Extraction de biomarqueurs à partir de sédiments - Extraction accélérée par solvant
Source : Laboratoire de Jeff Sanoussi - University of Massachusetts Amherst
La distribution d’un groupe de biomarqueurs organiques appelée glycérol-di…
1. collecte des matériaux nécessaires
- Extraire des échantillons. Échantillons (dans ce cas, sédiments) sont gelés, lyophilisés, écrasés et homogénéisés avant l’extraction et extraite en groupes afin de maximiser l’efficacité.
- Selon la taille de l’échantillon, utiliser les flacons de collection avec des volumes de 40 ou 60 mL. Pour cette expérience, les flacons en verre de borosilicate (40 mL) et solvants sécuritaires casquettes sont utilisés. Brûler les flacons, pipettes en verre borosilicate et pesage tins à 550 ° C pendant 6 h avant afin d’assurer l’élimination des contaminants organiques possibles.
- Méthanol et le dichlorométhane (DCM) sont courantes dans les laboratoires de géochimie organiques plus. Les utiliser individuellement, (méthanol suivie tout d’abord, DCM) pour rincer les outils de laboratoire et de la verrerie avant utilisation. Un mélange de dichlorométhane au méthanol (MeOH ; 9:1) est utilisé dans nombreux laboratoires d’extraire efficacement des biomarqueurs avec un large éventail de polarités. Solvants doivent être exempts de contaminants organiques.
- Obtenir un extracteur de solvant accéléré à utiliser pour cette expérience.
2. préparation des cellules de l’échantillon
- Monter une cellule de l’échantillon pour chaque échantillon à extraire, ainsi qu’un essai à blanc.
- Pour chaque cellule, vissez un embout à une extrémité du corps cellulaire.
- Placer un filtre en fibre de verre brûlé sur le dessus de chaque cellule à l’aide de la pince à épiler préalablement rincé solvant. Puis, lentement et doucement enfoncez le filtre dans la cellule à l’aide du plongeur de filtre.
- Étiqueter les corps cellulaires de nombre (par exemple 1-22) pour chaque échantillon et écrire « en blanc » sur la cellule vide.
- Remplir le vide avec la terre de diatomées (ou sable) et couvrez-les avec un deuxième embout. Serrer à la main.
3. préparation des échantillons
- Placez une tible pesant étain sur l’échelle du laboratoire, puis tare.
- Rincer la spatule de laboratoire avec le solvant, puis utilisez-la pour transférer une masse appropriée de l’échantillon dans l’étain pesage et enregistrer la masse.
- La masse de l’échantillon varie en fonction de sa teneur en matière organique. Matière organique relativement maigre matériel (boue marine) peut exiger plusieurs grammes, tandis que la matière organique riche matériel (tissus foliaires) peut-être nécessiter beaucoup moins.
- Transférer la totalité du matériel dans l’étain pesage dans une cellule préparée de l’ASE.
- Placez un autre filtre en fibre de verre sur le dessus de la cellule, puis lentement et doucement appuyer jusqu'à ce qu’il atteigne la partie supérieure de l’échantillon à l’aide du piston filtre.
- Ajouter de la terre de diatomées (ou sable) à la cellule jusqu'à ce qu’il est presque plein. Veillez à éliminer tous les débris des filetages corps cellulaire.
- Chapeau haut de la cellule avec un autre embout.
- Répétez les étapes 3,1 à 3,6 pour chaque échantillon.
4. préparation des flacons de Collection
- Étiquetez chaque flacon avec le numéro d’une cellule correspondante (par exemple 1-22 ou en blanc) et le cap avec bouchon de flacon de collection ASE.
5. extraction
- Placez chaque cellule dans une fente numérotée sur le plateau supérieur en ASE.
- Placer le flacon de collection correspondant dans le même emplacement de numéro sur le plateau inférieur de l’ASE.
- Créez la méthode d’extraction en utilisant le clavier sur l’ASE. Extrait à 100 ° C et 1 200 lb/po2. Extrait de chaque échantillon x 3 avec une prise statique de 10 min et rincer le corps cellulaire avec 50 % de son volume total entre statiques cales.
- Assurez-vous que la bouteille de solvant contient suffisamment solvant pour extraire tous les échantillons.
- Rincer l’ASE 3 x avant de commencer la course en appuyant sur la touche « rinçage » sur le pavé directionnel à ASE.
- Appuyez sur start.
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L’extraction accélérée par solvant est une technique rapide, efficace et à haut débit utilisée pour séparer les biomarqueurs organiques d’un grand nombre d’échantillons de sédiments géologiques.
Traditionnellement, des méthodes d’extraction telles que la sonication ou le Soxhlet sont utilisées, cependant, l’inconvénient de ces protocoles est qu’ils sont trop lents pour traiter suffisamment de matériaux pour une reconstruction paléoclimatique détaillée. Une technique plus récente, l’extraction accélérée par solvant, ou méthode ASE, a été développée dans un souci d’efficacité et de débit élevé.
La méthode ASE utilise une combinaison de températures élevées et de pressions élevées pour extraire des échantillons et peut effectuer plusieurs échantillons en un seul cycle de préparation relativement rapide.
Cette vidéo est la troisième d’une série détaillant comment extraire des biomarqueurs des sédiments. Il couvrira la procédure et donnera un aperçu des mérites de l’ASE par rapport à la sonication ou à l’extraction Soxhlet.
Dans l’extraction accélérée par solvant, les échantillons sont chargés dans des cellules en acier qui sont ensuite chargées sur un carrousel. Les flacons de prélèvement pour chaque cellule d’échantillon sont également chargés sur un carrousel séparé. L’instrument charge une cellule d’échantillonnage dans un four interne. Le solvant est pompé à partir d’une bouteille de solvant à travers une série de vannes jusqu’à ce qu’une pression suffisante soit atteinte.
Cette pression est maintenue pendant un certain temps dicté par l’échantillon et l’analyte. Ensuite, le solvant est évacué de la cellule d’échantillonnage à travers une conduite en acier dans le flacon de collecte correspondant. Le processus peut être répété un certain nombre de fois. La température, la pression et la durée peuvent toutes être personnalisées pour l’échantillon.
La température élevée utilisée augmente la cinétique de l’extraction tandis que la haute pression empêche le solvant de volatiser. Le flacon de prélèvement contient maintenant un extrait lipidique total, et ce qui reste dans la cellule d’échantillonnage s’appelle un résidu. Il comprend des matières non organiques ainsi que des matières organiques qui ne sont pas extractibles par solvant, appelées kérogène.
Maintenant que nous connaissons les principes de l’extraction accélérée par solvant, voyons comment cela se fait en laboratoire.
Après avoir collecté des échantillons d’intérêt ; lyophiliser, homogénéiser et décontaminer comme démontré dans une autre vidéo de cette série.
Une fois que tous les échantillons ont été préparés, assemblez une cellule pour chacun d’eux à extraire, et une supplémentaire pour un blanc. Pour ce faire, vissez un capuchon d’extrémité sur le corps de la cellule. À l’aide d’une pince à épiler rincée au solvant, placez un filtre en fibre de verre brûlé sur chacun d’eux. Appuyez lentement et doucement sur le filtre à l’aide du piston.
Étiquetez les corps de cellule par numéro pour chaque échantillon et étiquetez le blanc séparément. Placez une boîte de pesée brûlée sur une balance de laboratoire et tare. Rincez une spatule avec un solvant, puis transférez-la 5 à 10 g d’échantillon dans la boîte de pesée et notez la masse.
Transférez tout le matériel dans le moule de pesée dans sa cellule correspondante. Placez un autre filtre en fibre de verre sur le dessus et tassez doucement jusqu’à ce qu’il atteigne le haut de l’échantillon.
Ajoutez un dispersant, comme de la terre de diatomées ou du sable, jusqu’à ce qu’il soit presque plein, en prenant soin d’éviter de faire pénétrer des débris dans les fils du corps cellulaire. Fermez le haut de la cellule avec un autre embout. Répétez ces étapes pour chaque échantillon et le blanc.
Étiquetez chaque flacon de prélèvement avec le numéro d’une cellule d’échantillon ou d’un blanc correspondant, et bouchez avec un bouchon de flacon. Placez chaque cellule dans un emplacement numéroté sur le plateau supérieur de l’ASE. Réglez les paramètres de la méthode d’extraction à l’aide du clavier de l’ASE pour extraire à 100 ? C ?et 1 200 psi. Extrayez chaque échantillon 3 fois avec une suspension statique de 10 minutes et rincez le corps cellulaire avec 50 % de son volume total entre les suspensions statiques.
Ensuite, assurez-vous que la bouteille de solvant en contient suffisamment pour extraire tous les échantillons. Rincez les lignes d’instruments 3 fois avant de commencer la course. Enfin, appuyez sur Démarrer.
Retirez le flacon de l’ASE. Maintenant que les biomarqueurs ont été extraits, il faut les purifier avant d’être analysés.
L’extraction accélérée par solvant est une technique polyvalente, qui peut être utilisée pour une variété d’applications, dont certaines sont explorées ici.
L’extraction accélérée par solvant peut également être utilisée sur d’autres types d’échantillons, y compris les aliments. L’analyse des résidus pour tester la contamination par les pesticides est fréquemment effectuée dans les installations réglementaires et industrielles pour déterminer la sécurité et la qualité des produits alimentaires comme les fruits ou les légumes. L’ASE peut être utilisée pour extraire des pesticides organochlorés d’échantillons d’aliments et déterminer les types ou les niveaux de résidus présents dans les produits. Ces informations peuvent ensuite être utilisées pour déterminer si les produits sont propres à la consommation humaine ou animale. Par exemple, la dieldrine doit être trouvée dans une proportion de 0 à 0,1 partie par million sur les aliments, selon le produit.
Les composants nutritionnels des aliments peuvent également être extraits à l’aide de l’ASE. Par exemple, des produits comme le chocolat, qui peuvent avoir une teneur élevée en matières grasses gravimétriques, peuvent être extraits. En utilisant de l’ASE avec de l’éther de pétrole comme solvant, la matière grasse peut être séparée des échantillons de chocolat et soumise à une analyse quantitative pour déterminer un pourcentage précis de teneur en matière grasse par quantité connue de chocolat. À l’aide de ces informations, les organismes de réglementation peuvent vérifier les allégations faites par les fabricants de chocolat, ou les fabricants peuvent obtenir des informations pour créer des étiquettes alimentaires précises.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à l’extraction de biomarqueurs lipidiques à l’aide de l’extraction accélérée par solvant, ou ASE. Les méthodes de traitement et d’analyse ultérieures peuvent être trouvées dans les vidéos suivantes.
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Q1: Why is accelerated solvent extraction better than sonication or Soxhlet extraction?
Accelerated solvent extraction is faster and more efficient than traditional methods like sonication or Soxhlet extraction. ASE combines high temperature and high pressure to extract biomarkers from sediment samples in a single, relatively fast preparation run. This high-throughput capability enables researchers to process hundreds or thousands of samples needed for detailed paleoclimate reconstruction, which older extraction methods cannot achieve.
Q2: How do temperature and pressure work together in accelerated solvent extraction?
In accelerated solvent extraction, high temperature increases the kinetics of the extraction process, speeding up biomarker separation from sediment. High pressure simultaneously keeps the solvent from volatizing, or evaporating, during extraction. This combination of elevated temperature and pressure allows the ASE method to efficiently extract organic compounds while maintaining solvent integrity throughout the procedure.
Q3: What materials are used to prepare samples for accelerated solvent extraction?
Samples are loaded into steel cells with combusted glass fiber filters placed above and below the sediment material. A dispersant such as diatomaceous earth or sand is added to fill the cell and improve solvent contact. End caps seal the cell, and collection vials receive the extracted material. All glassware and filters are combusted to remove organic contaminants before use.
Q4: What is the difference between a total lipid extract and kerogen in ASE?
A total lipid extract is the organic material dissolved by the solvent and collected in the vial after accelerated solvent extraction. Kerogen is the non-extractable organic material that remains in the sample cell after extraction. The residue left behind comprises both non-organic material and kerogen, representing compounds that are not solvent-extractable.
Q5: How can accelerated solvent extraction be used for food safety testing?
Accelerated solvent extraction can extract organochlorine pesticides and other residues from food samples like fruits and vegetables. ASE determines the types and levels of pesticide contamination present, helping regulatory and industrial facilities verify whether produce is safe for human or animal consumption. For example, dieldrin levels must remain within 0 to 0.1 parts per million depending on the product.
Q6: What role do biomarkers play in paleoclimate reconstruction?
Biomarkers like glycerol-dialkyl glycerol-tetraethers (GDGTs) are produced by archaea and bacteria and change predictably in response to air or water temperature. The distribution of these biomarkers in sediment sequences of known age allows scientists to reconstruct past temperature changes on decadal to millennial timescales. This paleoclimate data requires rapid analysis of hundreds or thousands of samples, making accelerated solvent extraction essential.
Q7: What happens to the extracted biomarkers after accelerated solvent extraction?
After accelerated solvent extraction, the total lipid extract containing biomarkers must be purified before analysis. The purification process removes unwanted compounds and concentrates the target biomarkers. Purification of a total lipid extract with column chromatography is a common next step in preparing samples for detailed chemical and paleoclimate analysis.