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Les courbes d’étalonnage sont utilisées pour comprendre la réponse instrumentale à un analyte et pour prédire la concentration de l’analyte dans un échantillon.
Une courbe d’étalonnage est créée en préparant d’abord un ensemble de solutions étalons avec des concentrations connues de l’analyte. La réponse de l’instrument est mesurée pour chacun d’eux et tracée en fonction de la concentration de la solution étalon. La partie linéaire de ce graphique peut ensuite être utilisée pour prédire la concentration d’un échantillon de l’analyte, en corrélant sa réponse à la concentration.
Cette vidéo présentera les courbes d’étalonnage et leur utilisation, en démontrant la préparation d’un ensemble d’étalons, suivie de l’analyse d’un échantillon de concentration inconnue.
Un ensemble de solutions standard est utilisé pour préparer la courbe d’étalonnage. Ces solutions consistent en une gamme de concentrations qui englobe la concentration approximative de l’analyte.
Les solutions standard sont souvent préparées avec une dilution en série. Une dilution en série est effectuée en préparant d’abord une solution mère de l’analyte. La solution mère est ensuite diluée d’une quantité connue, souvent d’un ordre de grandeur. La nouvelle solution est ensuite diluée de la même manière, et ainsi de suite. Il en résulte un ensemble de solutions dont les concentrations varient sur plusieurs ordres de grandeur.
La courbe d’étalonnage est un graphique du signal instrumental en fonction de la concentration. Le tracé des normes doit être linéaire et peut être ajusté avec l’équation y=mx+b. Les parties non linéaires de la parcelle doivent être écartées, car ces plages de concentration sont hors de la limite de linéarité.
L’équation de la droite de meilleur ajustement peut ensuite être utilisée pour déterminer la concentration de l’échantillon, en utilisant le signal de l’instrument pour établir une corrélation avec la concentration. Les échantillons dont les mesures se situent en dehors de la plage linéaire de la placette doivent être dilués afin d’être dans la plage linéaire.
La limite de détection de l’instrument, ou la mesure la plus basse qui peut être déterminée statistiquement sur le bruit, peut également être calculée à partir de la courbe d’étalonnage. Un échantillon à blanc est mesuré plusieurs fois. La limite de détection est généralement définie comme étant le signal à blanc moyen plus 3 fois son écart-type.
Enfin, la limite de quantification peut également être calculée. La limite de quantification est la plus petite quantité d’analyte pouvant être quantifiée avec précision. Cela correspond à 10 écarts-types au-dessus du signal blanc.
Maintenant que vous avez appris les bases d’une courbe d’étalonnage, voyons comment en préparer et l’utiliser en laboratoire.
Préparez d’abord une solution mère concentrée de l’étalon. Pesez avec précision l’étalon et transférez-le dans une fiole jaugée. Ajoutez une petite quantité de solvant et mélangez pour que l’échantillon se dissolve. Ensuite, remplissez jusqu’à la ligne avec du solvant. Il est important d’utiliser le même solvant que l’échantillon.
Pour préparer les étalons, pipetez la quantité requise dans la fiole jaugée. Remplissez ensuite le flacon jusqu’à la ligne avec du solvant et mélangez.
Continuez à fabriquer les étalons en les pipetant à partir de la solution mère et en les diluant. Pour une bonne courbe d’étalonnage, au moins 5 concentrations sont nécessaires.
Maintenant, analysez des échantillons avec l’instrument d’analyse, dans ce cas un spectrophotomètre UV-Vis, afin de déterminer la réponse instrumentale nécessaire à la courbe d’étalonnage.
Prenez la mesure du premier étalon. Exécutez les normes dans un ordre aléatoire, au cas où il y aurait des erreurs systématiques. Mesurez chaque étalon de 3 à 5 fois pour obtenir une estimation du bruit.
Mesurez le reste des étalons, en répétant les mesures pour chacun. Enregistrez toutes les données.
Enfin, exécutez l’échantillon. Utilisez la même matrice d’échantillonnage et les mêmes conditions de mesure que celles utilisées pour les normes. Assurez-vous que l’échantillon se situe dans la plage des étalons et dans les limites de l’instrument.
Pour construire la courbe d’étalonnage, utilisez un programme informatique pour tracer les données en fonction du signal en fonction de la concentration. Utilisez l’écart-type des mesures répétées pour chaque point de données afin de créer des barres d’erreur.
Supprimez les parties de la courbe qui ne sont pas linéaires, puis effectuez une régression linéaire et déterminez la droite la mieux ajustée. Le résultat doit être une équation de la forme y = m x + b. Une valeur R2 proche de 1 indique un bon ajustement.
Il s’agit de la courbe d’étalonnage du colorant bleu #1, mesurée à 631 nm. La réponse est linéaire entre 0 et 15 mM.
Calculez la concentration de l’échantillon à l’aide de l’équation de la droite de meilleur ajustement. L’absorbance de l’échantillon était de 0,141 et correspondait à une concentration de 6,02 mM.
Maintenant que vous avez vu comment une courbe d’étalonnage peut être utilisée avec un spectrophotomètre UV-Vis, jetons un coup d’œil à d’autres applications utiles.
Les courbes d’étalonnage sont souvent utilisées dans les applications d’électrochimie, car le signal de l’électrode doit être étalonné en fonction de la concentration d’ions dans la solution. Dans cet exemple, des données ont été collectées pour une électrode sélective d’ions pour le fluorure.
Les données de concentration doivent être tracées sur l’échelle logarithmique pour obtenir une ligne. Cette courbe d’étalonnage peut être utilisée pour mesurer la concentration de fluorure dans une solution, comme un dentifrice ou de l’eau potable.
La chromatographie liquide à haute performance, ou HPLC, est une technique de séparation et d’analyse largement utilisée en chimie analytique. La HPLC sépare les composants d’un mélange en fonction du temps nécessaire aux molécules pour parcourir la longueur de la colonne de chromatographie. Ce temps varie en fonction d’une gamme de propriétés chimiques des molécules.
L’élution des molécules est mesurée à l’aide d’un détecteur, ce qui donne lieu à un chromatogramme. La surface du pic peut être corrélée à la concentration à l’aide d’une simple courbe d’étalonnage d’une gamme de solutions standard, comme dans cet exemple d’ingrédients de soda populaires.
Dans certains cas, lorsque la matrice solution interfère avec la mesure du soluté, une courbe d’étalonnage classique peut être imprécise. Dans ces cas, une courbe d’étalonnage modifiée est préparée. Pour cela, une gamme de volumes de solution standard est ajoutée à l’échantillon. Le graphique signal-concentration est créé, où l’ordonnée à l’origine est égale à la concentration d’origine de la solution d’échantillon. Pour plus de détails sur cette technique, veuillez regarder la vidéo d’enseignement des sciences JoVE, « La méthode de l’addition standard ».
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la courbe d’étalonnage. Vous devriez maintenant comprendre où la courbe d’étalonnage est utilisée, comment la créer et comment l’utiliser pour calculer les concentrations d’échantillons.
Comme toujours, merci d’avoir regardé !
