Méthode de l'addition standard

La méthode d’addition standard est une technique d’analyse quantitative utilisée pour minimiser les effets de matrice qui interfèrent avec les signaux de mesure de l’analyte.

Les concentrations inconnues des composants sont souvent élucidées par une gamme de techniques analytiques, telles que la spectroscopie optique, la spectrométrie de masse et l’électrochimie. Cependant, la mesure peut être affectée par d’autres composants de l’échantillon, appelés matrice, et provoquer la réduction ou l’amélioration par inadvertance du signal, appelée effets de matrice. Ces effets peuvent fausser les résultats et entraîner des erreurs d’analyse importantes.

La méthode d’addition d’étalons peut être utilisée pour minimiser les effets de matrice sur les signaux de mesure. Pour ce faire, on ajoute à l’échantillon des volumes précis d’une solution d’analyte connue.

Cette vidéo présentera les bases de la méthode d’addition d’étalons et montrera comment réaliser la technique en laboratoire à l’aide d’une mesure de fluorescence.

Des effets matriciels peuvent se produire dans des échantillons complexes où un certain nombre d’autres molécules interagissent avec l’analyte. Par exemple, cela peut se produire lorsque les molécules se lient ou s’agglomérent avec l’analyte, modifiant ainsi sa capacité à devenir fluorescente. Ou la matrice peut modifier la force ionique de la solution globale, modifiant ainsi les propriétés spécifiques de l’analyte.

Pour atténuer ces effets à l’aide de la méthode de l’addition d’étalons, une gamme de volumes d’une solution étalon d’analyte est ajoutée à des volumes égaux de l’échantillon. Les volumes de solution sont ensuite égaux à l’aide d’un solvant.

Ensuite, le signal est mesuré pour les échantillons avec et sans l’addition de l’étalon. Les données sont tracées en fonction de l’intensité en fonction de la quantité d’étalon ajoutée à l’échantillon, plutôt que d’une courbe d’étalonnage classique. La concentration réelle de l’analyte dans un flacon donné est définie par l’équation suivante. La réponse instrumentale sera égale à une constante fois la concentration de l’analyte. L’équation résultante prend la forme linéaire y=mx+b. Ainsi, lorsque le graphique est extrapolé à l’absorbance nulle, l’ordonnée à l’origine est égale à la concentration inconnue de l’échantillon.

Le tracé du signal doit être linéaire sur la plage de concentration préoccupante. De plus, l’interférence ne doit pas varier lorsque le rapport entre la matrice de l’analyte et celui de l’échantillon change. Enfin, la matrice elle-même ne doit pas générer de signaux de mesure par elle-même.

L’expérience suivante étudie l’aluminium, une espèce non fluorescente, en le faisant réagir avec la 8-hydroxyquinoléine, ou 8HQ, pour former le complexe fluorescent ALQ3.

La fluorescence du complexe d’aluminium dans un solvant organique est mesurée, puis mise en relation avec la concentration de la solution d’aluminium d’origine. Cette approche est courante dans l’analyse des ions métalliques.

Maintenant que les bases de la méthode d’addition de normes ont été esquissées et que les bases de l’expérience ont été expliquées, effectuons la technique en laboratoire.

Tout d’abord, préparez la solution mère d’aluminium à 100 ppm dans l’eau, puis utilisez-la pour préparer une solution étalon à 1 ppm.

Ensuite, ajoutez 2 g de 8-hydroxyquinoléine, ou 8HQ, dans une fiole jaugée de 100 ml.

Ajouter délicatement 5,74 mL d’acide acétique glacial, puis diluer à 100 mL avec de l’eau désionisée. Cette étape permet au 8HQ de se dissoudre dans la phase aqueuse.

Ensuite, préparez le tampon en ajoutant 20 g d’acétate d’ammonium et 7 ml d’hydroxyde d’ammonium à 30 % dans une bouteille marquée de 100 ml et diluez. Vérifiez le pH à l’aide d’un bâtonnet indicateur de pH. Ce tampon aide à neutraliser l’acide dans la solution 8HQ lorsqu’il est combiné.

D’autres réactifs sont nécessaires, notamment le sulfate de sodium anhydre et le chloroforme de qualité spectrophotométrique.

Préparez maintenant les échantillons, dans ce cas en extrayant l’échantillon aqueux dans la phase organique par extraction liquide-liquide. Placez six entonnoirs de séparation de 125 ml sur les anneaux du support à anneau à l’intérieur de la hotte. Assurez-vous que toute la verrerie est scrupuleusement propre, car la verrerie sale faussera les résultats. Étiquetez séquentiellement les entonnoirs « vide », « 0 », « 1 », « 2 », « 3 » et « 4 ».

À l’aide d’une pipette, ajoutez 25 ml de la solution d’aluminium inconnue dans chacun des cinq entonnoirs séparateurs étiquetés « 0 » à « 4 ». Préparez le blanc en ajoutant 25 ml d’eau déminéralisée dans l’entonnoir étiqueté « blanc ».

Ensuite, ajoutez 1, 2, 3 et 4 ml de la solution étalon à 1 ppm dans les entonnoirs numérotés correspondants. N’ajoutez aucune solution standard à l’entonnoir blanc ou 0.

Ajouter 1 mL de la solution 8HQ et 3 mL de solution tampon dans chacun des 6 entonnoirs.

Effectuer une extraction liquide-liquide en ajoutant 10 mL de chloroforme dans chaque fiole. Secouez vigoureusement l’entonnoir et aérez de temps en temps l’entonnoir pour libérer l’accumulation de pression. Remettez l’entonnoir dans l’anneau et laissez les couches de liquide se séparer.

Ensuite, prélevez la phase chloroforme dans un bécher de 100 ml propre, sec et étiqueté. Étant donné que le chloroforme a une densité plus élevée que l’eau, il s’agit de la couche inférieure de l’entonnoir.

Transvaser l’extrait de chloroforme dans une fiole jaugée de 25 mL et boucher chaque fiole pour éviter l’évaporation.

Effectuer une deuxième extraction liquide-liquide sur la solution aqueuse restante, en ajoutant 10 mL de chloroforme dans chaque entonnoir. Agitez l’entonnoir, comme précédemment, pour transférer tout analyte restant dans la phase chloroforme. Il ne doit plus y avoir de couleur jaune dans la phase aqueuse supérieure.

Répétez la deuxième extraction pour chaque entonnoir, puis collectez les phases chloroforme dans les béchers étiquetés correspondants. Versez le chloroforme recueilli dans leurs fioles jaugées respectives et diluez au trait de jauge avec du chloroforme frais.

Pour éliminer les traces d’eau, ajoutez environ 1 g de sulfate de sodium anhydre dans chacun des six béchers de 100 ml. Transférez les solutions dans leurs béchers respectifs et remuez pour faciliter la déshydratation de l’échantillon.

Décanter l’extrait de chloroforme dans une cellule de fluorimètre de quartz.

Installez le fluorimètre selon les instructions du fabricant et réglez la tension sur 400 V. Ensuite, ouvrez le programme d’acquisition de données sur l’ordinateur.

Utilisez l’échantillon 2 pour déterminer les meilleures longueurs d’onde d’excitation et d’émission. Réglez la longueur d’onde d’émission sur 500 nm et exécutez un balayage d’excitation de 335 à 435 nm, avec une vitesse de balayage de 2 nm/s.

À partir du graphique de fluorescence, déterminez la longueur d’onde maximale pour l’excitation. Réglez l’instrument sur cette valeur de longueur d’onde d’excitation, dans ce cas 399 nm.

Ensuite, déterminez la longueur d’onde d’émission en effectuant un balayage de 450 à 550 nm. À partir du tracé de fluorescence résultant, déterminez la longueur d’onde maximale et réglez la longueur d’onde d’émission, dans ce cas 520 nm.

Mesurez chaque échantillon, y compris le blanc, à la longueur d’onde d’excitation et d’émission sélectionnée. Enregistrez chaque lecture d’intensité de fluorescence.

Soustrayez la fluorescence mesurée de l’échantillon à blanc de chacun des 5 autres échantillons.

Tracez l’intensité de fluorescence de chacun des cinq échantillons en fonction de la quantité d’aluminium ajoutée à l’échantillon. Déterminez la valeur des moindres carrés du graphique résultant, puis notez la pente et l’ordonnée à l’origine.

Le graphique de l’intensité de fluorescence en fonction de la quantité d’aluminium ajoutée a donné une ligne des moindres carrés, comme indiqué. La quantité d’aluminium dans l’échantillon peut ensuite être calculée à l’aide de cette ligne. Comme la quantité d’inconnu ajoutée était de 25 ml, la valeur déterminée, 2,916 μg, est divisée par 25 ml. Cela donne un résultat final de 0,117 μg/ml, soit 0,117 ppm. C’est assez proche de la valeur connue de 0,110 ppm.

Examinons maintenant d’autres techniques d’analyse qui peuvent fausser les résultats en raison des effets de matrice.

La spectroscopie d’absorption atomique est une méthode analytique qui mesure l’absorbance de la lumière par un analyte cible en phase gazeuse. Pour la plupart des échantillons, une simple courbe d’étalonnage reliant l’absorption à la concentration de l’échantillon peut servir de méthode fiable pour quantifier une concentration inconnue.

Cependant, cette technique peut perdre en précision si d’autres composants du mélange interagissent avec l’analyte cible et suppriment ou améliorent l’absorption. La méthode d’addition standard peut être utilisée dans ce cas pour tenir compte des effets de ces interactions, en particulier dans les échantillons où la matrice ne peut pas être retirée avant l’analyse.

L’étalonnage de l’instrument joue un rôle crucial dans la précision d’une mesure. La méthode de l’addition d’étalons est souvent utilisée pour faciliter l’étalonnage d’instruments tels que l’ICP-MS. L’ICP-MS est une méthode comparative, c’est-à-dire que la mesure d’un échantillon inconnu est basée sur la mesure d’un étalon chimique.

Ainsi, l’incertitude d’une mesure d’une inconnue ne peut pas être meilleure que l’incertitude de l’étalonnage. La méthode de l’addition standard peut donc être utilisée pour créer une courbe d’étalonnage plus précise que la méthode standard et qui tient compte des interactions matricielles dans l’échantillon.

De nombreuses molécules biologiques sont analysées à l’aide de la chromatographie liquide à haute performance, ou HPLC. La HPLC est une technique qui sépare et analyse des mélanges complexes en fonction des propriétés des molécules telles que la polarité, la charge et la taille. Le moment où l’analyte quitte la colonne permet à l’utilisateur d’identifier chaque composant du mélange.

Les molécules biologiques peuvent souvent interagir dans un mélange et sont grandement affectées par la matrice dans laquelle elles sont suspendues. Souvent, la méthode de l’addition standard est utilisée pour créer une courbe d’étalonnage qui tient compte de ces effets.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la méthode d’addition standard. Vous devriez maintenant comprendre comment exécuter la technique pour tenir compte des effets de matrice dans l’analyse d’échantillons.

Merci d’avoir regardé !