seringue à insuline 30 G à ce stade.
  12. Remettre en place le cœur canulé sur l'appareil de perfusion et reprendre la perfusion cardiaque (reperfusion).

4. Évaluation des lésions myocardiques et de la survie

REMARQUE : La coloration par le chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) marque le myocarde viable en rouge foncé, tandis que le tissu infarcilié ou nécrosé apparaît beige après fixation avec la solution de Zamboni.

ATTENTION : Le TTC est généralement considéré comme dangereux et doit être manipulé avec précaution, car il peut provoquer une légère irritation cutanée, une irritation oculaire grave et est nocif en cas d'inspiration. Éliminer les déchets et les résidus conformément aux exigences des autorités locales.

  1. Cesser la perfusion 90 min après la reperfusion et immerger immédiatement le cœur dans du KHB glacé afin d'arrêter la contraction cardiaque.
  2. Connecter la canule à une seringue de 3 mL préremplie avec la solution de coloration au TTC (TTC 1 % dissous dans du PBS) via un robinet à trois voies
  3. Infuser 1 mL de solution de TTC dans le cœur, répéter l'infusion trois fois et administrer un volume total de 3 mL en 15 minutes.
  4. Recouvrir le cœur avec du papier absorbant humide afin d'éviter le dessèchement de la surface.
  5. Placer le cœur dans un tube de centrifugeuse contenant 3 mL de solution de TTC 4 °C pendant la nuit
  6. Fabriquer un bloc de tissu avec du composé OCT (Optimal Cutting Temperature).
    REMARQUE : Le fragment de tissu peut être conservé à −80 °C pendant plusieurs mois en attendant une analyse ultérieure.
  7. Montez le bloc de tissu sur un porte-échantillon de cryostat à l'aide du composé OCT.
  8. Couper successivement le cœur en cryosections d'une épaisseur de 50 µm et recueillir tous les 10th section ; on obtient généralement environ 8 tranches tissulaires par cœur.
  9. Aligner les 8 tranches sur une seule lame de microscope et les sécher avec un sèche-cheveux pendant 2 à 3 min.
  10. Immerger les tranches dans une chambre de coloration contenant la solution de Zamboni (un fixateur contenant 2 % de paraformaldéhyde et 0,4 % d'acide picrique, p/v) pendant toute la nuit à 4 °C.
    ATTENTION : Le fixateur de Zamboni peut provoquer une réaction allergique cutanée et est soupçonné d'entraîner des anomalies génétiques et un effet cancérigène. Éliminer les déchets et résidus conformément à la réglementation locale.
  11. Laver les tranches 3 fois avec du PBS et recouvrir les sections de milieu de montage.
    REMARQUE : L'échantillon cardiaque coloré au TTC peut être conservé à température ambiante pendant plusieurs mois.
  12. Acquérir des images du cœur à l'aide d'un microscope optique muni d'un objectif 1,25x, en utilisant le logiciel CellSens.
  13. Pour la quantification de la taille de l'infarctus, importer les fichiers d'image dans la plateforme ImageJ.
  14. Dans le menu ImageJ, sélectionnez Image -> Ajuster -> Seuil de couleur pour ouvrir la fenêtre Seuil de couleur (Figure 2B).
  15. Sélectionnez une petite région d’intérêt (ROI) dans la section cardiaque et utilisez le myocarde viable de couleur rouge foncé et le tissu infarcé/nécrosé de couleur beige comme références chromatiques.
  16. Cliquez sur Échantillon dans le Seuil de couleur ajuster la fenêtre et affiner la plage de saturation jusqu'à ce que la région sélectionnée corresponde exactement à la zone colorée cible.
  17. Cliquez sur Sélection délimiter la zone correspondant à la couleur sélectionnée.
  18. Dans le menu ImageJ, sélectionnez Analyser -> MesurerLa surface de la région sélectionnée, indiquée en pixels, s'affichera dans la fenêtre Résultats.
  19. Exporter les données de mesure vers un tableur Excel pour le calcul de la taille de l'infarctus par méthode planimétrique.
  20. Pour quantifier le myocarde viable dans la région infarcie, délimiter la région d'intérêt (ROI), principalement sur la paroi ventriculaire antérieure infarcie, où l'IL-6 a été injectée.
  21. Ouvrir le Gestionnaire de régions d'intérêt du menu ImageJ et cliquez sur Ajouter pour enregistrer la zone d'intérêt sélectionnée dans la liste des zones d'intérêt (Figure 2C).
  22. Utilisez les fonctions « Sample » et « Selection » décrites ci-dessus pour délimiter le myocarde viable (rouge foncé).
  23. Ajouter la zone viable sélectionnée à la liste « Gestionnaire de zones d'intérêt (ROI) », puis sélectionner ET pour obtenir le chevauchement entre la région d'intérêt et le myocarde viable.
  24. Mesurer la surface de myocarde viable et calculer le taux de survie des cardiomyocytes dans la ROI sélectionnée.
    REMARQUE : Les détails méthodologiques relatifs à la coloration au TTC et à la quantification de la taille de l'infarctus ont déjà été publiés précédemment11.

Résultats

Dans la plateforme d'IM ex vivo, deux protocoles ischémiques ont été évalués sur le cœur de souris isolé. L'ischémie globale, largement utilisée dans les études d'IM ex vivo, entraîne une lésion ischémique hétérogène dans tout le cœur. À l'aide d'une approche de détection microscopique fiable et de haute résolution basée sur le TTC12, il a été démontré que le myocarde atrial et la région apicale étaient relativement résistants à l'ischémie et demeuraient viables après 45 min d'ischémie globale sans flux (Figure 2A, panneau supérieur). En revanche, l'IM régional induit une lésion ischémique localisée dans le myocarde situé en aval du site de ligature de l'artère descendant antérieure (LAD). Dans ces conditions, certaines parties du myocarde subépicardique restaient positives au TTC, indiquant la préservation d'un tissu viable (Figure 2A, panneau inférieur). Ces résultats révèlent des profils distincts de survie du myocarde entre les deux protocoles ischémiques.

La durée minimale d'ischémie et de reperfusion nécessaire pour induire de manière fiable et reproductible un infarctus du myocarde a été davantage étudiée sur le cœur de souris isolé. Les lésions myocardiques ont progressivement augmenté à mesure que la durée d'ischémie était prolongée de 30 min à 120 min (Figure 3A). Notamment, la taille de l'infarctus a plus que doublé entre 30 min (n = 3) et 45 min (n = 5) d'ischémie et semblait atteindre un plateau lorsque la durée d'ischémie était prolongée à 60 min (n = 5), 90 min (n = 4) et 120 min (n = 3) (Figure 3B). Ces résultats indiquent que la viabilité myocardique est très sensible à la durée d'ischémie au-delà de 30 min. Par rapport au modèle d'infarctus du myocarde in vivo (ivMI, n = 5), le modèle ex vivo (evMI, n = 8) a produit des tailles d'infarctus presque identiques sous des durées comparables d'ischémie et de reperfusion (36,88 % ± 3,91 % contre 37,8 % ± 2,17 %, p = 0,27), suggérant que les lésions myocardiques n'étaient pas sensiblement affectées par la perfusion cristalloïde. Néanmoins, les cœurs evMI présentaient des parois ventriculaires plus épaisses et une lumière ventriculaire réduite, probablement en raison d'un œdème myocardique associé à la perfusion cristalloïde (Figure 3C).

Profitant de l'environnement relativement contrôlé, exempt d'influences extracardiaques, les effets cardioprotecteurs de l'administration intramyocardique d'IL-6 ont été évalués. Dans les cœurs témoins traités au PBS, des cardiomyocytes viables mesurables mais dispersés (CMs viables ; rouge foncé) restaient détectables au sein de la région infarcie/nécrosée (beige), même après 45 minutes d'ischémie (Figure 4 ; 1,05 % ± 0,44 %, EEM, n = 4). Notamment, l'administration intramyocardique d'IL-6 (i.m. ; flèches) a significativement augmenté la quantité de CMs viables, principalement localisés autour du site d'injection dans la région d'intérêt (ROI ; 4,08 % ± 0,99 %, EEM, n = 6 ; p = 0,005, test t de Student). Ces résultats suggèrent que l'IL-6 pourrait améliorer la survie des cardiomyocytes après une lésion ischémique.

Enfin, le modèle d'infarctus du myocarde (IDM) ex vivo actuel comporte plusieurs écueils potentiels pouvant affecter la reproductibilité des résultats expérimentaux. Comme illustré dans la Figure 5, un glissement de la ligature peut entraîner une occlusion insuffisante de l'artère descendant antérieure (ADA) et une survie myocardique étendue (4/168), tandis qu'une reperfusion incomplète peut survenir lorsque des branches de l'ADA sont endommagées (12/168). De plus, une embolie gazeuse lors de la canulation aortique peut également provoquer une lésion myocardique (flèches, 7/168), rendant difficile la distinction entre une lésion ischémique et une lésion embolique pour la quantification. Enfin, une coloration insuffisante au TTC peut survenir lorsque le cœur est perfusé de manière excessive (11/168), ce qui entrave considérablement la délimitation de la zone d'infarctus.

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Figure 1 : Schéma du dispositif expérimental. Le système Langendorff à pression constante, non recirculant et entraîné par gravité, a été conçu pour délivrer un tampon de Krebs–Henseleit (KHB) riche en nutriments et oxygéné, à une pression hydrostatique constante de 110 cmH₂O. Le KHB était d'abord préchauffé à 37 °C dans un réservoir, puis acheminé vers une colonne de pression à double enveloppe, dans laquelle une pression hydrostatique constante de 110 cmH2O était maintenue via un régulateur de pression. Le cœur perfusé était immergé dans un bain d'organes à double enveloppe dont la hauteur était réglable, afin de maintenir une température constante de 37 °C pendant toute la durée de l'expérience (A). L'infarctus du myocarde était induit par ligature transitoire de l'artère coronaire descendante antérieure (LAD) après arrêt cardioplégique sur un tampon de coton placé dans une coupelle métallique prérefroidie (B). L'intervention était réalisée sous microscope stéréoscopique. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Infarctus du myocarde (ID) régional versus global et détermination de la taille de l'infarctus. L'ID global provoque une lésion ischémique dans tout le cœur, comme l'indique la coloration jaune sur les images microscopiques au TTC. Le myocarde atrial et la région apicale semblaient plus résistants à l'ischémie et sont restés viables après 45 min d'ischémie globale sans flux (panneau supérieur de A). L'ID régional induit une lésion ischémique dans le myocarde situé en aval du site de ligature de l'artère descendante antérieure (LAD). Dans ce cas, certaines parties du myocarde sous-épicardique sont colorées en rouge, suggérant la préservation d'un tissu viable (panneau inférieur de A). La taille de l'infarctus a été quantifiée à l'aide du logiciel ImageJ, l'aire nécrosée et le myocarde viable étant délimités selon leurs couleurs de coloration distinctes (B). La survie des cardiomyocytes dans la région d'intérêt (ROI) a été calculée en déterminant le pourcentage de coloration rouge foncé dans la ROI sélectionnée (C). Échelles : 1 mm. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

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Figure 3: Impact de la durée de l'ischémie sur la taille de l'infarctus. La lésion myocardique s'aggrave progressivement lorsque la durée de l'ischémie est prolongée de 30 à 120 min (A). La taille de l'infarctus a plus que doublé entre 30 min (n = 3) et 45 min (n = 5) d'ischémie et semblait atteindre un plateau lorsque la durée ischémique était prolongée à 60 min (n = 5), 90 min (n = 4) et 120 min (n = 3) (B). Par rapport au in vivo modèle MI (MI ve, n = 5), le ex vivo MI (evMI, n = 8) a produit des tailles d'infarctus presque identiques pour des durées d'ischémie comparables (36,88 %) ± 3.91% contre. 37.8% ± 2.17%, p = 0,27, test de Student t-Test). Les cœurs evMI présentaient une paroi ventriculaire plus épaisse et une lumière ventriculaire réduite, probablement en raison d'un œdème myocardique associé à la perfusion par cristalloïde (C). Les barres d'erreur représentent l'écart type de la moyenne (ETM). Échelles : 1 mm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : l'IL-6 améliore la survie des cardiomyocytes après une lésion ischémique. L'administration intramyocardique (i.m.) d'IL-6 dans le modèle d'évMI a permis de détecter un nombre mesurable de cardiomyocytes viables (CMs viables ; en rouge foncé) dans la région infarcie/nécrosée (en beige), principalement localisés autour du site d'injection d'IL-6 (flèches, panneau gauche). La quantification des CMs viables dans la région d'intérêt (ROI, indiquée par des lignes en pointillés) a révélé qu'une injection de PBS entraînait seulement une faible proportion de myocarde viable (1,05 % ± 0,44 %, erreur standard de la moyenne [SEM], n = 4), tandis qu'une injection d'IL-6 augmentait significativement la quantité de CMs viables dans la ROI (4,08 % ± 0,99 %, erreur standard de la moyenne [SEM], n = 6 ; p = 0,005, test t de Student). Les barres d'erreur représentent l'écart-type de la moyenne (SDM). Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Résultats insatisfaisants ou infructueux dus à un échec technique. Comme illustré par la lésion myocardique représentative dans le modèle d'infarctus du myocarde ex vivo (à gauche), le myocarde viable et le myocarde nécrosé peuvent généralement être clairement distingués lors de la coloration typique au TTC. Toutefois, plusieurs échecs techniques peuvent entraîner des résultats insatisfaisants ou impossibles à interpréter. Une ligature insuffisante de l'artère descendante antérieure (LAD) due à un glissement du fil de suture peut entraîner une survie étendue du myocarde malgré une ischémie prolongée. Une reperfusion incomplète peut survenir lorsque des branches de la LAD sont endommagées pendant la ligature et deviennent par la suite mal perfusées, produisant un aspect similaire au phénomène « no-reflow » observé cliniquement. De telles régions peuvent présenter une coloration rosée (flèches). L'embolie microvasculaire par des bulles d'air pénétrant dans la circulation coronaire lors de la procédure de canulation peut également provoquer une lésion myocardique (flèches), rendant difficile la distinction entre une lésion ischémique et une lésion embolique pour la quantification. Enfin, une coloration insuffisante au TTC peut survenir lorsque le cœur est perfusé de manière excessive, ce qui peut provoquer une lésion myocardique indépendante de l'ischémie. Échelles : 1 mm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

F-pic (n = 19)F-régulier (n = 19)RF-pic (n = 19)RF-régulier (n = 19)
Moyennes (mL/min)2.540.7820.99
ÉT0.590.290.560.53

Tableau 1 : Débit coronaire aux niveaux maximal (F-peak) et d'état stable (F-steady) durant l'ischémie et la reperfusion (RF-peak et RF-steady).

Discussion

Le modèle actuel d'infarctus du myocarde ex vivo repose principalement sur des systèmes cardiaques perfusés selon la méthode de Langendorff, qui sont sophistiqués2. Un écueil fréquent lors de la préparation consiste à introduire des bulles d'air dans la circulation coronaire, ce qui peut provoquer une lésion embolique et fausser l'évaluation de la lésion ischémique. Pour éviter ce problème, un examen méticuleux du système de perfusion immédiatement avant chaque expérience est essentiel. Si de petites bulles d'air se coincent dans le réseau de tubulures, un lavage rétrograde avec du KHB afin de repousser les bulles vers la colonne de pression peut aider à résoudre le problème.

L'étape cruciale de ce protocole est la ligature de l'artère coronaire antérieure descendante (LAD). Tout d'abord, une identification visuelle précise de la LAD est donc essentielle. Dans la plupart des cas, les vaisseaux coronaires deviennent translucides après que le cœur a été rincé avec du PBS glacé, ce qui rend la LAD clairement distinguable du myocarde environnant. De plus, une technique de ligature correcte et habile est tout aussi importante, car une tension excessive sur le fil de polypropylène 8-0 peut sectionner la LAD, rendant toute reperfusion ultérieure impossible. Pour minimiser ce risque, une mèche douce de taille appropriée doit être placée entre le fil et le vaisseau afin de répartir la force de ligature et protéger l'artère coronaire contre les lésions mécaniques. Néanmoins, une lésion myocardique mineure induite par la ligature est inévitable, mais n'altère généralement pas la perfusion coronaire ni l'issue de l'expérience. Enfin, comme la lésion myocardique est très sensible à la température13, il est essentiel de maintenir une température constante tout au long de l'expérience. En particulier dans des conditions de perfusion à pression constante, des pertes de chaleur peuvent survenir entre la colonne de perfusion et le cœur, et varier dynamiquement en fonction du débit coronaire14. Ainsi, ces fluctuations peuvent entraîner des variations de la température myocardique. Dans ce contexte, un bain d'organes à double paroi avec circulation d'eau est fortement recommandé afin de maintenir des conditions thermiques stables (Figure 1A).

Une fois ces défis techniques surmontés, le modèle d'infarctus du myocarde ex vivo fournit une plateforme fiable et reproductible pour induire une lésion myocardique dans le cœur isolé de souris (Figure 3A). Il constitue donc un système expérimental précieux pour étudier la survie myocardique post-infarctus, évaluer des interventions thérapeutiques administrées localement et réaliser des imageries à haute résolution sans interférence liée aux mouvements respiratoires ou cardiaques. Bien que le protocole d'infarctus global soit techniquement simple et ait été largement utilisé dans des études antérieures4, sa principale limitation est que la durée d'ischémie globale est généralement limitée à moins de 45 min3. Par conséquent, contrairement au modèle d'infarctus régional, il produit rarement un infarctus transmur (Figure 2).

Une caractéristique unique du modèle d'infarctus du myocarde ex vivo est l'absence d'influences systémiques, notamment de la régulation nerveuse et des composants circulants du sang, ce qui permet aux chercheurs d'évaluer les effets locaux directs des interventions thérapeutiques sur le myocarde8. Ceci est particulièrement pertinent pour des cytokines telles que l'IL-6 et la voie de signalisation PI3K/AKT en aval, qui se sont révélées cardioprotectrices dans des cardiomyocytes isolés15. In vivo, toutefois, les effets cardiaques de l'IL-6 sont souvent inconstants voire contradictoires, car l'IL-6 active simultanément les cellules immunitaires et favorise des réponses inflammatoires pouvant contrebalancer ses effets cardioprotecteurs directs16. En accord avec cette notion, notre modèle ex vivo a démontré de façon convaincante qu'une administration intramyocardique locale d'IL-6 préservait de façon significative la viabilité du myocarde après une lésion ischémique17,18, soutenant un effet cardioprotecteur direct de l'IL-6 sur les cardiomyocytes (Figure 4).

Nous reconnaissons plusieurs limites du modèle d'infarctus du myocarde (IM) ex vivo actuel. Dans ce dispositif, la fonction contractile cardiaque n'a pas été évaluée dans le protocole actuel3. Cela s'explique par le fait que l'objectif principal était de caractériser la survie du myocarde dans un modèle d'IM régional, et parce que le dysfonctionnement contractile reflète une altération fonctionnelle après une lésion ischémique, mais n'indique pas nécessairement la mort des cardiomyocytes8. De plus, le modèle d'IM ex vivo exclut par nature les composants sanguins circulants, les cellules immunitaires et les influences neurohumorales qui peuvent contribuer de manière importante à la progression de l'IM et au remodelage cardiaque in vivo. Bien que cette réduction de la complexité systémique constitue un avantage majeur du modèle d'IM ex vivo, elle limite également son utilisation générale pour imiter les réponses inflammatoires, vasculaires, nerveuses et endocriniennes pouvant survenir in vivo. Enfin, une perfusion cristalloïde s'est révélée associée à un œdème myocardique, comme en témoignent l'augmentation de l'épaisseur de la paroi ventriculaire et la réduction de la lumière ventriculaire par rapport aux cœurs présentant un IM in vivo. La fréquence notable de cet œdème peut modifier l'architecture myocardique, la diffusion tissulaire et potentiellement la viabilité cellulaire. Par conséquent, le modèle actuel doit être considéré comme une plateforme contrôlée permettant d'étudier les lésions myocardiques et les mécanismes spécifiques aux cardiomyocytes.

Néanmoins, le modèle d'infarctus du myocarde ex vivo décrit ici constitue une plateforme simple et rentable pour évaluer la survie myocardique en l'absence d'influences régulatrices extrinsèques. Étant donné l'utilisation croissante de modèles murins modifiés génétiquement, cette approche pourrait être particulièrement utile pour étudier les mécanismes de cardioprotection à l'aide d'imagerie avancée, d'enregistrements électrophysiologiques et d'analyses moléculaires. En outre, le modèle pourrait être adapté afin de tester systématiquement des interventions pharmacologiques ou génétiques localisées et d'élucider les mécanismes spécifiques aux cardiomyocytes, indépendamment des facteurs de confusion systémiques. Ainsi, le modèle d'infarctus du myocarde ex vivo offre une plateforme expérimentale complémentaire permettant d'identifier et d'étudier mécanistiquement les voies de protection cardiaque.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts. Les auteurs déclarent qu’aucun outil d’intelligence artificielle (IA) ou technologie assistée par IA générative n’a été utilisé lors de la rédaction, de l’analyse des données, de la génération des figures ou de la validation de ce travail.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le projet général de la société gériatrique du Jiangsu (JGS2026MS019 attribué à WO), la fondation du développement social du département des sciences et technologies de la ville de Zhenjiang (subventions n° SH2023023 attribuée à H.Z. et SH2023057 attribuée à X.L.), le programme FoKo (subvention n° 23/2013 attribuée à ZD) et l'Institut de recherche cardiovasculaire de Düsseldorf (CARID).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2,3,5-triphényltétrazolium chlorureMilipore1.08380.0100Produits chimiques
Cannule aortiqueBD305895 (20 G)Rétro-perfusion
AquamountBDH362262HSectionnement cryogénique
BalancesOhaus-Pesée des produits chimiques
Grosses pincesAESCULAP-Instruments chirurgicaux
Analyseurs de gaz sanguinsRadiometerABL90 FLEX PLUSAnalyseur de gaz
Chlorure de calcium dihydratéFluka21097Produits chimiques
CarbogèneLinde4040152Appareil de Langendorff
CellSensOlympusVersion 3.1.1Logiciel d’imagerie
Compresse en cotonBEESanaPZN-1330900Instruments chirurgicaux
CoverslipsEprediaBB02400500A113MN20Sectionnement cryogénique
CryostatLeicaM850Sectionnement cryogénique
Glucose anhydre D(+)Merck8337.1000Produits chimiques
Eau doublement distilléeMilipore-Dissolution des produits chimiques
Éthanol (100 %)Merck64-17-5Nettoyage des tubulures
Éthanol (70 %)VWRUN1170Nettoyage des tubulures
Membre filtrant (0,2 µm)Thermo Scientific8-000-230511Appareil de Langendorff
FluxmètreTransonicT4S410Appareil de Langendorff
Lames de microscope en verreEngelbrecht11102Sectionnement cryogénique
Colonne d’eau en verreFait maison-Appareil de Langendorff
Acide chlorhydriqueRothP074.1Produits chimiques
ImageJNIHversion 1.54gLogiciel
Interleukine-6Biolegend570804Produits chimiques
IsofluranePiramal14150097146754Produits chimiques
Microscope optiqueOlympusBX61Imagerie
Sulfate de magnésium heptahydratéMerck5886.1000Produits chimiques
Capteur médical de débitTransonic3PXNAppareil de Langendorff
Plat en métalFait maison-Instruments chirurgicaux
Seringue Micro-FineBD30G / 0,3 mLAppareil de Langendorff
SourisJanvierC57BL/6JAnimaux
Objectif (x 1,25)OlympusPlanApo 1,25X/0,04Imagerie
Composé OCTSakura4583Produits chimiques
Boîte de PétriThermo Scientific172931Appareil de Langendorff
Solution tamponnée au phosphateRoth9143.1Produits chimiques
Chlorure de potassiumMerck4936.1000Produits chimiques
Phosphate dihydrogène de potassiumMerck4873.1000Produits chimiques
Fi l de suture en soieF.S.T18020-60Instruments chirurgicaux
Chlorure de sodiumSigmaaldrichSZBD0810VProduits chimiques
Bicarbonate de sodiumRoth6885.2Produits chimiques
Pyruvate de sodiumSigmaaldrich113-24-6Produits chimiques
Petit tampon soupleDeknatelL-705Instruments chirurgicaux
Pinces en acier inoxydable (8 mm)F.S.T11052-10Instruments chirurgicaux
Ciseaux en acier inoxydableAESCULAPBC702RInstruments chirurgicaux
Ciseaux en acier inoxydableAESCULAPBC257RInstruments chirurgicaux
StéréomicroscopeLeicaMZ6Instruments chirurgicaux
Point de suture (8-0)EthiconTG-108Instruments chirurgicaux
Seringue (3 mL)B. Braun4617100VRétro-perfusion
Robinet à trois voiesB. Braun16494CRétro-perfusion
TubulureTygonT3304-23Appareil de Langendorff
Bain-marieHAAKEDC1/B3Appareil de Langendorff
Solution de ZamboniMorphisto12773.0050Produits chimiques

Références

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