Spectroscopie ultraviolet-visible (UV-Vis)

Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Spectroscopy

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Analytical Chemistry

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Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Spectroscopy

3.2: Internal Standards

3.7: X-ray Fluorescence (XRF)

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09:21 min

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April 30, 2023

Overview

Source : Laboratoire du Dr B. Jill Venton – University of Virginia

Spectroscopie ultraviolet-visible (UV-Vis) est une des techniques analytiques plus populaires, car il est très polyvalent et capable de détecter presque chaque molécule. Avec la spectroscopie UV-Vis, la lumière UV-Vis est passée à travers un échantillon et la transmission de la lumière par un échantillon est mesurée. De la transmission (T), l’absorption peut être calculée comme une =-log (T). Un spectre d’absorbance qui montre l’absorbance d’un composé à différentes longueurs d’onde est obtenu. Le montant de l’absorbance à une longueur d’onde est due à la structure chimique de la molécule.

UV-visible peut être utilisé de manière qualitative, pour identifier les groupes fonctionnels ou de confirmer l’identité d’un composé en comparant le spectre d’absorbance. Il peut également être utilisé de manière quantitative, comme concentration de l’analyte est liée à l’absorption à l’aide de la Loi de Beer. Spectroscopie ultraviolet-visible est utilisée pour quantifier la quantité d’ADN ou de protéines dans un échantillon pour analyse de l’eau et comme un détecteur pour de nombreux types de chromatographie. Cinétique des réactions chimiques sont également mesurée par spectroscopie UV-visible en prenant des mesures répétées de l’UV-visible au fil du temps. UV-Vis sont généralement pris avec un spectrophotomètre. UV-Vis est également un détecteur très populaire pour les autres techniques d’analyse, comme la chromatographie, parce qu’il peut détecter de nombreux composés.

En général, UV-Vis n’est pas la technique de spectroscopie plus sensible, car pas beaucoup de lumière est absorbée sur une longueur de chemin d’accès court. Autres techniques de spectroscopie comme la fluorescence ont une sensibilité plus élevée, mais ils ne sont pas généralement applicables, comme la plupart des molécules ne sont pas fluorescentes. UV-Vis a une sensibilité similaire aux autres mesures d’absorbance, telles que la spectroscopie infrarouge.

Principles

UV-Vis est souvent appelé une technique générale parce que la plupart des molécules absorbera dans la gamme de longueur d’onde UV-Vis. Le UV s’étend de 100 à 400 nm et le spectre visible, de 400 à 700 nm. La plage de 100 à 200 nm est appelée l’UV profond. Sources de lumière sont plus difficiles à trouver pour cette gamme, donc il n’est pas couramment utilisé pour les mesures de l’UV-Vis. Typiques spectromètres UV-Vis utilisent une lampe au deutérium pour le UV que produit feu de 170 – 375 nm et une lampe à filament de tungstène pour visible, qui produit de lumière de 350 – 2 500 nm.

Quand un photon frappe une molécule et est absorbé, la molécule est promue dans un état énergétique plus excité. Lumière UV-visible a assez d’énergie pour promouvoir des électrons à un état électronique supérieur, de la plus haute orbitale moléculaire occupée (HOMO) à la plus basse orbitale moléculaire inoccupée (LUMO). La différence d’énergie entre l’HOMO et la LUMO est appelée la bande interdite. En règle générale, ces orbitales sont appelés collage et anti-adhérant. L’énergie du photon doit correspondre exactement à la bande interdite pour le photon à absorber. Ainsi, molécules avec des structures chimiques différentes ont différentes énergies bande les lacunes et les différents spectres d’absorption. Les transitions plus courantes qui entrent dans la gamme UV-Vis sont π-π * et n – π *. Orbitales pi découlent des doubles liaisons, et n orbitales sont pour les électrons non-liantes. Star de pi sont les orbitales anti-liaison pi. Ainsi, la meilleure absorption UV-Vis est de molécules contenant des doubles liaisons. Pi orbitales adjacentes qui sont reliées, appelé conjugaison, généralement augmente l’absorption. Sigma-σ * transitions, associées à des liaisons simples, sont des énergies plus élevées et tomber dans l’UV profond, donc ils sont moins utiles pour l’utilisation en routine. L’apparition de bandes larges ou les épaules sur la structure de l’UV-Vis tient les nombreux États vibrations et de rotationnels d’une molécule, qui conduisent à séparer les lacunes de bande énergie des énergies légèrement différentes.

Pour les molécules avec absorption dans le visible, les composés apparaîtra souvent colorées. Cependant, une idée fausse commune est que la longueur d’onde d’absorption maximale (λ_max) pour un composé est la couleur, qu’il semble. Un composé qui apparaît rouge n’a pas beaucoup d’absorption dans la région rouge du spectre. Au lieu de cela, le λ_max pour un composé qui ressemble rouge est vert. La couleur d’un composé surgit parce que ces longueurs d’onde de la lumière sont sélectivement transmis par le biais de l’échantillon, et donc ils ne sont pas absorbés. Une roue chromatique est utile pour déterminer quelle couleur va absorber un composé et quelle gamme du λ_maxsera, comme la couleur directement en face de la roue de la couleur observée est la couleur qui est plus absorbée.

L’absorption suit la Loi de Beer, A = εbC où ε est le coefficient d’atténuation molaire, b est la longueur du trajet, et C est la concentration. Le coefficient d’atténuation molaire est la caractéristique d’un composé individuel d’absorber à une longueur d’onde donnée et cette propriété est due à des groupes fonctionnels, conjugaison, etc.. Si un composé n’a pas un fort coefficient d’atténuation, il pourrait être marqué avec un ensemble approprié d’augmenter son absorption. Longueur de chemin d’accès est généralement liée à la taille de la cuve et 1 cm de spectrophotomètres standards.

UV-Vis est effectuée sur une variété d’instruments, du traditionnels spectrophotomètres à plusieurs lecteurs de plaques de moderne-jour. Il faut choisir la longueur d’onde d’absorbance, soit à l’aide d’un filtre ou un monochromateur. Un monochromateur est un dispositif qui sépare les longueurs d’onde de la lumière dans l’espace et place ensuite une fente de sortie correspondant à la longueur d’onde désirée de la lumière. Monochromateurs peuvent être analysés afin de fournir un spectre d’absorbance ensemble. Alternativement, un instrument de diodes permet toutes les couleurs de la lumière pour être transmis par le biais de l’échantillon, puis la lumière est séparée en différentes longueurs d’onde dans l’espace et détectés en utilisant des photodiodes. Instruments de diodes recueillent plein spectre plus rapidement, mais sont plus compliqués et plus chers.

Procedure

1. calibrer le spectromètre

Allumez le spectromètre UV-Vis et laisser les feux pour se réchauffer pendant une période appropriée de temps (environ 20 min) pour stabiliser.
Remplir une cuvette avec le solvant pour l’échantillon et assurez-vous que l’extérieur est propre. Ceci servira comme blanc et aider à tenir compte de légères pertes en raison de la diffusion ou absorption par le solvant.
Placez la cuve dans le spectromètre. Veillez à aligner la cuve correctement, car souvent la cuvette a deux parties, qui sont destinés à la manutention (peuvent être rainurés) et ne sont pas censés briller la lumière à travers.
Faire une lecture pour l’essai à blanc. L’absorbance devrait être minime, mais toute absorption devrait être déduite sur de futurs échantillons. Certains instruments peuvent stocker les données vides et effectuer la soustraction automatiquement.

2. effectuer un spectre d’Absorbance

Remplir la cuvette avec l’échantillon. Pour s’assurer que le transfert est quantitatif, rincer la cuvette deux fois avec l’échantillon et puis remplissez-le sur ¾ plein. Assurez-vous que l’extérieur est propre des empreintes digitales, etc..
Placez la cuve dans le spectromètre dans le bon sens.
Couvrir la cuve afin d’éviter toute lumière ambiante.
Recueillir un spectre d’absorbance en permettant à l’instrument parcourir les différentes longueurs d’onde et recueillir l’absorbance. La gamme de longueur d’onde peut être définie avec des informations sur l’exemple spécifique, mais une gamme de 200 à 800 nm est standard. Un instrument de diodes est en mesure de recueillir un spectre d’absorbance ensemble en une seule frappe.
À partir du spectre d’absorbance collectées, déterminer le maximum d’absorbance (λ_max). Répétez la collection des spectres pour obtenir une estimation de l’erreur en λ_max.
Pour faire une courbe d’étalonnage, percevoir le spectre UV-Vis d’une variété d’échantillons de concentration différente. Spectromètres sont souvent limitées à une gamme de linéarité et ne sera pas capables de mesurer une valeur d’absorbance supérieure à 1,5. Si les valeurs d’absorbance de l’échantillon sont en dehors de la gamme de linéarité de l’instrument, diluer l’échantillon pour obtenir les valeurs dans la plage linéaire.

3. cinétique des expériences avec la spectroscopie UV-visible

UV-visible peut être utilisé pour des expériences de cinétique en examinant la différence d’absorption au fil du temps. Pour une expérience de cinétique, prendre une lecture initiale de l’échantillon.
Ajouter rapidement le réactif pour lancer la réaction chimique.
Remuez bien pour mélanger avec l’échantillon. Si on ajoute une petite quantité, cela pourrait se faire dans une cuvette. Vous pouvez également mélanger le réactif avec l’échantillon et versez rapidement certains dans une cuvette pour une mesure.
Mesurer l’absorbance à la λ_max pour les analytes d’intérêt au fil du temps. Si en utilisant le réactif de mesure étant (c.-à-d. l’absorbance est de monter parce qu’il est moins réactif à absorber), puis la désintégration indiquera l’ordre de la réaction.
À l’aide d’une courbe d’étalonnage, faire un terrain de temps de vs concentration d’analyte, convertir la valeur d’absorbance en concentration. A partir de là, ce graphique peut être adapté avec les formules appropriées pour déterminer les constantes de vitesse de réaction.

Spectroscopie ultraviolet-visible ou UV-visible, est l’une des techniques analytiques plus populaires dans le laboratoire.

En spectroscopie UV-Vis, lumière passe à travers un échantillon à une longueur d’onde spécifique dans l’UV ou le spectre visible. Si l’échantillon absorbe une partie de la lumière, pas tous de la lumière sera passer à travers, ou être transmis. Transmission est le rapport entre l’intensité de la lumière transmise à la lumière incidente et est corrélée à l’absorbance. L’absorption peut être utilisée de manière quantitative, pour obtenir la concentration d’un échantillon. Il peut être également utilisé de manière qualitative, afin d’identifier un composé en faisant correspondre l’absorbance mesurée sur une plage de longueurs d’onde, appelé le spectre d’absorbance, aux données publiées. Cette vidéo présentera la spectroscopie UV-Vis et son utilisation en laboratoire pour déterminer l’échantillon concentration et réaction cinétique.

Quand un photon frappe une molécule et est absorbé, la molécule est promue de son état fondamental dans un état d’énergie plus élevé. La différence d’énergie entre les deux est la bande interdite. L’énergie du photon doit correspondre exactement à la bande interdite dans l’ordre pour le photon à absorber. La structure chimique détermine la bande interdite ; C’est pourquoi molécules chaque ont des spectres d’absorbance unique.

Absorbance suit la Loi de Beer, laquelle absorbance États équivaut au coefficient d’atténuation molaire fois la longueur du trajet et la concentration. Le coefficient d’atténuation molaire est lié à la capacité du composé individuels d’absorber la lumière d’une longueur d’onde spécifique. Longueur du chemin se réfère à la distance parcourue par la lumière à travers l’échantillon, qui est généralement de 1 cm pour les cuves standards. Loi de Beer peut être utilisé pour calculer la concentration de l’échantillon, si la capacité d’absorption est connue, ou une courbe d’étalonnage peut être utilisée.

UV-Vis est souvent appelé une technique générale, comme la plupart des molécules absorbent la lumière dans la gamme de longueur d’onde UV-visible. La gamme UV s’étend de 100 à 400 nm et les plages du spectre visible entre 400 et 700 nm. Cependant, la plupart spectrophotomètres ne fonctionnent pas dans l’ultraviolet profond de 100 à 200 nm, car les sources lumineuses dans cette gamme sont coûteux. La plupart des spectrophotomètres UV-Vis utilisent une lampe au deutérium pour la gamme UV, qui produit de lumière de 170 – 375 nm et une lampe à incandescence de tungstène pour le domaine du visible, qui produit de lumière de 350 – 2 500 nm.

La source lumineuse étant généralement une lampe avec des gammes de grande longueur d’onde, la longueur d’onde d’absorbance spécifique est sélectionnée à l’aide de filtres ou un monochromateur. Un monochromateur est un dispositif qui sépare les longueurs d’onde de la lumière dans l’espace et puis place une fente de sortie correspondant à la longueur d’onde désirée de la lumière. Le monochromateur peut être scanné sur une plage de longueur d’onde de fournir un spectre d’absorbance ensemble. Cela rend la technique utile pour quantifier et identifier un large éventail de molécules.

Maintenant que les bases de la spectroscopie UV-Vis ont été soulignées, jetons un oeil à une simple expérience UV-Vis dans le laboratoire.

Avant de commencer la mesure, mettre sur le spectrophotomètre et laisser les lampes chauffer pendant une période appropriée pour stabiliser leur.

Préparer un blanc en remplissant une cuvette propre avec le solvant de l’échantillon et puis essuyer l’extérieur avec du papier non pelucheux pour enlever les traces de doigts.

S’assurer que la cuve est bien alignée avec toute surface rainurée sur la marche des rayons et l’insérer dans le spectrophotomètre. Fixez le couvercle pour empêcher la lumière ambiante de pénétrer dans le système.

Mesurer l’absorbance de l’essai à blanc à une longueur d’onde, ou sur une plage de longueur d’onde. Enregistrer ou sur enregistrer l’absorbance, comme elle doit être soustraite de l’absorbance de l’échantillon.

Ensuite, jeter le blanc et rincer la cuvette deux fois avec l’échantillon. Puis, remplir la cuvette sur ¾ pleine avec l’échantillon. Essuyez l’extérieur de la cuve, encore une fois, pour s’assurer qu’il est propre et exempt de traces de doigts.

Placez la cuve dans le spectrophotomètre dans le bon sens et fixez le couvercle.

Recueillir une mesure de l’absorbance ou le spectre à la même longueur d’onde ou de la plage de longueur d’onde comme le blanc. Soustraire le spectre blanc ou la mesure, si l’instrument ne le font pas automatiquement.

À partir du spectre d’absorbance collectées, déterminer l’absorbance maximum ou λ_max.

Afin de quantifier la quantité d’analyte dans l’échantillon, créer une courbe d’étalonnage à l’aide d’une fourchette de concentrations d’analyte connues. Pour plus d’informations sur la façon de construire et d’utiliser une courbe d’étalonnage, regardez la vidéo « courbes d’étalonnage » de cette collection.

La mesure de l’absorbance peut également être utilisée pour calculer cinétique des réactions en mesurant l’augmentation ou diminution dans une concentration de composés tout au long de la réaction. Commencez par prendre une lecture initiale de l’échantillon, bleu colorant dans ce cas, à l’absorbance maximale avant la réaction.

Ensuite, rapidement ajouter le réactif, eau de Javel dans ce cas, pour commencer la réaction chimique. Remuez bien, pour qu’il se mélange avec l’échantillon.

Mesurer l’absorbance à l’absorbance maximale dans le temps.

Le spectre d’absorbance initiale de l’échantillon de colorant bleu apparaît. Les couleurs d’arrière-plan montrent les couleurs de la lumière dans le spectre visible. Le colorant bleu a un maximum d’absorbance à environ 630 nm.

La cinétique de la réaction entre la teinture bleue et l’eau de Javel a été mesurée au fil du temps. L’absorbance du colorant bleu diminue au fil du temps, car il réagit avec l’eau de Javel. L’absorbance atteint près de zéro après 300 s, indiquant que la réaction a s’approchait d’achèvement. Pour plus d’informations sur la cinétique et les réactions, s’il vous plaît regarder le JoVE Science Education vidéo « lois de taux de réaction ».

Spectroscopie ultraviolet-visible est utilisée largement dans de nombreux domaines de recherche différentes d’identifier ou de quantifier un échantillon.

Par exemple, spectroscopie ultraviolet-visible est utilisée largement dans les domaines biologiques afin de quantifier la quantité de protéines dans un échantillon. Une analyse de Bradford est souvent utilisée pour quantifier les protéines, avec l’aide d’un colorant. Tout d’abord, une courbe d’étalonnage des concentrations de protéines connues est prêt, généralement à l’aide de l’albumine sérique Bovine, ou BSA. Ensuite, teinté de bleu de Coomassie est ajoutée à toutes les normes et à l’échantillon. L’absorbance du complexe protéine-colorant est alors mesurée à 595 nm.

Alternativement, des protéines peuvent être mesurées directement par leur absorption à 280 nm. Dans cet exemple, la concentration de protéines est quantifiée à l’aide d’un spectrophotomètre à ultra bas volume. Pour beaucoup de protéines, une absorbance de 1 correspond à une concentration de 1 mg/mL.

Spectroscopie ultraviolet-visible est également utilisée pour quantifier la quantité de cellules bactériennes dans une culture cellulaire. Pour cette mesure, l’absorbance ou densité optique, est mesurée à 600 nm. En règle générale, une mesure de₆₀₀ OD 1 indique la présence de 8 x 10⁸ bactéries / mL. Mesure de la densité cellulaire durant toute la croissance de la culture permet la détermination de la courbe de croissance bactérienne et peut aider à identifier lorsqu’une culture est dans sa phase de croissance exponentielle.

L’oxyde d’azote et dioxyde d’azote ou NO_x, est un sous-produit des gaz d’échappement automobile et peut être nocifs pour l’environnement parce qu’il forme l’ozone troposphérique néfaste. PAS de_x peut être mesurée par la réaction avec une solution d’acide sulfanilique et naphtyl-éthylènediamine. La solution obtenue est une molécule de rose couleur azo dye, dont l’intensité est directement corrélée à la concentration de NO_x . Cette concentration peut ensuite être déterminée à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis.

Vous avez juste regardé introduction de Jupiter à la spectroscopie UV-visible. Vous devez maintenant comprendre les bases de fonctionnement UV-Vis, comment mesurer un échantillon à l’aide d’un UV-Vis et de corréler l’absorbance à la concentration de l’échantillon.

Merci de regarder !

Results

UV-visible peut être utilisé pour obtenir un éventail de composés colorés. Dans la Figure 1 a, le spectre d’absorption d’un colorant bleu apparaît. L’arrière-plan montre les couleurs de la lumière dans le spectre visible. Le colorant bleu a une absorption_maximum de λ dans l’orange/rouge. Figure 1 b montre un spectre d’un colorant rouge, avec λ_max dans le vert.

Cinétique mesurable d’une parcelle de l’absorbance à une longueur d’onde au fil du temps. La figure 2 montre une parcelle de l’absorbance d’un colorant bleu (630 nm) car il réagit avec l’eau de Javel.

Figure 1. Spectres d’absorption UV-Vis. A. bleu colorant #1 a absorbance maximale dans l’orange/rouge. B. rouge colorant #40 a l’absorbance maximale dans le vert. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2. UV-Vis pour la cinétique. Absorbance du colorant bleu #1 comme il réagit avec l’eau de Javel. La courbe peut être adaptée avec une décroissance exponentielle, ce qui indique de la cinétique de premier ordre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Applications and Summary

UV-Vis est utilisé dans de nombreuses analyses chimiques. Il est utilisé pour doser la quantité de protéines dans une solution, comme la plupart des protéines absorbent fortement à 280 nm. La figure 3 illustre un exemple de spectres du cytochrome C, qui a une forte absorbance à 280 et également à 450 en raison d’un hème du groupe. UV-Vis est également utilisé comme une technique standard pour quantifier la quantité d’ADN dans un échantillon, car toutes les bases absorbent fortement à 260 nm. ARN et les protéines absorbent aussi à 260 nm, alors l’absorbance à d’autres longueurs d’onde peut être mesuré afin de vérifier des interférences. Plus précisément, les protéines absorbent fortement à 280 nm, donc le rapport de l’absorbance à 280/260 peut donner une mesure du ratio de protéine à l’ADN dans un échantillon.

La plupart des analyses simples mesurent la longueur d’une onde absorbance à la fois. Toutefois, les informations plus chimiques sont présentes si des mesures sont effectuées à plusieurs longueurs d’onde simultanément. Barrettes de diodes instruments capture toute la lumière qui est transmise, diviser la lumière en différentes couleurs à l’aide d’un prisme ou un caillebotis holographique et absorbance à différentes longueurs d’onde est capturé sur un réseau linéaire de photodiodes. L’avantage de cette méthode est qu’il est utile pour mesurer plusieurs molécules différentes simultanément.

Figure 3. Spectre UV-Vis d’une protéine. Du pic à 280 nm est révélateur d’une protéine. Le pic à 450 est due à l’absorption du groupe hème du cytochrome C.

Transcript

Ultraviolet-visible, or UV-Vis, spectroscopy is one of the most popular analytical techniques in the laboratory.

In UV-Vis spectroscopy, light is passed through a sample at a specific wavelength in the UV or visible spectrum. If the sample absorbs some of the light, not all of the light will be pass through, or be transmitted. Transmission is the ratio of the intensity of the transmitted light to the incident light, and is correlated to absorbance. The absorbance can be used in a quantitative manner, to obtain the concentration of a sample. It can also be used in a qualitative manner, to identify a compound by matching the measured absorbance over a range of wavelengths, called the absorbance spectrum, to the published data. This video will introduce UV-Vis spectroscopy, and demonstrate its use in the laboratory in determining sample concentration and reaction kinetics.

When a photon hits a molecule and is absorbed, the molecule is promoted from its ground state into a higher energy state. The energy difference between the two is the band gap. The energy of the photon must exactly match the band gap in order for the photon to be absorbed. The chemical structure determines the band gap; therefore molecules each have unique absorbance spectra.

Absorbance follows Beer’s Law, which states absorbance equals the molar attenuation coefficient times the path length and concentration. The molar attenuation coefficient is related to the individual compound’s ability to absorb light of a specific wavelength. Path length refers to the distance traveled by light through the sample, which is typically 1 cm for standard cuvettes. Beer’s law can be used to calculate sample concentration, if the absorptivity is known, or a calibration curve can be used.

UV-Vis is often called a general technique, as most molecules absorb light in the UV-visible wavelength range. The UV range extends from 100–400 nm, and the visible spectrum ranges from 400–700 nm. However, most spectrophotometers do not operate in the deep UV range of 100–200 nm, as light sources in this range are expensive. Most UV-Vis spectrophotometers use a deuterium lamp for the UV range, which produces light from 170–375 nm, and a tungsten filament lamp for the visible range, which produces light from 350–2,500 nm.

Since the light source is usually a lamp with broad wavelength ranges, the specific absorbance wavelength is selected using filters or a monochromator. A monochromator is a device that separates the wavelengths of light spatially, and then places an exit slit where the desired wavelength of light is. The monochromator can be scanned over a wavelength range to provide an entire absorbance spectrum. This makes the technique useful for quantifying and identifying a wide range of molecules.

Now that the basics of UV-Vis spectroscopy have been outlined, lets take a look at a simple UV-Vis experiment in the laboratory.

Before beginning the measurement, turn on the spectrophotometer, and allow the lamps to warm up for an appropriate period of time to stabilize them.

Prepare a blank by filling a clean cuvette with the sample solvent, and then wipe the outside with lint-free paper to remove any fingerprints.

Ensure that the cuvette is aligned properly with any grooved sides out of the beam-path, and insert it into the spectrophotometer. Secure the lid to prevent ambient light from entering the system.

Measure the absorbance of the blank at one wavelength, or over a wavelength range. Record or save the absorbance, as it must be subtracted from the absorbance of the sample.

Next, discard the blank and rinse the cuvette twice with sample. Then, fill the cuvette about ¾ full with sample. Wipe the outside of the cuvette again, to ensure that it is clean and free of fingerprints.

Place the cuvette in the spectrophotometer in the correct orientation, and secure the lid.

Collect an absorbance measurement or spectrum at the same wavelength or wavelength range as the blank. Subtract the blank spectrum or measurement, if the instrument does not automatically do so.

From the collected absorbance spectrum, determine the absorbance maximum, or λmax.

To quantify the amount of analyte in the sample, create a calibration curve using a range of known analyte concentrations. For more information on how to construct and use a calibration curve, please watch this collection’s video “Calibration Curves”.

The absorbance measurement can also be used to calculate reaction kinetics by measuring the increase or decrease in a compounds concentration throughout the reaction. Begin by taking an initial reading of the sample, blue dye in this case, at the absorbance maximum before the reaction.

Next, quickly add the reagent, bleach in this case, to start the chemical reaction. Stir it well, so that it mixes with the sample.

Measure the absorbance at the absorbance maximum over time.

The initial absorbance spectrum of the blue dye sample is shown. The background colors show the colors of light in the visible spectrum. The blue dye has an absorbance maximum at about 630 nm.

The kinetics of the reaction between blue dye and bleach was measured over time. The absorbance of blue dye decreases over time, as it reacts with the bleach. The absorbance reaches near zero after 300 s, indicating that the reaction has neared completion. For more information on kinetics and reactions, please watch the JoVE Science Education video “Reaction Rate Laws”.

UV-Vis spectroscopy is used heavily in many different research areas to identify or quantify a sample.

For example, UV-Vis spectroscopy is used heavily in biological fields to quantify the amount of protein in a sample. A Bradford assay is often used to quantify proteins, with the aid of a dye. First, a calibration curve of known protein concentrations is prepared, typically using Bovine Serum Albumin, or BSA. Then Coomassie blue stain is added to each of the standards and to the sample. The absorbance of the protein-dye complex is then measured at 595 nm.

Alternatively, proteins can be measured directly by their absorbance at 280 nm. In this example, protein concentration is quantified using an ultra low volume spectrophotometer. For many proteins, an absorbance of 1 correlates to a concentration of 1 mg/mL.

UV-Vis spectroscopy is also used to quantify the amount of bacterial cells in a cell culture. For this measurement, the absorbance, or optical density, is measured at 600 nm. Typically, an OD600 measurement of 1 indicates the presence of 8 x 108 bacterial cells per mL. Measuring the cell density throughout culture growth enables the determination of the bacterial growth curve, and can help to identify when a culture is in its exponential growth phase.

Nitrogen oxide and nitrogen dioxide, or NOx, is a by-product of automobile exhaust, and can be harmful to the environment because it forms damaging tropospheric ozone. NOx can be measured by reacting it with a solution of sulfanilic acid and napthyl-ethylenediamine. The resulting solution is a pink colored azo dye molecule, the intensity of which is directly correlated to NOx concentration. This concentration can then be determined using a UV-Vis spectrophotometer.

You’ve just watched JoVE’s introduction to UV-visible spectroscopy. You should now understand the basics of UV-Vis operation, how to measure a sample using a UV-Vis and how to correlate absorbance to sample concentration.

Thanks for watching!