Prélèvement d'échantillons de sang II

La collecte de sang de souris et de rats est nécessaire pour une grande variété d’études scientifiques, et les chercheurs ont développé différentes méthodes pour atteindre des objectifs expérimentaux spécifiques.

Dans le premier épisode, nous avons discuté de la considération générale du prélèvement sanguin et avons examiné l’hémorragie oculaire rétro-orbitale, les coupures et les entailles de queue, ainsi que les méthodes de prélèvement de sang intra-cardiaque. Ici, nous décrirons les procédures de prélèvement de sang dans les veines faciales, sous-mandibulaires, saphènes et fémorales. Ces méthodes sont moins invasives et ne nécessitent pas d’anesthésie, ce qui en fait des méthodes de choix lorsque l’utilisation d’anesthésiques peut fausser les résultats sanguins ou d’autres données.

Commençons par la procédure d’obtention d’un échantillon de sang à partir d’une veine faciale murine. Sur la souris, il y a une veine faciale facilement accessible qui traverse la joue. Commencez par choisir l’équipement approprié pour la procédure. Fondamentalement, vous avez besoin d’un petit tube à centrifuger pour le prélèvement sanguin et d’une lancette, qui est disponible en différentes tailles. Le choix de la bonne lancette dépend de l’âge, du sexe et du poids corporel de l’animal ainsi que de la taille de l’échantillon à collecter. Voir le protocole textuel pour plus de détails sur la sélection des lancets.

Commencez la procédure en immobilisant l’animal à l’aide de la technique de grattage. Une contention adéquate minimise les mouvements latéraux de la tête et aide à assurer une ponction veineuse précise et sûre avec la lancette. Si la prise est trop serrée, le flux sanguin peut être restreint, ce qui entraîne une réduction du volume collecté. Une fois l’animal immobilisé, localisez la zone approximative de la veine faciale en mesurant la longueur de l’œil sous le canthus latéral et la largeur de l’œil caudalement. Avec la pointe de la lancette, tâtez doucement le point où se termine l’os de la mâchoire. Pour une meilleure précision dans la perforation du vaisseau, vous pouvez positionner la souris sur son côté.

Maintenant, au site d’insertion, tenez la lancette perpendiculairement à la surface de la peau avec la pointe légèrement tournée vers le nez. Ceci est essentiel, car si la pointe de la lancette est dirigée vers la queue, le conduit auditif sera percé, provoquant des saignements de l’oreille. Pour percer la veine, appliquez une poussée ferme et percez la peau jusqu’à l’épaulement de la lancette. Une fois retiré, le sang commencera à couler. Pour faciliter l’écoulement, positionnez l’animal avec la tête plus basse que le cœur. Pour arrêter le saignement, épongez le site de ponction pour obtenir l’hémostase et prévenir une perte de sang excessive. Enfin, relâchez la pression sur la peau et remettez l’animal dans sa cage. Notez que les volumes de collecte varient, mais il est impératif de NE PAS dépasser le volume maximal pour la collecte de sang de survie. Voir le protocole textuel de la vidéo Blood Withdrawal One pour plus de détails sur le volume maximal recommandé de prélèvement. Des échantillons en série peuvent être prélevés en alternant le côté utilisé. Aucun des deux côtés ne doit être utilisé plus de 5 à 7 jours.

Passons maintenant en revue la méthode de saignement de la veine sous-mandibulaire. Bien que cela soit très similaire à la technique du saignement des veines faciales, il existe des variations dans l’équipement et des différences subtiles dans la procédure de saignement.

La veine sous-mandibulaire longe la mâchoire inférieure de la souris et converge avec la veine faciale dans la veine jugulaire. Au lieu d’une lancette, cette méthode est réalisée à l’aide d’aiguilles. Mais comme pour les lancettes, le choix de la jauge de l’aiguille dépend de l’âge, du sexe, du poids de l’animal et de la taille de l’échantillon - voir le protocole de texte pour plus de détails.

Pour commencer, ébouriffez l’animal de la même manière que pour le saignement des veines faciales afin qu’il y ait un minimum de mouvement latéral de la tête. Rappel - une prise trop serrée peut diminuer le volume de collecte de sang. Tout en retenant la souris, imaginez une ligne du coin de la bouche à travers le visage et une ligne du canthus latéral de l’œil. Le point d’intersection de ces lignes est l’aire approximative de la veine sous-mandibulaire. Cela coïncide avec une petite fossette glabre située caudale au coin de la bouche et légèrement en dessous de la ligne de la mâchoire.

Pour une meilleure précision, placez l’animal en position couchée latérale (3.6.1). Ensuite, tenez l’aiguille perpendiculairement à la surface de la peau et insérez-la avec une poussée ferme. N’insérez PAS l’aiguille au-delà de la pointe du biseau, car une profondeur d’insertion supérieure à cela peut entraîner des traumatismes aux muscles, nerfs et autres vaisseaux qui se trouvent dans la tête, le cou et la cavité buccale. Une fois l’aiguille retirée, le sang commencera à couler. Comme pour le saignement des veines faciales, positionnez la souris avec la tête plus basse que le cœur pour aider à la circulation sanguine. Enfin, épongez le site de ponction pour obtenir l’hémostase et relâchez la pression sur la peau pour ramener l’animal dans sa cage.

Maintenant, apprenons comment prélever du sang dans la veine saphène. Cette veine est un vaisseau superficiel qui traverse dorsalement puis latéralement l’articulation tarsienne.

L’équipement dont vous avez besoin pour cette procédure comprend un dispositif de retenue, qui peut être un dispositif en plastique flexible pour les rats ou, pour les souris, un tube conique en plastique modifié de 50 millilitres peut être utilisé. Notez que l’extrémité du tube est coupée pour permettre un trou de respiration, et qu’une fente d’un demi-pouce de large et de 2 pouces de long est découpée à partir de l’extrémité du capuchon. Les bords sont recouverts de ruban adhésif pour la sécurité de l’animal. Cette procédure nécessite également un garrot - fabriqué à l’aide d’une seringue de 3 cc et d’une longueur de suture non résorbable de 0 à 2, d’une pommade antibiotique triple avec un écouvillon - à utiliser comme barrière anti-humidité entre la peau et la gouttelette de sang, une tondeuse à cheveux, une aiguille de calibre 22 pour la ponction veineuse et un tube d’hématocrite pour le prélèvement de sang.

Pour retenir une souris, placez-la dans le tube, le nez en premier. Ensuite, guidez doucement la patte arrière dans la fente et stabilisez-la à l’aide de l’index et du pouce. Par la suite, rasez les poils de la face latérale de la jambe, du jarret au grasset. Ensuite, étalez une très fine couche de la pommade antibiotique triple sur la zone glabre. Ensuite, appliquez le garrot aussi loin que possible vers le crâne et serrez-le. Le vaisseau saphène qui traverse la surface externe du genou à la cheville commencera à se remplir et deviendra surélevé et facile à visualiser.

Ensuite, tenez une aiguille de calibre 22 directement sur le vaisseau sanguin et perpendiculairement à la surface de la peau. Et percez le vaisseau en faisant attention de ne pas insérer l’aiguille trop profondément et de percer le muscle ou l’os. Le sang perlera à la surface de la jambe pour être recueilli dans un tube d’hématocrite. Une fois que le sang a été prélevé, desserrez le garrot et appliquez une pression sur la ponction pour l’hémostase. Une fois que le saignement a cessé, retirez l’animal de la contention et remettez-le dans sa cage. Les volumes collectés avec cette méthode sont compris entre 10 et 150 ? L, en fonction de la fréquence d’échantillonnage. Et la qualité de l’échantillon est variable, car il peut contenir des produits tissulaires. Pas plus de 4 échantillons de sang ne doivent être prélevés dans une période de 24 heures sur la même jambe.

Enfin, nous allons apprendre comment prélever du sang dans la veine fémorale, ce qui est une autre option pour la collecte de sang sur un rat. La veine fémorale s’étend sur la face médiale de la patte arrière de l’aine à l’articulation du genou avant de traverser le genou et de devenir la veine saphène latérale, la rendant facilement accessible.

L’avantage du saignement de la veine fémorale est qu’un volume plus important est plus facilement collecté que de la veine saphène. L’inconvénient est que cette procédure, chez un animal conscient, nécessite deux personnes. L’équipement nécessaire pour cette procédure est similaire à la méthode de la veine saphène, sauf qu’il ne nécessite pas de garrot et que le dispositif de contention préférable est un cône flexible. Pour sélectionner le bon cône, mesurez-le par rapport à la longueur du corps de l’animal, puis faites un trou ovale coupé au niveau de la cuisse.

Pour retenir l’animal, placez-le dans le tube, le nez en premier. Ensuite, pliez l’extrémité du cône et fermez-le à l’aide d’une petite pince à reliure pour empêcher l’animal de sortir. Tirez maintenant la patte arrière à travers l’ouverture ovale pour accéder à la veine fémorale. Ne serrez pas trop fort car cela pourrait exacerber la formation d’hématomes. Ensuite, rasez la surface interne de la jambe, de l’aine au genou, et appliquez une fine couche de pommade antibiotique triple sur la zone glabre. Par la suite, la personne qui doit immobiliser doit obstruer la veine fémorale et saisir le rat avec la surface interne de la jambe face à la personne qui va prélever du sang. En tenant l’aiguille de calibre 22 perpendiculairement au vaisseau sanguin, percez directement la veine et recueillez le sang dans des tubes d’hématocrite pendant qu’il perle à la surface de la peau. La ponction doit être aussi près que possible du genou pour permettre un échantillonnage futur à l’avant de ce site. Assurez-vous également que la profondeur de la perforation n’est pas plus profonde que la longueur du biseau de l’aiguille. Pour faciliter la circulation sanguine, positionnez le rat avec la jambe plus basse que le cœur. Enfin, relâchez la pression sur la jambe et appliquez une pression sur le site de ponction pour obtenir l’hémostase et prévenir une perte de sang excessive. Notez que beaucoup plus de sang peut être prélevé à l’aide de cette procédure.

Après avoir discuté des bases des techniques de prélèvement sanguin, passons en revue quelques exemples de raisons pour lesquelles ces procédures peuvent être utiles pour la recherche scientifique

Le sang est souvent analysé pour confirmer la réponse immunitaire lors du développement d’un vaccin. Ici, les chercheurs ont administré un vaccin peptidique à des animaux atteints d’un cancer de la vessie. Ensuite, ils ont prélevé du sang via la veine sous-mandibulaire et séparé le sérum pour détecter les niveaux de différentes cytokines, qui servent d’indicateurs de l’efficacité du vaccin.

Le prélèvement sanguin est également couramment effectué pour tester l’efficacité d’un traitement en étudiant les biomarqueurs de la maladie humaine, comme le taux de glucose dans le diabète. Ces chercheurs souhaitaient tester l’efficacité d’une nouvelle thérapie génique administrée par la veine de la queue chez des animaux diabétiques. Après l’injection, ces chercheurs ont prélevé du sang dans la veine saphène à plusieurs moments pour analyser l’effet de différents protocoles de traitement sur la glycémie.

Enfin, pour certaines expériences, il est important de connaître l’état de base de l’animal, comme les niveaux d’inflammation ou de stress. Dans cet exemple, le plasma sanguin a été prélevé sur un rat avant et après un événement stressant. Et comme vous pouvez le constater, le taux de corticostérone, ou hormone du stress, est plus élevé chez les animaux dix minutes après l’événement stressant.

Vous venez de regarder le deuxième épisode de JoVE sur les techniques de prélèvement sanguin pour les souris et les rats. Après avoir regardé ces deux vidéos, vous devriez avoir une meilleure compréhension des considérations et des procédures de prélèvement de sang sur ces animaux et de la façon dont ils sont utilisés dans la recherche biomédicale aujourd’hui. Comme toujours, merci d’avoir regardé !