Ceci est conçu comme une introduction à l'enregistrement de patch clamp à partir d'ovocytes de Xenopus laevis. Il couvre l'enlèvement membrane vitelline, la formation d'un joint gigaohm (gigaseal), et la conversion en option du patch à la topologie en dehors-out.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Enregistrement Patch Clamp des canaux ioniques exprimés dans les oocytes de Xenopus
Dans cet article
Résumé
Résumé
Depuis son développement en Sakmann et Neher 1, 2, le patch-clamp s'est imposé comme une technique extrêmement utile pour la mesure électrophysiologique des canaux ioniques uniques ou multiples dans les cellules. Cette technique peut être appliquée aux canaux ioniques, tant dans leur environnement natif et exprimé dans des cellules hétérologues, tels que des ovocytes récoltés à partir de la grenouille africaine griffes, Xenopus laevis. Ici, nous décrivons la technique bien établie de l'enregistrement de patch-clamp à partir d'ovocytes de Xénope. Cette technique est utilisée pour mesurer les propriétés des canaux ioniques exprimés soit au sein des populations (macropatch) ou individuellement (un seul canal d'enregistrement). Nous nous concentrons sur les techniques pour maximiser la qualité de la préparation des ovocytes et la génération de phoque. Avec tous les facteurs optimisée, cette technique donne une probabilité de succès au cours de génération d'étanchéité 90 pour cent. Le processus peut être optimisé différemment par chaque chercheur sur la base des facteurs qu'il ou elle trouve le plus important, et nous présentons la démarche qui ont conduit à la plus grande réussite dans nos mains.
Protocole
Partie 1: Retrait de la membrane vitelline
- Préparer deux séries de pinces. Nous préférons n ° 5 pinces, où un ensemble a été légèrement taillé avec un fichier. Préparez aussi une pipette de transfert en verre par parage et polissage au feu un 7 "pipette Pasteur.
- Recommandé: Pour prévenir les ovocytes de glisser, couper un cercle de grille (carrés de 1 mm) et de la colle dans le fond d'un plat de Pétri 60mm. Ce plat peut être réutilisé indéfiniment si maintenu propre entre deux utilisations.
- Remplissez la boîte de Pétri avec une solution à mi-chemin hyperosmotiques (voir recette) et placer sous un microscope à dissection.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Il ya de nombreux paramètres d'enregistrement électrophysiologiques pas discuté ici. Configuration Rig, la gestion du bruit du système, l'expression de canaux, et des protocoles d'enregistrement sont tous également critique pour de bons résultats expérimentaux.
Dans notre expérience, ce sont les paramètres les plus critiques pour la formation de joints d'étanchéité fiable: ovocytes de grande qualité, en enlevant la membrane vitelline rapidement (aka, «peeling»), utiliser des pipettes nouvellement tiré protégé de la p.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Remerciements
Recette de solution de rétrécissement est du laboratoire de RW Aldrich. Nous remercions les organismes de financement et fondations suivantes pour le soutien: National Institutes of Health, National Science Foundation, l'American Heart Association, la Muscular Dystrophy Association, le B. Donald E. Baxter et Delia Fondation, le Fonds de dotation et les Klingenstein McKnight for Neuroscience.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| Amplificateur de clampage par électrode à succion &et logiciels | Instrument | HEKA Instruments | EPC-10 | ou tout autre dispositif similaire (par exemple, HEKA EPC-9 ou Axopatch 200B) |
| Pinces n° 5 (deux paires) | Outil | Fine Science Tools | ||
| Solution de rétrécissement des ovocytes | Réactif | Ingrédient En mMN-méthyl-D-glucamine 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Acide aspartique 220KCl 2Ajuster le pH à 7,4 à l’aide de N-méthyl-D-glucamine | ||
| maille tissée | 800 µm | Spectrum Labs | 146481 |
Références
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. Single-channel Recording. , Plenum Press. New York. (1983).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
