Préparation des suspensions unicellulaires à partir de rate de souris avec le dissociateur gentleMACS
11 décembre 2008
Cette vidéo décrit un simple gain de temps technique pour la dissociation des tissus automatisée en utilisant les dissociateur gentleMACS pour préparer une seule cellule de suspensions de splénocytes de souris.
Dans ce protocole vidéo, vous verrez comment dissocier des rates de souris à l'aide du Gentle Max, un dispositif automatisé de paillasse capable de rompre mécaniquement les tissus à l'aide de tubes spéciaux afin d'obtenir des suspensions cellulaires viables. Après la dissociation, les rates sont filtrées à l'aide de filtres de séparation Max Pres, centrifugées puis mises en suspension pour des applications ultérieures. Bonjour, je m'appelle Melanie mlu.
Je suis scientifique chez Milton Biotech, situé dans le parc BE Lab, en Allemagne. Aujourd'hui, je vais vous montrer la préparation d'une suspension de cellules uniques à partir de la rate de souris en utilisant la dissociation GenX. La dissociation GenX permet une préparation très simple et rapide d'une suspension de cellules uniques.
Commençons. Pour éviter les dissociations manuelles fastidieuses et souvent douloureuses, le dissociateur max di doux permet de dissocier les tissus de manière très efficace dans des conditions contrôlées et reproductibles. Les tissus sont dissociés délicatement à l’aide de tubes violets C en suspensions viables de cellules individuelles.
Le tube C comporte un orifice scellé par un septum au centre du bouchon, permettant de pipeter à partir du tube tout en maintenant en permanence l'asepsie. Pour mettre en suspension les cellules dissociées, vous devrez utiliser le tampon P-B-S-B-S-A-E-D-T-A approprié. Ce tampon est préparé en ajoutant une partie de solution mère de BSA à 20 parties de solution de trempage AutoMax contenant de l'EDTA.
À l'aide des filtres de séparation Max Pres, les échantillons de tissus sont libérés de tous les agrégats cellulaires, favorisant ainsi une séparation maximale réussie et les analyses ultérieures. Pour commencer la procédure, nous chargeons le tube C avec un volume de tampon. Selon la masse des splènes, un spleen sain d'une souris femelle de biopsie âgée de six à sept semaines pèse environ 80 à 120 milligrammes.
Chaque rate ou deux de cette masse nécessite trois millilitres de tampon. Ne pas dépasser un volume total de 10 millilitres. Nous pouvons maintenant ajouter notre rate disséquée dans le tube C contenant trois millilitres de tampon. Les rates provenant d'animaux âgés ou d'animaux infectés sont souvent plus grosses et doivent être pesées dans le tampon.
Les volumes de tampon doivent ensuite être ajustés en conséquence, mais ne doivent pas dépasser un volume total de 10 millilitres. Vérifiez à présent que le bouchon du tube C est bien serré et fixez le tube C au dissociateur. Avec le bouchon orienté vers le bas, mettez le dissociateur sous tension pour un à deux spléens en sélectionnant le programme M spleen oh un. Le programme prendra 56 secondes pour s’achever ; si le nombre de spléens est supérieur, utilisez le programme M spleen oh quatre.
Ce programme peut être utilisé pour un maximum de 720 milligrammes de tissu splénique. Une fois le programme terminé, le tissu splénique natif est dissocié en une suspension de cytes PLE, qui ressemble à ceci centrifuger brièvement pour rassembler l'échantillon au fond du tube. Cela garantira que le rotor et le stator sont libérés de toutes les cellules qui s'accumulent au fond du tube C.
Nous prélevons l'échantillon à travers l'ouverture scellée par un septum dans le bouchon du tube C à l'aide d'une pipette de mille microlitres. Pour commencer l'étape de filtration, nous appliquons le tissu dissocié sur un filtre de préséparation ou sur une passoire munie de pores de 30 microns. La passoire doit s'adapter à un tube de 15 millilitres pour un ou deux spléens, ou à un tube de 50 millilitres pour plus de deux spléens.
Laisser passer la suspension cellulaire, puis laver le filtre en appliquant cinq millilitres de tampon. Centrifuger maintenant le tube contenant la suspension cellulaire à 300 Gs et à température ambiante pendant 10 minutes afin de regrouper toutes les cytes en un culot cellulaire de rate. Maintenant que nous avons un culot de cytes dissociées, il faut aspirer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans une quantité appropriée de tampon de dissociation de la rate.
L'utilisation du max doux permettra d'obtenir un pourcentage élevé de cytes PLE viables, ce qui est démontré par cytométrie en flux à l'aide du quant max. Les cellules mortes sont marquées par l'iodure de propidium et l'exemple fourni. Le diagramme de dispersion avant latéral montre des cytes SP préparés. D'accord.
J'ai montré comment dissocier le tissu splénique en utilisant cette dissociation douce X. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important d'ajuster la quantité de tampon à la taille de l'échantillon et de choisir le bon programme Gentle X. Voilà, c'est terminé.
Bonne chance avec votre expérience.
Aperçu
Ce protocole vidéo démontre une technique efficace de dissociation automatisée des tissus de rate de souris à l'aide du dissociateur gentleMACS. La méthode produit des suspensions de cellules uniques viables, adaptées à des applications ultérieures.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Immunologie
Contexte
- La dissociation des tissus est cruciale pour obtenir des suspensions de cellules individuelles.
- La dissociation manuelle peut être fastidieuse et inefficace.
- Le Dissociateur gentleMACS offre une méthode reproductible et contrôlée.
- Des suspensions de cellules viables sont essentielles pour les applications en aval.
Objectif de l'étude
- Démontrer une technique permettant de gagner du temps pour la dissociation des tissus.
- Préparer des suspensions de cellules uniques à partir de rates de souris.
- Améliorer l'efficacité de la préparation des cellules pour la recherche.
Méthodes utilisées
- Utilisation du dissocieur gentleMACS avec des tubes spécialisés.
- Préparation de la solution tampon pour la suspension tissulaire.
- Filtration du tissu dissocié à l'aide de filtres de séparation Max Pres.
- Centrifugation pour recueillir des culots cellulaires viables.
Résultats principaux
- Dissociation efficace de spléens de souris en suspensions monocellulaires.
- Fort pourcentage de cellules viables démontré par cytométrie en flux.
- Élimination réussie des agrégats cellulaires pour une analyse précise.
- Reproductibilité des résultats sur différentes tailles d'échantillons.
Conclusions
- Le dissocieur gentleMACS simplifie considérablement la dissociation des tissus.
- La préparation adéquate du tampon est essentielle pour obtenir des résultats satisfaisants.
- Cette méthode peut être appliquée à divers types de tissus pour l'analyse cellulaire.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La préparation automatisée de suspensions de cellules uniques à partir de la rate de souris à l'aide du Dissociateur gentleMACS répond à un goulot d'étranglement critique dans les flux de travail de découverte précoce et d'immunologie. Une dissociation standardisée et reproductible permet une séparation, une analyse et une culture fiables des cellules en aval, renforçant la fiabilité des résultats dans la validation des cibles et le criblage. Cette capacité réduit la variabilité manuelle et accélère le passage du tissu aux données cellulaires exploitables dans l'ensemble des portefeuilles de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet la génération rapide de suspensions viables de cellules uniques pour l'immunophénotypage et les tests fonctionnels.
- Contribue à l'atténuation des risques biologiques en fournissant un matériau d'entrée constant pour l'analyse des voies et des cibles.
- Facilite la préparation reproductible des échantillons, réduisant ainsi les variables perturbatrices dans les études de validation des cibles.
Développement de criblages et de tests
- Fournit des suspensions cellulaires standardisées pour le développement de tests et les plates-formes de criblage à haut débit.
- Améliore la reproductibilité des tests en minimisant la variabilité de la dissociation manuelle.
- Prépare des échantillons compatibles avec la cytométrie en flux et le tri cellulaire, permettant des résultats quantitatifs robustes.
Recherche translationnelle et préclinique
- Permet d'obtenir des suspensions cellulaires à haute viabilité pour les études translationnelles de biomarqueurs et le profilage immunitaire préclinique.
- Assure la continuité entre la collecte des tissus et les analyses fonctionnelles et phénotypiques en aval.
- Réduit le risque de perte ou de dégradation des échantillons, soutenant ainsi une prise de décision préclinique fiable.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'intègre à l'interface entre la collecte de tissus et les tests cellulaires en aval, reliant ainsi les flux de travail de découverte précoce, de criblage et de recherche translationnelle.
- Biologie de la découverte : Soutient les tests d'hypothèses et les études mécanistiques en fournissant des entrées de haute qualité à base de cellules uniques.
- Écrans biologiques : Fournit des suspensions cellulaires reproductibles et évolutives, prêtes pour les tests et l'évaluation de composés.
- Analytique : Permet une évaluation quantitative de la viabilité et du phénotype par cytométrie en flux et autres méthodes de détection associées.
- Recherche translationnelle : Répond aux besoins d'analyse de biomarqueurs et de profilage des cellules immunitaires dans les modèles précliniques.
- Réutilisation en milieu industriel : Offre une plateforme de dissociation standardisée et automatisable, adaptable à différents types de tissus et études.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les études cellulaires.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité, la standardisation et le débit dans la préparation des échantillons.
- Valeur stratégique : Accélère les décisions d'aller/arrêt et réduit le gaspillage de ressources dû à des préparations infructueuses ou incohérentes.
- Impact sur le portefeuille : Favorise une priorisation ajustée au risque en garantissant un matériau d'entrée fiable pour plusieurs programmes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une bonne connaissance des protocoles de dissociation automatisée des tissus et de préparation des tampons.
- Suppose l'accès à un dissociateur gentleMACS, à des tubes C, ainsi qu'à des équipements compatibles de filtration et de centrifugation.
- Exige une standardisation interéquipes des quantités d'échantillons et des volumes de tampon pour assurer la reproductibilité.
- Peut être adapté à différentes tailles de rate et potentiellement à d'autres types de tissus moyennant des ajustements du protocole.
- Le volume de tampon et le choix du programme doivent être adaptés à la masse de l'échantillon afin d'assurer une dissociation optimale.
