Prélèvement d'échantillons de sang I

Le prélèvement sanguin est une exigence courante pour plusieurs études de recherche impliquant des souris et des rats. Le choix de la méthode de prélèvement sanguin chez ces animaux dépend de nombreux facteurs tels que le volume de sang nécessaire, la fréquence des prélèvements, l’état de santé de l’animal à saigner et le niveau de compétence du technicien.

Ici, nous passerons en revue ces considérations et décrirons les procédures de prélèvement sanguin, y compris l’hémorragie oculaire rétro-orbitaire, les coupures et les entailles de queue, ainsi que le prélèvement de sang intra-cardiaque. Pour d’autres méthodes, voir la deuxième vidéo de cette série.

Avant de nous plonger dans les protocoles de prélèvement sanguin, passons d’abord en revue quelques considérations générales, notamment le type d’échantillon, la sélection de l’aiguille et le volume sanguin maximal pouvant être collecté. Avant de prélever du sang sur une souris ou un rat, il faut déterminer le type d’échantillon de sang requis. Les procédures expérimentales pourraient nécessiter du sang total, du plasma ou du sérum.

En cas de prélèvement de sang total, un anticoagulant doit être ajouté à l’échantillon pour éviter la coagulation. Les anticoagulants couramment utilisés comprennent l’héparine, le citrate de sodium et l’acide éthylènediamine tétraacétique, abrégé en EDTA. Les anticoagulants peuvent être chargés directement dans la seringue pour recouvrir les surfaces. Cela permet le contact direct de l’anticoagulant lors du prélèvement sanguin, ce qui aide à prévenir la coagulation. Étant donné que le sang des rongeurs coagule rapidement, il est essentiel d’utiliser le bon rapport entre l’anticoagulant et le sang. La collecte de plasma nécessite la centrifugation de tout le sang AVEC un anticoagulant. Après le spin, le liquide translucide au-dessus du globule blanc et de la couche plaquettaire est le plasma. Il contient du fibrinogène et d’autres facteurs de coagulation. D’autre part, le sérum est prélevé à partir d’un échantillon de sang total SANS anticoagulants. Et parce que l’échantillon s’est coagulé, le sérum, qui est le meilleur joueur, ne contient pas de fibrinogène ou d’autres facteurs de coagulation.

Le choix de l’aiguille est basé sur la taille de l’animal et le site de la ponction veineuse. En général, les aiguilles de gros calibre causent moins de dommages aux cellules sanguines et permettent une collecte de sang plus rapide ; mais sont plus susceptibles de causer des dommages aux navires. La longueur de l’aiguille doit également être prise en compte. Si une aiguille est trop longue, elle peut être difficile à utiliser ou le sang peut commencer à coaguler alors qu’il est encore à l’intérieur de l’aiguille. Les choix de taille varient de calibre 18 à 29 et de 0,5 à 1,5 pouce de longueur. La taille d’aiguille appropriée pour chaque méthode sera abordée dans la section des procédures.

Enfin, en raison de la petite taille des rongeurs, il y a une quantité maximale de sang qui peut être collectée à partir d’une seule prise de sang, ce qui ne causera pas de dommages graves à l’organisme. Le prélèvement sanguin peut se faire sans ou avec remplacement liquidien - généralement effectué à l’aide d’une solution saline physiologique à 0,9 %. La limite supérieure dans chaque cas est indiquée dans le protocole texte ci-dessous. De plus, certaines expériences nécessitent la collecte de plusieurs échantillons et, dans de tels cas, avec le remplacement des liquides, l’animal aura besoin de temps entre les deux pour reconstituer les cellules sanguines. Encore une fois, il y a un montant maximum qui peut être collecté lors de la collecte en série, et les limites supérieures sont indiquées dans le protocole ci-dessous.

Après avoir passé en revue quelques considérations générales, passons aux techniques spécifiques de prélèvement sanguin, en commençant par le saignement rétro-orbitaire - une technique utilisée par les scientifiques pour collecter de petits volumes dans les vaisseaux proches de l’œil. Notez que la structure anatomique de la zone orbitaire est différente entre la souris et le rat. Les rats ont un plexus de vaisseaux qui coulent derrière l’œil, tandis que la souris a une collection de vaisseaux qui créent un sinus orbitaire rétro, ce qui facilite la réalisation de cette procédure chez la souris.

Commencez par saisir un tube pour le prélèvement sanguin. Les microtubes d’hématocrite d’une capacité de 50 à 75 microlitres sont préférés. Posez plusieurs serviettes en papier ou autres matériaux isolants sur la surface de travail. Il s’agit de maintenir la chaleur corporelle de l’animal pendant la procédure. Maintenant, anesthésez l’animal à l’aide d’un anesthésique par inhalation tel que l’isoflurane. Une fois que l’animal est complètement anesthésié, retirez-le de la chambre et placez-le sur son côté, c’est-à-dire en position couchée latérale. Ensuite, placez un doigt sur le dessus de la tête et le long de la ligne de la mâchoire et tirez la peau vers l’arrière et vers le bas pour induire la protrusion oculaire. Évitez d’appliquer une pression sur la trachée, car cela pourrait entraîner la mort par asphyxie. Par la suite, placez le tube de micro-hématocrite dans le canthus médial de l’œil et dirigez-le vers la caudale à un angle de 30 à 45 degrés par rapport au plan du nez. Appliquez une pression tout en tournant doucement le tube. Cela coupera les membranes conjonctivales et rompra le plexus oculaire ou le sinus. Le sang va s’écouler dans le tube d’hématocrite par capillarité. Évitez de pousser le tube si profondément que vous heurtez l’os à l’arrière de la cavité oculaire. Une fois que le sang commence à circuler, maintenez la pression pour garder l’œil saillant. Pour arrêter le saignement, relâchez la peau et laissez l’œil revenir à la position normale. Appliquez une pression pour favoriser l’hémostase. Pour un prélèvement répété d’échantillons, prévoyez un minimum de 10 jours entre les saignements. Cela donne aux tissus un peu de temps pour guérir.

Bien que l’hémorragie rétroorbitaire soit une procédure courante, son caractère humain suscite de nombreuses inquiétudes. Ceux-ci incluent un gonflement dû à un mouvement excessif du tube d’hématocrite. Cela peut à son tour provoquer la saillie du globe oculaire et empêcher la fermeture de la paupière, entraînant un dessèchement, des dommages et des douleurs à la cornée, ce qui peut déclencher des grattages et des automutilations. Un mauvais placement du tube d’hématocrite peut sectionner le nerf optique, entraînant la cécité. Une autre complication possible est que l’œil peut être forcé hors de l’orbite, ce qui permet aux paupières de tomber derrière le globe oculaire. De plus, des problèmes peuvent survenir à partir de la fracturation des os fragiles de l’orbite, de la pénétration du globe oculaire entraînant la perte de l’humeur vitrée ou de la formation d’un hématome derrière l’œil qui peut entraîner une douleur extrême. Malgré toutes ces préoccupations, si un technicien qualifié effectue la procédure et que l’animal est complètement anesthésié, le saignement rétro-orbitaire est une méthode efficace de collecte de sang chez les rongeurs.

Passons maintenant en revue les considérations et les procédures relatives au saignement de la queue, qui permet de collecter des échantillons en série de petits volumes. L’équipement nécessaire à cette procédure comprend un scalpel stérile numéro 11. Les ciseaux ne doivent pas être utilisés car la coupe faite par les ciseaux est écrasante, ce qui peut favoriser la coagulation et réduire le flux sanguin. D’autres instruments sont un tube de contention qui permet d’accéder à la queue de l’animal ; essuie-tout absorbant ; Tubes de prélèvement ou d’hématocrite et poudre styptique - pour aider à l’hémostase.

Commencez par fixer l’animal dans le tube de contention. Ensuite, essuyez la queue avec de l’eau tiède pour enlever les débris et provoquer une légère vasodilatation. N’utilisez PAS d’eau chaude. Étendez la queue et, à l’aide de la lame du scalpel, coupez l’extrémité de la queue pour recueillir le sang à l’aide d’hématocrite ou de tubes de prélèvement. La queue peut être caressée ou « traite » de la croupe à la pointe pour favoriser la circulation sanguine. Cela diminuera toutefois la qualité de l’échantillon.

Pour arrêter le saignement, appliquez une pression sur l’extrémité de la queue avec un tampon de gaze. La poudre styptique peut être utilisée pour obtenir l’hémostase. Vérifiez les animaux toutes les 5 à 10 minutes pour vous assurer que l’hémostase a été atteinte, ce qui peut être retardé après des prélèvements répétés. L’échantillon prélevé à partir d’une coupe de queue peut contenir à la fois du sang artériel et veineux, ainsi qu’une contamination des produits tissulaires. Cependant, cette procédure de prélèvement sanguin permet des prélèvements en série en perturbant la croûte ou le caillot de la coupure d’origine à l’extrémité de la queue.

Une méthode alternative de collecte de sang à une coupe de queue est l’entaille du vaisseau caudal, qui est relativement moins invasive. Pour cela, à l’aide de la même lame de scalpel, faites une petite incision directement sur la veine latérale de la queue, à environ deux tiers de la distance de la croupe. Comme pour les cisailles à queue, le sang peut être recueilli dans des tubes de collecte ou d’hématocrite. Et il est impératif d’assurer l’hémostase en appliquant une pression sur le site et en revérifiant l’animal toutes les 5 à 10 minutes. Cependant, comme pour la coupe de la queue, les échantillons peuvent être contaminés par des produits tissulaires.

Souvent, des études nécessitent un grand échantillon de sang de non-survie, ce qui est accompli par exsanguination via une hémorragie intra-cardiaque ou la veine cave caudale.

Pour la méthode intra-cardiaque chez la souris, vous avez besoin d’une seringue de 3 cc avec une aiguille de calibre 22 -25 de 1 pouce. Et pour les rats, une seringue de 10-12 cc avec une aiguille de calibre 18 de 1,5 pouces est préférée. Consultez le protocole ci-dessous pour comprendre pourquoi ces besoins et ces seringues sont idéaux.

Commencez par euthanasier l’animal à l’aide de dioxyde de carbone. Après l’euthanasie, tenez le rongeur par la peau avec le corps suspendu verticalement. Cette restriction est essentielle car le corps doit être droit pour éviter la déviation du cœur ou une torsion de la poitrine. Notez que le cœur est situé approximativement au niveau du coude. Le côté d’insertion se trouve dans l’encoche juste à gauche de la xiphoïde, parallèlement à la colonne vertébrale et sous les côtes.

Insérez l’aiguille, biseautez vers le haut, dans la poitrine et percez le cœur. Appliquez une légère contre-pression avec la seringue. Si l’aiguille est dans le cœur, le sang coulera dans la seringue. Attendez que le sang ait rempli le canon avant d’ajouter une contre-pression supplémentaire. Environ la moitié du volume sanguin total peut être prélevée sur une souris ou un rat par ponction cardiaque. Cela équivaut à environ 1 ml de sang d’une souris moyenne et à environ 10 ml de sang d’un rat moyen

Une autre position est le décubitus dorsal lors de l’utilisation de l’approche latérale. Dans ce cas, placez l’aiguille entre les côtes du côté gauche de l’animal. Le point d’entrée est mesuré par rapport à la pointe du coude sur la paroi thoracique. Insérez l’aiguille, biseautez vers le haut, perpendiculairement au plan de la table en un point à mi-chemin de la paroi thoracique. Appliquez une légère contre-pression avec la seringue. Si l’aiguille est dans le cœur, le sang s’écoulera dans la seringue. Encore une fois, attendez que le sang ait rempli le canon avant d’ajouter une contre-pression supplémentaire. Notez que dans les deux positions, une contre-pression excessive peut faire s’effondrer le cœur, obstruant le biseau de l’aiguille et arrêtant le flux sanguin dans la seringue.

Une autre méthode de collecte de sang cardiaque consiste à travers la veine cave caudale. L’équipement nécessaire pour cette procédure est une seringue appropriée avec une aiguille de la bonne taille attachée ; ciseaux pour ouvrir la cavité abdominale, petite pince à pouce atraumatique et éponge de gaze. Cette technique nécessite que l’animal soit profondément anesthésié et maintenu sous anesthésie tout au long de la procédure. La narcose au CO2 n’est pas une option, car le cœur de l’animal doit battre pour cette procédure. Placez l’animal en position couchée dorsale et fixez les membres à la plate-forme. Les membres doivent être éloignés du corps.

Maintenant, soulevez la peau avec des pinces et utilisez des ciseaux pour faire une petite coupe transversale à travers la peau juste au-dessus du bassin chez les femmes ou du prépuce chez les hommes. Ensuite, placez la pointe des ciseaux dans la coupe et faites une incision médiane à travers la peau du bassin ou du prépuce jusqu’au xiphoïde. Avec la peau réfléchie latéralement, soulevez le muscle et faites une petite coupe transversale à travers le muscle, juste au-dessus de la peau coupée.

Placez la pointe des ciseaux dans l’abdomen et faites une incision médiane à travers le muscle jusqu’au xiphoïde. Assurez-vous d’incliner la pointe des ciseaux vers le haut pour éviter de couper des organes. Couper transversalement le long de la courbe des côtes de chaque côté. Attention à ne pas percer le foie. Déplacez doucement les intestins vers la gauche de l’animal pour exposer la veine cave postérieure. Placez un tampon de gaze sur le foie et posez votre index et votre majeur dessus. Avec votre autre main, insérez l’aiguille, biseautez vers le haut dans la veine cave, à mi-chemin entre la jonction des vaisseaux rénaux et la bifurcation iliaque. Prélevez lentement le sang tout en exerçant une pression sur le foie.

Évitez de bouger les mains, car cela pourrait provoquer la rupture du récipient. De plus, un prélèvement sanguin trop rapide peut provoquer l’affaissement du vaisseau sur le biseau, obstruant l’ouverture et empêchant la collecte de sang. Le principal avantage de cette technique est la possibilité de prélever un échantillon stérile car l’aiguille ne traverse pas la peau.

Enfin, examinons quelques applications de ces techniques de prélèvement sanguin. L’immuno-oncologie est un domaine émergent, et les chercheurs dans ce domaine effectuent souvent des prélèvements sanguins pour étudier les cellules immunitaires à différents stades du développement du cancer. Par exemple, les chercheurs ont prélevé du sang cardiaque de souris cancéreuses pour isoler et quantifier les neutrophiles dix, vingt et trente jours après la greffe de tumeur.

D’autre part, la composition du sang est également fréquemment étudiée par les physiologistes. Comme dans cette étude, les chercheurs se sont intéressés à l’évaluation de la fonction rénale chez les animaux diabétiques. Pour ce faire, ces scientifiques ont d’abord injecté un colorant dans un modèle animal de diabète. Ensuite, ils ont utilisé la méthode de la coupe de la queue pour collecter du sang à plusieurs moments afin d’évaluer la concentration de colorant dans le sang, qui a finalement été utilisée pour calculer le taux de filtration glomérulaire qui a mis en évidence la différence dans la fonction rénale après l’induction du diabète.

Enfin, les chercheurs sur les cellules souches utilisent des échantillons de sang pour évaluer le succès de l’incorporation des cellules du donneur dans le système du receveur. Ici, les chercheurs ont d’abord transplanté des cellules de moelle osseuse d’une souris mâle dans un animal femelle de type sauvage et génétiquement modifié par injection de veine de queue. Ensuite, ils ont prélevé du sang dans le sinus rétro-orbitaire de la souris receveuse pour étudier l’ADN génomique des cellules sanguines à l’aide de la réaction en chaîne par polymérase. Cela a fourni le pourcentage de greffes de cellules de donneur chez les deux types d’animaux.

Vous venez de regarder le premier épisode de JoVE sur les techniques de prélèvement sanguin. Veuillez consulter la prochaine vidéo de la série pour voir comment effectuer d’autres techniques couramment utilisées de collecte de sang chez les animaux de laboratoire. Comme toujours, merci d’avoir regardé !