3.5: Spectroscopie ultraviolet-visible (UV-Vis)

1. calibrer le spectromètre

1. Allumez le spectromètre UV-Vis et laisser les feux pour se réchauffer pendant une période appropriée de temps (environ 20 min) pour stabiliser.
2. Remplir une cuvette avec le solvant pour l’échantillon et assurez-vous que l’extérieur est propre. Ceci servira comme blanc et aider à tenir compte de légères pertes en raison de la diffusion ou absorption par le solvant.
3. Placez la cuve dans le spectromètre. Veillez à aligner la cuve correctement, car souvent la cuvette a deux parties, qui sont destinés à la manutention (peuvent être rainurés) et ne sont pas censés briller la lumière à travers.
4. Faire une lecture pour l’essai à blanc. L’absorbance devrait être minime, mais toute absorption devrait être déduite sur de futurs échantillons. Certains instruments peuvent stocker les données vides et effectuer la soustraction automatiquement.

2. effectuer un spectre d’Absorbance

1. Remplir la cuvette avec l’échantillon. Pour s’assurer que le transfert est quantitatif, rincer la cuvette deux fois avec l’échantillon et puis remplissez-le sur ¾ plein. Assurez-vous que l’extérieur est propre des empreintes digitales, etc..
2. Placez la cuve dans le spectromètre dans le bon sens.
3. Couvrir la cuve afin d’éviter toute lumière ambiante.
4. Recueillir un spectre d’absorbance en permettant à l’instrument parcourir les différentes longueurs d’onde et recueillir l’absorbance. La gamme de longueur d’onde peut être définie avec des informations sur l’exemple spécifique, mais une gamme de 200 à 800 nm est standard. Un instrument de diodes est en mesure de recueillir un spectre d’absorbance ensemble en une seule frappe.
5. À partir du spectre d’absorbance collectées, déterminer le maximum d’absorbance (λ_max). Répétez la collection des spectres pour obtenir une estimation de l’erreur en λ_max.
6. Pour faire une courbe d’étalonnage, percevoir le spectre UV-Vis d’une variété d’échantillons de concentration différente. Spectromètres sont souvent limitées à une gamme de linéarité et ne sera pas capables de mesurer une valeur d’absorbance supérieure à 1,5. Si les valeurs d’absorbance de l’échantillon sont en dehors de la gamme de linéarité de l’instrument, diluer l’échantillon pour obtenir les valeurs dans la plage linéaire.

3. cinétique des expériences avec la spectroscopie UV-visible

1. UV-visible peut être utilisé pour des expériences de cinétique en examinant la différence d’absorption au fil du temps. Pour une expérience de cinétique, prendre une lecture initiale de l’échantillon.
2. Ajouter rapidement le réactif pour lancer la réaction chimique.
3. Remuez bien pour mélanger avec l’échantillon. Si on ajoute une petite quantité, cela pourrait se faire dans une cuvette. Vous pouvez également mélanger le réactif avec l’échantillon et versez rapidement certains dans une cuvette pour une mesure.
4. Mesurer l’absorbance à la λ_max pour les analytes d’intérêt au fil du temps. Si en utilisant le réactif de mesure étant (c.-à-d. l’absorbance est de monter parce qu’il est moins réactif à absorber), puis la désintégration indiquera l’ordre de la réaction.
5. À l’aide d’une courbe d’étalonnage, faire un terrain de temps de vs concentration d’analyte, convertir la valeur d’absorbance en concentration. A partir de là, ce graphique peut être adapté avec les formules appropriées pour déterminer les constantes de vitesse de réaction.

La spectroscopie ultraviolette-visible, ou UV-Vis, est l’une des techniques d’analyse les plus populaires en laboratoire.

En spectroscopie UV-Vis, la lumière traverse un échantillon à une longueur d’onde spécifique dans le spectre UV ou visible. Si l’échantillon absorbe une partie de la lumière, toute la lumière ne passera pas à travers ou ne sera pas transmise. La transmission est le rapport entre l’intensité de la lumière transmise et la lumière incidente, et est corrélée à l’absorbance. L’absorbance peut être utilisée de manière quantitative, pour obtenir la concentration d’un échantillon. Il peut également être utilisé de manière qualitative, pour identifier un composé en faisant correspondre l’absorbance mesurée sur une gamme de longueurs d’onde, appelée spectre d’absorbance, aux données publiées. Cette vidéo présentera la spectroscopie UV-Vis et démontrera son utilisation en laboratoire pour déterminer la concentration d’un échantillon et la cinétique de réaction.

Lorsqu’un photon frappe une molécule et est absorbé, la molécule est promue de son état fondamental à un état d’énergie supérieur. La différence d’énergie entre les deux est la bande interdite. L’énergie du photon doit correspondre exactement à la bande interdite pour que le photon soit absorbé. La structure chimique détermine la bande interdite ; Par conséquent, les molécules ont chacune des spectres d’absorbance uniques.

L’absorbance suit la loi de Beer, qui stipule que l’absorbance est égale au coefficient d’atténuation molaire multiplié par la longueur du trajet et la concentration. Le coefficient d’atténuation molaire est lié à la capacité du composé individuel à absorber la lumière d’une longueur d’onde spécifique. La longueur du trajet fait référence à la distance parcourue par la lumière à travers l’échantillon, qui est généralement de 1 cm pour les cuvettes standard. La loi de la bière peut être utilisée pour calculer la concentration de l’échantillon, si l’absorption est connue, ou une courbe d’étalonnage peut être utilisée.

L’UV-Vis est souvent appelé une technique générale, car la plupart des molécules absorbent la lumière dans la gamme de longueurs d’onde UV-visible. La gamme UV s’étend de 100 à 400 nm et le spectre visible de 400 à 700 nm. Cependant, la plupart des spectrophotomètres ne fonctionnent pas dans la gamme des UV profonds de 100 à 200 nm, car les sources lumineuses de cette gamme sont chères. La plupart des spectrophotomètres UV-Vis utilisent une lampe au deutérium pour la gamme UV, qui produit de la lumière de 170 à 375 nm, et une lampe à filament de tungstène pour la gamme visible, qui produit de la lumière de 350 à 2 500 nm.

Étant donné que la source lumineuse est généralement une lampe avec de larges gammes de longueurs d’onde, la longueur d’onde d’absorbance spécifique est sélectionnée à l’aide de filtres ou d’un monochromateur. Un monochromateur est un dispositif qui sépare les longueurs d’onde de la lumière dans l’espace, puis place une fente de sortie là où se trouve la longueur d’onde souhaitée de la lumière. Le monochromateur peut être balayé sur une gamme de longueurs d’onde pour fournir un spectre d’absorbance complet. Cela rend la technique utile pour quantifier et identifier un large éventail de molécules.

Maintenant que les bases de la spectroscopie UV-Vis ont été esquissées, jetons un coup d’œil à une expérience UV-Vis simple en laboratoire.

Avant de commencer la mesure, allumez le spectrophotomètre et laissez les lampes se réchauffer pendant une période de temps appropriée pour les stabiliser.

Préparez un blanc en remplissant une cuvette propre avec le solvant de l’échantillon, puis essuyez l’extérieur avec du papier non pelucheux pour éliminer les empreintes digitales.

Assurez-vous que la cuvette est correctement alignée avec tous les côtés rainurés en dehors du trajet du faisceau et insérez-la dans le spectrophotomètre. Fixez le couvercle pour empêcher la lumière ambiante de pénétrer dans le système.

Mesurez l’absorbance du blanc à une longueur d’onde ou sur une plage de longueurs d’onde. Enregistrer ou conserver l’absorbance, car elle doit être soustraite de l’absorbance de l’échantillon.

Ensuite, jetez le blanc et rincez deux fois la cuvette avec l’échantillon. Ensuite, remplissez la cuvette environ ? Complet avec échantillon. Essuyez à nouveau l’extérieur de la cuvette pour vous assurer qu’elle est propre et exempte d’empreintes digitales.

Placez la cuvette dans le spectrophotomètre dans le bon sens et fixez le couvercle.

Collectez une mesure d’absorbance ou un spectre à la même longueur d’onde ou à la même gamme de longueurs d’onde que le blanc. Soustrayez le spectre à blanc ou la mesure, si l’instrument ne le fait pas automatiquement.

À partir du spectre d’absorbance collecté, déterminez le maximum d’absorbance, ou ?max.

Pour quantifier la quantité d’analyte dans l’échantillon, créez une courbe d’étalonnage à l’aide d’une plage de concentrations d’analytes connues. Pour plus d’informations sur la construction et l’utilisation d’une courbe d’étalonnage, veuillez regarder la vidéo de cette collection « Courbes d’étalonnage ».

La mesure de l’absorbance peut également être utilisée pour calculer la cinétique de la réaction en mesurant l’augmentation ou la diminution de la concentration d’un composé tout au long de la réaction. Commencez par faire une première lecture de l’échantillon, colorant bleu dans ce cas, au maximum d’absorbance avant la réaction.

Ensuite, ajoutez rapidement le réactif, de l’eau de Javel dans ce cas, pour démarrer la réaction chimique. Remuez bien pour qu’il se mélange à l’échantillon.

Mesurez l’absorbance à son maximum dans le temps.

Le spectre d’absorbance initial de l’échantillon de colorant bleu est illustré. Les couleurs d’arrière-plan montrent les couleurs de la lumière dans le spectre visible. Le colorant bleu a une absorbance maximale à environ 630 nm.

La cinétique de la réaction entre le colorant bleu et l’eau de Javel a été mesurée au fil du temps. L’absorbance du colorant bleu diminue avec le temps, car il réagit avec l’eau de Javel. L’absorbance atteint près de zéro après 300 s, ce qui indique que la réaction est presque terminée. Pour plus d’informations sur la cinétique et les réactions, veuillez regarder la vidéo de JoVE Science Education « Lois du taux de réaction ».

La spectroscopie UV-Vis est largement utilisée dans de nombreux domaines de recherche différents pour identifier ou quantifier un échantillon.

Par exemple, la spectroscopie UV-Vis est largement utilisée dans les domaines biologiques pour quantifier la quantité de protéines dans un échantillon. Un test Bradford est souvent utilisé pour quantifier les protéines, à l’aide d’un colorant. Tout d’abord, une courbe d’étalonnage des concentrations connues en protéines est préparée, généralement à l’aide de l’albumine sérique bovine, ou BSA. Ensuite, le colorant bleu Coomassie est ajouté à chacun des étalons et à l’échantillon. L’absorbance du complexe protéine-colorant est ensuite mesurée à 595 nm.

Alternativement, les protéines peuvent être mesurées directement par leur absorbance à 280 nm. Dans cet exemple, la concentration en protéines est quantifiée à l’aide d’un spectrophotomètre à très faible volume. Pour de nombreuses protéines, une absorbance de 1 correspond à une concentration de 1 mg/mL.

La spectroscopie UV-Vis est également utilisée pour quantifier la quantité de cellules bactériennes dans une culture cellulaire. Pour cette mesure, l’absorbance, ou densité optique, est mesurée à 600 nm. En règle générale, une mesure de DO 600 de 1 indique la présence de 8 x 108 cellules bactériennes par ml. La mesure de la densité cellulaire tout au long de la croissance de la culture permet de déterminer la courbe de croissance bactérienne et peut aider à identifier quand une culture est dans sa phase de croissance exponentielle.

L’oxyde d’azote et le dioxyde d’azote, ou NOx, sont des sous-produits des gaz d’échappement des automobiles et peuvent être nocifs pour l’environnement car ils forment de l’ozone troposphérique nocif. Les NOx peuvent être mesurés en les faisant réagir avec une solution d’acide sulfanilique et de napthyl-éthylènediamine. La solution résultante est une molécule de colorant azoïque de couleur rose, dont l’intensité est directement corrélée à la concentration de NOx. Cette concentration peut ensuite être déterminée à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la spectroscopie UV-visible. Vous devez maintenant comprendre les bases du fonctionnement UV-Vis, comment mesurer un échantillon à l’aide d’un UV-Vis et comment corréler l’absorbance à la concentration de l’échantillon.

Merci d’avoir regardé !