Name: Préparation des suspensions unicellulaires à partir de rate de souris avec le dissociateur gentleMACS (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Apprenez à préparer des suspensions unicellulaires à partir de rate de souris avec le dissociateur gentleMACS. Cette méthode automatisée produit des cellules viables pour l'analyse en cytométrie en flux.

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Introduction à l&#39;équipement <ol><li> Le tissu est légèrement dissocié, en utilisant le violet Tubes C dans viables unicellulaires suspensions. </li><li> Le tampon PBS / BSA EDTA est utilisé pour dissocier les cellules. Le tampon est préparé en ajoutant une partie de la solution stock de BSA à 20 parties de solution de rinçage autoMACS contenant de l&#39;EDTA. </li><li> Le MACS Pré-Séparation filtres sont utilisés pour que les échantillons de tissus dissociés sont libres de tous les amas cellulaires, la promotion réussie de séparation MACS et l&#39;analyse subséquente. </li></ol> Dissocier les cellules de la rate <ol><li> Rate entiers sont disscociated dans une seule cellule de suspensions de splénocytes utilisant le dissociateur gentleMACS. </li><li> Pour commencer la procédure, la charge du tube C avec un volume de tampon en fonction de la masse de la rate. Une rate saine d&#39;un adulte jeune femelle souris BALB / c pèse environ 80-120 mg. Aux 1 à 2 rates de cette masse besoin de 3 mL de tampon. Rates provenant d&#39;animaux âgés ou des animaux atteints d&#39;infections sont souvent plus grandes et doit être pesé dans la mémoire tampon. Les volumes de tampon doit être modulée en conséquence. Ne pas dépasser un volume tampon total de 10 ml. </li><li> Ajouter la rate disséqués pour le tube C contenant 3 ml de tampon. </li><li> Assurez-vous que le bouchon du tube C est serré et fixer le tube C de la dissociateur avec le bouchon vers le bas. </li><li> Mettez le dissociateur. Pour 1-2 rate, sélectionnez m_spleen_01 programme. Le programme va prendre 56 secondes pour terminer. Si le nombre des rates est supérieure, l&#39;utilisation du programme m_spleen_04, ce programme peut être utilisé pour un maximum de 720 mg de tissu splénique. </li><li> Après l&#39;achèvement du programme du tissu splénique natif est dissocié en une suspension de splénocytes. </li><li> Isoler la suspension de cellules entières au 300xg à température ambiante pendant environ 30 secondes. Cela garantira que le rotor et le stator sont libérés de toutes les cellules qui sont recueillis au fond du tube C. </li><li> Retirer l&#39;échantillon à travers le septum étanche ouverture dans le capuchon du tube C en utilisant un pipetteur 1000 microlitre. </li></ol> Étape de filtration <ol><li> Pour commencer l&#39;étape de filtration, appliquer le tissu dissocié de la pré-filtre de séparation ou une passoire cellule avec 30 um de taille des pores. Le tamis doit s&#39;adapter à un tube de 15 ml pendant 1-2 rate ou un tube de 50 ml pendant plus de 2 rates. </li><li> Laissez la suspension cellulaire passer à travers. Puis laver le filtre en appliquant 5 ml de tampon. </li><li> Maintenant, centrifuger le tube avec la suspension cellulaire à 300xg, à température ambiante pendant 10 minutes pour recueillir toutes les splénocytes dans une cellule de la rate à granulés. </li><li> Maintenant, que nous avons une pastille de splénocytes dissociés, nous devons aspirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans une quantité appropriée de mémoire tampon. </li></ol> La dissociation rate utilisant le dissociateur gentleMACS donnera un pourcentage élevé de splénocytes viable, ce qui est démontré par cytométrie en flux à l&#39;aide de l&#39;analyseur MACSQuant. Les cellules mortes sont colorées par de l&#39;iodure de propidium. Dans l&#39;exemple fourni, l&#39;intrigue avant du côté de dispersion point indique les splénocytes préparé.

Tous les protocoles et fiches techniques sont disponibles à<a href="http://www.miltenyibiotec.com"&gt; Http://www.miltenyibiotec.com.</a&gt;.

Pour éviter de dissociations manuel fastidieux et souvent douloureux, le dissociateur gentleMACS permet de dissocier les tissus de manière très efficace dans des conditions contrôlées et reproductibles. La procédure de dissociation des tissus est doux pour les cellules et les suspensions rendements cellulaires avec un taux de viabilité élevés. Le dissociateur gentleMACS en combinaison avec le C Tubes est conçu pour la préparation des suspensions unicellulaires à partir de différents tissus. L&#39;instrument est équipé d&#39;un certain nombre de programmes préréglés pour dissocier la rate de souris, le foie, les poumons ou les tissus nerveux. L&#39;éventail des programmes et des protocoles sera continuellement élargi pour inclure d&#39;autres tissus.

<table><tbody><tr><td>Kit de démarrage gentleMACS&amp;#8482;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tubes de 13 mL</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-596</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Solution de rinçage autoMACS&amp;#8482;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Solution mère de BSA MACS&amp;#174;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Filtres de pré-séparation</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Analyseur MACSQuant</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-197</td><td></td></tr><tr><td>Solution d'iodure de propidium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

préparation des suspensions unicellulaires à partir de rate de souris avec le dissociateur gentlemacs

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Une seule cellule suspensions sont un préalable pour des expériences dans la séparation des cellules, l&#39;analyse cellulaire et culture cellulaire. Pour éviter de dissociations manuel fastidieux et souvent douloureux de la dissociateur gentleMACS permet de dissocier les tissus de manière très efficace dans des conditions contrôlées et reproductibles. Le dissociateur gentleMACS peut dissocier de manière optimale la rate de souris, combinant un gain de temps et de normalisation par l&#39;utilisateur de sécurité. Cette vidéo décrit comment dissocier les rates de souris en utilisant le dissociateur gentleMACS, un système automatisé de paillasse dispositif qui peut perturber la mécanique des tissus en utilisant des tubes spéciaux pour produire des suspensions de cellules viables. Suite à la dissociation, les rates sont filtré, centrifugé et resuspendu pour d&#39;autres applications.

Cette vidéo décrit un simple gain de temps technique pour la dissociation des tissus automatisée en utilisant les dissociateur gentleMACS pour préparer une seule cellule de suspensions de splénocytes de souris.

Préparation des suspensions unicellulaires à partir de rate de souris avec le dissociateur gentleMACS

Les suspensions de cellules uniques sont un prérequis pour les expériences de séparation, d'analyse et de culture cellulaires. Afin d'éviter les manipulations manuelles fastidieuses et souvent pénibles...

Dans ce protocole vidéo, vous verrez comment dissocier des rates de souris à l'aide du Gentle Max, un dispositif automatisé de paillasse capable de rompre mécaniquement les tissus à l'aide de tubes spéciaux afin d'obtenir des suspensions cellulaires viables. Après la dissociation, les rates sont filtrées à l'aide de filtres de séparation Max Pres, centrifugées puis mises en suspension pour des applications ultérieures. Bonjour, je m'appelle Melanie mlu.Je suis scientifique chez Milton Biotech, situé dans le parc BE Lab, en Allemagne. Aujourd'hui, je vais vous montrer la préparation d'une suspension de cellules uniques à partir de la rate de souris en utilisant la dissociation GenX. La dissociation GenX permet une préparation très simple et rapide d'une suspension de cellules uniques.Commençons. Pour éviter les dissociations manuelles fastidieuses et souvent douloureuses, le dissociateur max di doux permet de dissocier les tissus de manière très efficace dans des conditions contrôlées et reproductibles. Les tissus sont dissociés délicatement à l’aide de tubes violets C en suspensions viables de cellules individuelles.Le tube C comporte un orifice scellé par un septum au centre du bouchon, permettant de pipeter à partir du tube tout en maintenant en permanence l'asepsie. Pour mettre en suspension les cellules dissociées, vous devrez utiliser le tampon P-B-S-B-S-A-E-D-T-A approprié. Ce tampon est préparé en ajoutant une partie de solution mère de BSA à 20 parties de solution de trempage AutoMax contenant de l'EDTA.À l'aide des filtres de séparation Max Pres, les échantillons de tissus sont libérés de tous les agrégats cellulaires, favorisant ainsi une séparation maximale réussie et les analyses ultérieures. Pour commencer la procédure, nous chargeons le tube C avec un volume de tampon. Selon la masse des splènes, un spleen sain d'une souris femelle de biopsie âgée de six à sept semaines pèse environ 80 à 120 milligrammes.Chaque rate ou deux de cette masse nécessite trois millilitres de tampon. Ne pas dépasser un volume total de 10 millilitres. Nous pouvons maintenant ajouter notre rate disséquée dans le tube C contenant trois millilitres de tampon. Les rates provenant d'animaux âgés ou d'animaux infectés sont souvent plus grosses et doivent être pesées dans le tampon.Les volumes de tampon doivent ensuite être ajustés en conséquence, mais ne doivent pas dépasser un volume total de 10 millilitres. Vérifiez à présent que le bouchon du tube C est bien serré et fixez le tube C au dissociateur. Avec le bouchon orienté vers le bas, mettez le dissociateur sous tension pour un à deux spléens en sélectionnant le programme M spleen oh un. Le programme prendra 56 secondes pour s’achever ; si le nombre de spléens est supérieur, utilisez le programme M spleen oh quatre.Ce programme peut être utilisé pour un maximum de 720 milligrammes de tissu splénique. Une fois le programme terminé, le tissu splénique natif est dissocié en une suspension de cytes PLE, qui ressemble à ceci centrifuger brièvement pour rassembler l'échantillon au fond du tube. Cela garantira que le rotor et le stator sont libérés de toutes les cellules qui s'accumulent au fond du tube C.Nous prélevons l'échantillon à travers l'ouverture scellée par un septum dans le bouchon du tube C à l'aide d'une pipette de mille microlitres. Pour commencer l'étape de filtration, nous appliquons le tissu dissocié sur un filtre de préséparation ou sur une passoire munie de pores de 30 microns. La passoire doit s'adapter à un tube de 15 millilitres pour un ou deux spléens, ou à un tube de 50 millilitres pour plus de deux spléens.Laisser passer la suspension cellulaire, puis laver le filtre en appliquant cinq millilitres de tampon. Centrifuger maintenant le tube contenant la suspension cellulaire à 300 Gs et à température ambiante pendant 10 minutes afin de regrouper toutes les cytes en un culot cellulaire de rate. Maintenant que nous avons un culot de cytes dissociées, il faut aspirer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans une quantité appropriée de tampon de dissociation de la rate.L'utilisation du max doux permettra d'obtenir un pourcentage élevé de cytes PLE viables, ce qui est démontré par cytométrie en flux à l'aide du quant max. Les cellules mortes sont marquées par l'iodure de propidium et l'exemple fourni. Le diagramme de dispersion avant latéral montre des cytes SP préparés. D'accord.J'ai montré comment dissocier le tissu splénique en utilisant cette dissociation douce X. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important d'ajuster la quantité de tampon à la taille de l'échantillon et de choisir le bon programme Gentle X. Voilà, c'est terminé.Bonne chance avec votre expérience.

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Préparation standardisée des suspensions unicellulaires provenant de tissus pulmonaires de la souris en utilisant les dissociateur gentleMACS

Dissocier les cellules de différents types de tissus spécifiques requiert des paramètres spécifiques pour aggitation tissus pour obtenir un volume élevé de viabilité, de cellules cultivables. Le Miltenyi gentleMACS dissociateur optimise cette tâche avec un simple, protocole pratique. Dans cette publication, l'utilisation de cet appareil sur le tissu nerual est expliqué.

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