JoVE Science Education

Lab Animal Research

Prélèvement de tissus en conditions stériles

JoVE Science Education
Lab Animal Research

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Lab Animal Research

Sterile Tissue Harvest

5.7: Compound Administration II

34,655 Views

•

12:24 min

•

April 30, 2023

Overview

source : Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR ; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Université de Notre Dame, IN

en 1959 le 3 R ' s ont été introduits par W.M.S. Russell et R.L. Burch dans leur livre les principes de Humane Experimental Technique. Les 3 R ' s sont remplacement, réduction et raffinement de l’utilisation des animaux en recherche. ¹ l’utilisation de lignées cellulaires et les cultures de tissus provenant d’animaux de recherche est une technique de remplacement, car il permet à de nombreuses expériences à mener in vitro. Récolte de tissus et organes destinés à la cellule et les cultures de tissus nécessite une technique aseptique pour éviter la contamination des tissus. Récolte stérile est également nécessaire pour les protéines et l’analyse de RNA et détermination des caractéristiques métaboliques des tissus. Ce manuscrit parlera du processus de récolte organe stérile chez les rats et les souris.

Principles

asepsie doit être suivi afin d’assurer la stérilité des tissus. La récolte est effectuée sous une hotte à flux laminaire qui a été désinfectée avec de l’alcool. Tous les matériaux utilisés doivent être stérilisés. Le technicien effectuant la récolte doit revêtir des équipements de protection individuelle, y compris un masque, bouffant, casaque stérile et des gants chirurgicaux stériles. La robe doit couvrir les poignets pour empêcher la chute des cellules de la peau dans la cavité du corps ouverte, boîtes de Pétri ou milieu stérile. Afin de maintenir la stérilité du technicien, cette procédure exige qu’un technicien deuxième, non stérile aider le technicien stérile avec l’euthanasie des animaux.

dans les expériences qui nécessitent des profils métaboliques des tissus, la méthode de récolte de tissu a un grand impact sur la qualité des données collectées. ² les deux l’euthanasie procédure et la durée de la récolte prend peut affecter l’intégrité des tissus. Hypoxie, une conséquence de l’euthanasie avec le dioxyde de carbone, s’est avéré avoir un effet profond sur les métabolites dans les tissus. Une hémorragie des vaisseaux dans les tissus pulmonaires est également causée par l’utilisation de dioxyde de carbone pour l’euthanasie. L’ordre du démontage du tissu lorsque séquentielle dissection des tissus ciblés est effectuée peut causer des changements métaboliques, comme les tissus commencent à l’âge ou se désintègrent pendant les vendanges.

tandis que les récoltes plus stériles ciblent un organe unique, il peut y avoir des fois qu’il faut plus d’un organe. Au cours de la dissection séquentielle, les tissus requis déterminera l’ordre dans lequel ils devraient être enlevés. ² tissus qui dégradent rapidement doivent être récoltés dès que possible suivant l’euthanasie. Afin de maintenir la stérilité des instruments, les organes prélevés de la cavité abdominale sont supprimés dans l’ordre suivant : rate, foie, reins, glandes surrénales, ovaire ou testicules, organes sexuels accessoires (prostate, vésicules séminales, utérus, trompes de Fallope), du tissu pancréatique, ganglions lymphatiques, la vessie et tube digestif (estomac, intestin grêle et gros intestin). L’ordre de la récolte d’organes de la cavité thoracique est d’abord supprimer le cœur et les poumons, suivies de la collection du thymus, ganglions lymphatiques et le œsophage. ³ nouveaux gants sont obligatoires pour chaque souris.

certains des organes stériles récoltées devront être conservés. Préservation des tissus s’effectue par congélation à l’azote liquide (LN ₂) ou avec une combinaison de LN ₂ et 2-Méthylbutane flash. Pour LN ₂ seul, les tissus sont rincées dans une solution saline stérile, effacés sur un chiffon absorbant stérile pour épuiser l’excès d’humidité, placés dans des carrés de feuille d’aluminium stérile et immédiatement plongés dans la LN ₂. ² Pour les échantillons immunologiques 2-Méthylbutane est ajouté. Le tissu est en fait immergé dans le 2-Méthylbutane qui a été refroidi par le LN ₂. Lorsque les tissus ont a viré au blancs, ils sont retirés de la 2-Méthylbutane, placés dans des emballages stériles et puis placés directement dans le LN ₂.

Procedure

1. préparation

matières couramment utilisées comprennent l’alcool à 70 % dans un vaporisateur, stérile 20-25 jauge aiguilles, deux packs d’instruments stériles de ciseaux de l’iris et le pouce Pince (un pour la peau) et un pour les tissus internes , papier, serviettes, gants de chirurgien stérile, une boîte de petri stérile, milieu stérile et du sérum physiologique stérile.
Le ventilateur de la hotte doit être en marche pendant au moins 15 minutes avant la procédure, et il doit être désinfecté avec de l’alcool 70 %.
Si le capot est équipé d’une lampe de stérilisation UV, il peut être utilisé pour désinfecter davantage la surface de travail.
Clean sont portés pour l’installation de la hotte. L’équipement est chargé dans la hotte dans l’ordre dans lequel ils seront utilisés, généralement de gauche à droite. Cela permet le travail à effectuer dans un flux unidirectionnel, empêchant la contamination des éléments propres Sales items. Cela permettra de protéger la récolte de tissus ou d’organes d’une contamination accidentelle de carcasses animales.
Les packs instrument stérile est ouverts, respectant l’intérieur stérile des paquets. Afin de maintenir la stérilité, le pack est placé dans le centre de la table, et chaque aileron est ouvert sans croisement sur le champ stérile ou à l’intérieur du pack. La personne non stérile s’ouvre le premier rabat supérieur en réfléchissant il loin pour lui/elle. Les rabats latéraux sont alors ouvertes en utilisant les deux mains-un sur chaque rabat- et en les tirant le peloton. Le rabat final est alors tiré vers la personne ouvrant le paquet, en prenant soin de ne pas toucher tout les surfaces internes du bloc-.
Placer les serviettes en papier dans le capot et mouillez-les avec de l’alcool.
La personne non stérile est euthanasier les animaux.
La personne stérile porte deux paires de gants chirurgicaux stériles.
La personne non stérile met la carcasse sur le papier absorbant et absorbe complètement la carcasse avec alcool à 70 %.
En utilisant un jeu de ciseaux stériles et forceps, faites une coupe horizontale dans la peau juste en avant du prépuce (chez les mâles) ou de l’os iliaque (chez les femelles). Éviter de couper à travers la musculature abdominale.
Mettre de côté les instruments.

2. Récolte des tissus

faire une petite incision juste en avant du bassin chez les femelles et surtout le prépuce chez les hommes.
Placer le pouce sous la coupe et saisissez le bord crânial de la coupe. L’autre main, maintenir les membres postérieurs et la queue tout en tirant la peau vers la tête.
La peau va déchirer loin du corps juste au-dessus des membres postérieurs et peut être tournée à l’envers sur la tête et les pattes avant. Ceci élimine efficacement les contaminants des cheveux pendant la récolte de l’orgue.
Faire tremper le corps avec 70 % d’alcool et supprimer la superficielle paire de gants qui ne sont plus stériles.
Ouvrir la cavité abdominale à l’aide d’instruments stériles.
1. Rate
  1. pour récolter la rate, le corps est placé en décubitus latéral droit.
  2. La rate peut être visualisée à travers le muscle abdominal.
  3. Une coupe ciseaux est faite directement sur la rate.
  4. La rate est légèrement retirée de la cavité corporelle.
  5. Lorsque vous coupez toutes les pièces jointes entre la rate, l’estomac et du tissu pancréatique, éviter de perforer ou de déchirure de l’orgue.
2. Foie
  1. pour récolter d’autres organes abdominaux, le corps est placé en décubitus dorsal.
  2. Le muscle de l’abdomen est soulevé et couper, laissant un ovale ouvrant directement sur la cavité abdominale.
  3. Après l’exposition de la cavité abdominale, reflètent le foie direction caudale de la membrane.
  4. Soigneusement rompre les membranes y attacher le foie au diaphragme.
  5. Faire une coupe perpendiculaire à la colonne vertébrale à travers les vaisseaux sanguins visibles entre le foie et le diaphragme.
  6. Soulevez le foie et refléter vers le diaphragme pour visualiser les pièces jointes sous it.
  7. Il y aura des membranes minces y attacher les petits lobes du foie à l’estomac et l’intestin grêle, qui devront être perturbée.
  8. Saisir le nœud fibreux dans le centre du foie sur sa face inférieure et soulevez l’orgue pour trouver toutes les pièces jointes. Séparer le foie les organes et les tissus sous-jacents.
  9. Noter que le foie est fragile et peut être facilement perforés, aboutissant à la libération de sang ; par conséquent, il doit être manipulé avec soin.
3. Reins
  1. après avoir exposé la cavité abdominale, poussez les intestins vers la gauche pour visualiser le rein droit, ou vers la droite pour visualiser le rein gauche.
  2. Pour enlever le rein, utilisez des lames de pinces à saisir sous le rein pour isoler les organes du corps. À l’aide de ciseaux ou une lame de bistouri Swann-Morton, couper le rein loin du corps. Faire la coupe sous la pince pour éviter d’endommager le rein.
  3. Une fois que le rein est enlevé, aucunes matières grasses peut être coupé de l’orgue.
4. Ovaire
  1. après avoir exposé la cavité abdominale, déplacer les intestins parotidien de visualiser l’utérus.
  2. Suivre la gauche, puis le droit, les cornes de l’utérus aux ovaires.
  3. Les ovaires sont petits. Chez les animaux plus âgés, ils peuvent être enchâssés dans la graisse.
  4. Glisser la pince dans l’ovaire de l’isoler de l’organisme et coupez-le exempt de la graisse et la trompe de Fallope.
5. Testicules
  1. après l’ouverture de la cavité abdominale, doucement saisir les coussinets adipeux inguinale et tirez-le vers l’avant.
  2. Cela va tirer les testicules du scrotum.
  3. Une fois le testicule est exposé, coupez les pièces jointes pour le scrotum et le canal déférent pour libérer de l’organisme.
  4. Cela se fait pour chaque testicule.
La cavité thoracique est ouvert pour retirer les organes thoraciques
1. le corps est placé en décubitus dorsal. Il est impératif que la peau se traduise bien au-dessus de la tête, si les organes de la cavité thoracique doivent être récoltés.
2. Saisir le processus xiphoïde et soulever pour permettre une coupe à travers le muscle abdominal juste caudal aux côtes. Étendre la coupe le long de la courbe inférieure de la cage thoracique, des deux côtés. Cela permettra la visualisation du diaphragme.
3. Perforer la membrane en faisant un petit coupé dans la cage thoracique latérale au plus point possible de chaque côté. Couper la membrane loin des côtes.
4. Lever les côtes à la xiphoïde pour visualiser les organes thoraciques.
5. Prolonger la coupe latérale vers le haut du sternum sur deux côtés et ouvrir le coffre.
6. Le cœur et les poumons est plus faciles à enlever ensemble.
  1. Placer la pince perpendiculairement à la trachée et fermement la trachée.
  2. à l’aide des ciseaux, faire une coupe perpendiculaire à la trachée juste en avant de la pince. Cette réduction devrait rompre la trachée et le œsophage.
  3. Sans desserrer l’emprise sur la trachée, soulevez la trachée vers le haut et en direction caudale. Découper toutes les pièces jointes des poumons à la surface de la colonne vertébrale dans la cage thoracique.
  4. Le œsophage peut doivent être coupés pour être capable de soulever le cœur et poumons gratuitement la cavité thoracique.
7. Coeur seulement
  1. lever le cœur et découpez soigneusement à travers le péricarde.
  2. De l’aorte est à l’aspect crânial du coeur sur l’animal & #39; s gauche.
  3. Tenant l’aorte avec la pince, faire une incision distale à la pince, conservant une emprise sur l’aorte et le coeur.
  4. Saisir l’aorte comme vous rompre la partie antérieure de la veine cave supérieure et les artères pulmonaires et les veines.
  5. Lever le cœur libre de la cavité thoracique de l’artère aorte.
8. Autres organes thoraciques
  1. organes sont récoltées dans l’ordre suivant pour maintenir la stérilité des instruments : thymus, ganglions lymphatiques et œsophage.
Cerveau
1. dans des circonstances particulières, le cerveau devra être récoltées pour la culture stérile.
2. Le cerveau est récolté dernière après n’importe quel autre organe récolte.
3. Dans les cas où le cerveau est le seul organe à percevoir, la peau n’est pas dépouillée de l’organisme, mais plutôt une coupure est faite à la nuque et s’étend le long de la ligne médiane de la zone cervicale dorsale à la pointe du nez.
4. Après avoir tiré latéralement la peau du crâne, l’OS exposé est imbibé de 70 % d’alcool et les gants Sales albums sont enlevés.
5. à l’aide d’une paire dédiée de ciseaux de cerveau stérile de récolte, faire une coupe à travers la colonne vertébrale à la base du crâne.
6. Ouvrir le crâne en plaçant le point des ciseaux dans le trou occipital et en découpant le long de la ligne médiane.
7. Utiliser l’extrémité plate de la lame de ciseaux pour tirer parti de l’os pariétaux du cerveau.
8. Soigneusement perturber les attachements de nerf dans le tronc cérébral et le chiasma optique sous le cerveau, en utilisant le point fermé de pince pouce.
9. De la même manière, faites glisser la pince fermée vers l’avant sous le cerveau et casser les pièces jointes à des bulbes olfactifs.
10. Le cerveau peut ensuite être supprimé du crâne en milieu stérile.
11. Lorsqu’ils pêchent le cerveau, d’une part est considérée non stérile comme il saisit la peau du crâne reflétée sous le menton pour stabiliser la tête, tandis que le crâne est coupé et le cerveau enlevé.
Peau
1. tissu mammaire
  1. tissu mammaire se trouve de la partie supérieure du sternum à la manubrium à l’ouverture génitale sur la face ventrale et s’étend latéralement sur les deux côtés, presque toucher sur la surface dorsale aux hanches et shou ialisa.
  2. Examiner le tissu mammaire à chercher des masses, la décoloration ou les anomalies. Les femelles allaitantes ou enceintes passera volume de tissu mammaire, et lait peut-être être présent.
  3. L’excision des glandes mammaires nécessite agrippant le bord de la glande avec une pince pouce et par dissection pour desserrer des pièces jointes à la peau. Une fois que la glande a été séparée de la peau, ciseaux iris peut être utilisé pour couper toutes les pièces jointes restantes.
  4. Tremper les surfaces exposées avec 70 % d’alcool et de commencer la récolte des tissus à l’aide d’un nouvel ensemble d’instruments stériles.
  5. Le tissu récolté est rincé avec une solution saline stérile avant de placer dans le milieu de culture.
2. Tumeurs sous-cutanées
  1. souvent, les cellules tumorales sont implantés à plusieurs reprises dans des animaux, et puis la tumeur qui en résulte est récoltée afin de maintenir la lignée de cellules tumorales.
  2. Il est impératif que récolte stérile tissulaire des tumeurs sous-cutanées être exécutés avant la rupture de la peau ' intégrité de s.
  3. Si la masse est abrasé ou nécrotique, les tissus prélevés ne sera pas de bonne qualité et ne peut pas être stérile.
  4. Le corps est placé pour exposer la zone d’intérêt. La peau est coupée le long d’un côté de la tumeur.
  5. Réfléchir soigneusement la peau afin d’exposer la tumeur. Placer les instruments de la peau sur le côté et laisser tremper les tissus exposés à l’alcool à 70 %.
  6. De nouveaux instruments stériles, disséquer la masse de la pièce détachée sous-jacent et de rompre tous les vaisseaux sanguins alimentant la messe.
  7. La tumeur est ensuite placée dans un milieu de culture.

nombreuses expériences exigent la collecte des cellules des tissus excisés. Dans ce cas, il est impératif que la procédure de récolte de tissus être effectuée de façon stérile. L’utilisation de lignées cellulaires et les cultures de tissus provenant d’animaux de recherche permet à de nombreuses expériences menées in vitro, whichin tour réduit l’utilisation d’animaux dans la recherche.

Dans cette vidéo, nous allons discuter de la méthode aseptique pour la récolte d’organes généralement extraites des animaux de laboratoire. Et cela sera suivie d’un bref aperçu de quelques expériences exemple employant cette technique stérile pour atteindre les objectifs de recherche différentes.

let ' s commencent par préparer étapes requises pour assurer la stérilité de l’espace, les instruments et le personnel au cours de la récolte de tissus d’origine animale.

Cette intervention est réalisée sous une hotte à flux laminaire. Avant l’opération, la hotte de cuisinière doit fonctionner pendant au moins 15 minutes et la zone doit être désinfectée avec de l’alcool 70 %. Ensuite, placez un essuie-tout dans la hotte et mouillez-les avec l’éthanol à 70 %. Après cela, chargez le matériel stérile et organiser par l’ordre dans lequel chaque instrument sera utilisé, généralement de gauche à droite. Cela permet pour le workflow se produisent de manière unidirectionnelle, empêchant la contamination accidentelle de la carcasse animale.

Il est recommandé qu’un technicien non stériles soient présents pour aider le technicien stérile. Les deux opérateurs doivent porter un masque et un bouffant. Le technicien stérile doit revêtir une blouse stérile et deux paires de gants chirurgicaux stériles. Remarque que la blouse et les gants doivent couvrir les poignets pour empêcher la chute des cellules de la peau dans la cavité du corps ouverte, Pétri ou milieu stérile.

La personne non stériles ouvre le package de l’instrument stérile sans toucher la surface intérieure, afin que la personne stérile peut supprimer l’outil aseptiquement. Enfin, le technicien non stériles euthanizes l’animal, met la carcasse sur les serviettes en papier et il absorbe complètement avec de l’alcool 70 %, afin que la personne stérile peut commencer la récolte.

tout d’abord, nous passerons en revue l’extraction des organes abdominaux, y compris la rate, du foie, reins, ovaires et testicules.

à l’aide d’un ensemble de ciseaux stériles et forceps faites une coupe horizontale dans la peau juste en avant du prépuce chez les mâles et de l’os iliaque chez les femelles. Évitez de couper à travers la musculature abdominale. Ensuite, placez votre pouce sous la coupe et saisissez le bord crânial de la coupe. De l’autre main, maintenir les membres postérieurs et la queue, tout en tirant la peau vers la tête. La peau va déchirer loin du corps juste au-dessus des membres postérieurs et peut être tournée à l’envers sur la tête et les pattes avant. Ceci élimine efficacement les contaminants de cheveux qui pourraient interférer avec la récolte d’organes stériles. Ensuite, tremper le corps avec 70 % d’alcool et supprimer la superficielle paire de gants, qui ne sont plus stériles. Jetez aussi tous les instruments qui ont été utilisés sur la peau.

à la récolte de la rate, positionner le corps en décubitus latéral droit. Thrate e devrait être visible à travers le muscle abdominal. Utiliser des ciseaux pour faire une coupe directement sur la rate et retirer délicatement l’organe de la cavité du corps. Couper toutes les pièces jointes entre la rate et l’estomac et du tissu pancréatique, mais éviter de perforer ou de déchirure de l’orgue.

De récolter tous les autres organes abdominaux, placer le corps en décubitus dorsal. Ensuite, soulevez et coupez le muscle abdominal, laissant un ovale ouvrant directement sur la cavité abdominale. Pour récolter le foie, reflètent l’orgue direction caudale de la membrane. Maintenant, utiliser des ciseaux couper soigneusement les membranes entre les deux structures. Ensuite, faites une coupe perpendiculaire à la colonne vertébrale à travers les vaisseaux sanguins. Puis soulevez le foie et refléter vers le diaphragme pour visualiser les pièces jointes sous celui-ci. Il y aura des membranes minces y attacher les petits lobes du foie à l’estomac et l’intestin grêle. Saisir le nœud fibreux dans le centre du foie sur le dessous et soulevez l’orgue pour trouver toutes les pièces jointes. Maintenant l’orgue séparer les tissus sous-jacents. Notez que le foie est fragile et peut être facilement perforé résultant en une libération excessive de sang. Par conséquent, il doit être manipulé avec soin.

Pour récolter les reins, poussez les intestins vers la gauche pour exposer le rein droit ou vers la droite pour exposer le rein gauche. Maintenant utiliser les lames de pinces à saisir sous le rein et à l’aide de ciseaux, couper sous la pince, retirer l’organe du corps.

De récolter les ovaires, déplacer les intestins parotidien de visualiser l’utérus. Suivez les cornes utérines droite et la gauche pour les ovaires. Ce sont de petits organes et chez les animaux plus âgés, ils peuvent être enchâssés dans la graisse. Faites glisser la pince sous l’ovaire à l’isoler de l’organisme et coupez-le exempt de la graisse et la trompe de Fallope.

Chez les mâles, pour enlever les testicules, doucement saisir les coussinets adipeux inguinale et tirer vers l’avant. Cela va tirer les testicules du scrotum. Une fois qu’ils deviennent visibles, coupez les pièces jointes pour le scrotum et le canal déférent pour libérer ces structures de l’organisme.

ensuite, laissez ' s apprendre à récolter des organes thoraciques, tels que le cœur et les poumons. Le cœur et les poumons sont plus faciles à enlever ensemble. Pour ouvrir la cavité thoracique, commencez en plaçant l’animal en décubitus dorsal. Tout d’abord, saisir et soulevez le processus xiphoïde. Puis faire une coupe à travers le muscle abdominal juste caudal aux côtes. Étendre la coupe le long de la courbe inférieure de la cage thoracique, des deux côtés, exposant le diaphragme.

Ensuite, perforer la membrane en faisant un petit coupé dans la cage thoracique latérale au plus point possible de chaque côté. Ensuite, couper la membrane loin des côtes. Maintenant Soulevez les nervures à la xiphoïde pour visualiser les organes thoraciques. Étendre le latéral coupé vers le haut du sternum, des deux côtés pour ouvrir le coffre. Puis placer la pince perpendiculairement à la trachée et fermement la trachée. Maintenant, à l’aide de ciseaux, faire une coupe perpendiculaire juste en avant de la pince. Cela devrait rompre la trachée et l’oesophage. Sans desserrer l’emprise sur la trachée, soulevez-la direction caudale et découper toutes les pièces jointes des poumons à la surface de la colonne vertébrale dans la cage thoracique. Continuez jusqu’à ce que vous êtes capable de soulever le cœur et les poumons gratuitement la cavité thoracique.

Pour enlever seulement le cœur, soulevez l’orgue et découpez soigneusement à travers le péricarde. Ensuite, maintenez l’aorte avec la pince et faire une incision distale à la pince. Puis couper la partie antérieure de la veine cave supérieure, les artères pulmonaires et des veines. Après cela, vous devriez être capable de soulever le cœur libre de la cavité thoracique.

maintenant, que ' s revoir la procédure de la récolte du cerveau à l’aide d’une technique aseptique. Dans le cas où le cerveau est le seul organe à percevoir, les étapes préparer sont les mêmes.

Pour commencer la récolte, saturer le corps avec de l’alcool et enlever la peau du corps comme auparavant, à savoir vers le haut et sur le crâne. Ceci permet à tout être stérile à partir de ce moment. Puis, saturer l’animal à nouveau avec de l’alcool, retirer les gants externes et jeter les instruments utilisés sur la peau. Maintenant, effectuez une coupe à la nuque et elle s’étendent le long de la ligne médiane de la zone cervicale dorsale jusqu’à la pointe du nez.

Maintenant, en utilisant une paire dédiée de ciseaux de cerveau stérile de récolte, faire une coupe au milieu de la colonne vertébrale à la base du crâne. Pour ouvrir la boîte crânienne, placez la pointe des ciseaux dans le trou occipital et couper le long de la ligne médiane. Notez que durant ce cerveau procédure de récolte, une main est considérée comme reflété non stérile qu’il saisit la peau du crâne sous le menton pour stabiliser la tête, tandis que la main stérile est utilisée pour découper le crâne. Après cela, utiliser le côté plat de la lame de ciseaux pour tirer parti de l’os pariétaux du cerveau. Et à l’aide de la spatule, perturber soigneusement les pièces jointes de nerf dans le tronc cérébral et le chiasma optique sous le cerveau. Enfin, faites glisser la pince fermée vers l’avant et casser les pièces jointes à des bulbes olfactifs. Et le cerveau peut ensuite être supprimé sur le crâne, directement dans les médias stériles.

maintenant que nous ' ve a examiné les éléments essentiels de la récolte de tissus stériles, laissez ' s discuter de certaines des nombreuses utilisations de cette procédure dans la recherche biomédicale.

Tige neurales chercheurs utilisent récolte stérile pour extraire le tissu de cerveau de souris néonatales, à cultiver ces cellules in vitro. Cela leur permet d’étudier le rôle des cellules souches neurales dans le développement et la progression du cancer.

Un autre sujet de recherche qui implique la récolte de tissus active est profils métaboliques, qui consiste à étudier la physiologie tissulaire en analysant les différents métabolites dans un échantillon. Dans cet exemple, les scientifiques, à l’aide d’une technique aseptique, biopsies du foie prélevé de type sauvage et souris axéniques et utilisé la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire, ou RMN, pour élucider la différence dans le profil métabolique du foie des deux populations animales.

Enfin, les immunologistes exécutent souvent récolte tissu stérile afin d’étudier la propagation de l’infection. Dans cette expérience particulière, les chercheurs ont réalisé par voie intratrachéale injection de bactéries Pseudomonas aeruginosa pour induire une infection pulmonaire chronique. Suite à cela, les animaux ont été euthanasiés et poumons ont été extraites à l’aide d’une technique aseptique pour déterminer la charge bactérienne à 3, 7, 14 et 28 jours après l’infection.

vous ' ve juste regardé JoVE ' s-vidéo sur la récolte de tissus provenant d’animaux de laboratoire à l’aide d’une technique aseptique. Vous devriez maintenant avoir une meilleure idée des étapes que vous devez prendre pour s’assurer que la stérilité est maintenue tout au long de la récolte. Et vous devriez être en mesure d’extraire les organes abdominaux et thoraciques et les cerveaux de ces animaux sans endommager les tissus. Comme toujours, Merci de regarder !

Applications and Summary

bien que bon nombre des procédures de récolte d’organes stériles sont semblables à une autopsie standard, l’utilisation d’une technique stérile est impérative pour tissus de valeur pour les procédures expérimentales, incluent la récolte des cellules de la tissus excisés. Profilage ou collecte de RNA de tissus peut être compromise si la stérilité n’est pas maintenue.

References

Russel, W.M.S. and Burch, R.L. 1959. The Principles of Humane Experimental Technique. Methuen: London.
Petucci, C., Rojas-Betancourt, S., and Gardell, S.J. 2012. Comparison of tissue harvest protocols for the quantitation of acylcarnitines in mouse heart and liver by mass spectrometry. Metabolomics. 8.784-792.
Parkinson, C.M., O'Brien, A., Albers, T.M., Simon, M.A., Clifford, C.B., and Pritchett-Corning, K.R. 2011. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. 54. e2966. 1-7.

Transcript

Many experiments demand collection of cells from the excised tissue. In such cases, it is imperative that the tissue harvest procedure be performed in a sterile manner. The use of cell lines and tissue cultures that originate from research animals allows for many experiments to be conducted in vitro, whichin turn reduces the animal usage in research.

In this video, we will discuss the aseptic method for harvest of commonly extracted organs from lab animals. And this will be followed by a short review of a few example experiments employing this sterile technique to achieve different research goals.

Let’s begin with the prepping steps required to ensure sterility of the space, instruments, and personnel during animal tissue harvest.

This procedure is performed in a laminar flow hood. Prior to the process, the hood fan should run for at least 15 minutes and the area should be disinfected with 70% alcohol. Next, place some paper towels into the hood and wet them with 70% ethanol. After that, load the sterile equipment and organize by the order in which each instrument will be used, usually from left to right. This allows for the workflow to occur in a unidirectional manner, preventing accidental contamination from the animal carcass.

It is recommended that a non-sterile technician be present to assist the sterile technician. Both operators must wear a mask and a bouffant. The sterile technician must don a sterile gown and two pairs of sterile surgical gloves. Note that the gown and gloves must cover the wrists to prevent the shedding of skin cells into the opened body cavity, petri dishes, or sterile media.

The non-sterile person opens the sterile instrument package without touching the inner surface, so that the sterile person can remove the tool aseptically. Lastly, the non-sterile technician euthanizes the animal, places the carcass on the paper towels and completely soaks it with 70% alcohol, so that the sterile person can begin the harvest.

First, we will review the extraction of abdominal organs, including the spleen, liver, kidneys, ovaries, and testes.

Using a set of sterile scissors and forceps make a horizontal cut in the skin just anterior to the prepuce in males and the pelvic bone in females. Avoid cutting through the abdominal musculature. Next, place your thumb under the cut and grasp the cranial edge of the cut. Using the other hand, securely hold the hind limbs and tail, while pulling the skin toward the head. The skin will tear away from the body just above the hind limbs, and can be turned inside out over the head and forelegs. This effectively removes hair contaminants that might interfere with the sterile organ harvest. Then, soak the body again with 70% alcohol and remove the superficial pair of gloves, which are no longer sterile. Also discard all the instruments that were used on the skin.

To harvest the spleen, position the body in right lateral recumbency. The spleen should be visible through the abdominal muscle. Use scissors to make a cut directly over the spleen, and gently retract the organ from the body cavity. Cut all the attachments between the spleen and the stomach and pancreatic tissue, but avoid puncturing or tearing the organ.

To harvest all other abdominal organs, place the body in dorsal recumbency. Then, lift and cut away the abdominal muscle leaving an oval opening directly over the abdominal cavity. To harvest the liver, reflect the organ caudally away from the diaphragm. Now use scissors to carefully sever any membranes between the two structures. Next, make a cut perpendicular to the spine through the blood vessels. Then lift the liver and reflect it toward the diaphragm to visualize the attachments beneath it. There will be thin membranes attaching the smaller liver lobes to the stomach and small intestine. Grasp the fibrous node in the center of the liver on the underside and lift the organ to find all the attachments. Now separate the organ from the underlying tissues. Note that the liver is fragile and can be easily punctured resulting in excessive release of blood. Therefore, it must be handled carefully.

To harvest the kidneys, push the intestines to the left to expose the right kidney or to the right to expose the left kidney. Now use the forceps blades to grasp beneath the kidney and using scissors cut under the forceps, removing the organ from the body.

To harvest the ovaries, move the intestines cranially to visualize the uterus. Follow the left and the right uterine horns to the ovaries. These are small organs and in older animals they may be imbedded in fat. Slide the forceps under the ovary to isolate it from the body and cut it free from the fat and the fallopian tube.

In males, to remove testes, gently grasp the inguinal fat pad and pull anteriorly. This will pull the testis from the scrotum. Once they become visible, cut the attachments to the scrotum and the vas deferens to free these structures from the body.

Next, let’s learn how to harvest thoracic organs, such as the heart and lungs. The heart and lungs are most easily removed together. To open the thoracic cavity, begin by placing the animal in dorsal recumbency. First, grasp and lift the xiphoid process. Then make a cut through the abdominal muscle just caudal to the ribs. Extend the cut along the lower curve of the rib cage on both sides, exposing the diaphragm.

Next, puncture the diaphragm by making a small cut in the rib cage at the most lateral point possible on each side. Then, cut the diaphragm away from the ribs. Now lift the ribs at the xiphoid to visualize the thoracic organs. Extend the lateral cut to the top of the sternum on both sides to open the chest. Then place the forceps perpendicular to the trachea and grasp the windpipe firmly. Now, using scissors, make a perpendicular cut just anterior to the forceps. This should sever the trachea and the esophagus. Without loosening the grip on the trachea, lift it up caudally and snip any attachments of the lungs to the spinal surface in the rib cage. Continue until you are able to lift the heart and lungs free of the chest cavity.

To remove just the heart, lift the organ and carefully cut through the pericardial sac. Next, hold the aorta with the forceps and make a cut distal to the forceps. Then sever the anterior vena cava, pulmonary arteries, and veins. After that, you should be able to lift the heart free of the thoracic cavity.

Now, let’s review the procedure of harvesting the brain using aseptic technique. In instances where the brain is the only organ to be collected, the prepping steps are the same.

To start the harvest, saturate the body with alcohol, and strip the skin from the body as before — up and over the skull. This allows for everything to be sterile from this point forward. Then, saturate the animal again with alcohol, remove the outer gloves and discard the instruments used on the skin. Now make a cut at the nape of the neck and extend it along the midline from the dorsal cervical area to the tip of the nose.

Now, using a dedicated pair of sterile brain harvest scissors, make a cut through the spine at the base of the skull. To open the cranium, place the point of the scissors in the foramen magnum and cut along the midline. Note that during this brain harvesting procedure, one hand is considered non-sterile as it grasps the skin from the skull reflected beneath the chin to stabilize the head, while the sterile hand is being used to cut the skull. After that, use the flat edge of the scissor blade to lever the parietal bones away from the brain. And using the spatula, carefully disrupt the nerve attachments at the brain stem and the optic chiasm beneath the brain. Lastly, slide the closed forceps anteriorly and break the attachments at the olfactory bulbs. And the brain can then be dropped from the skull directly into the sterile media.

Now that we’ve reviewed the essentials of sterile tissue harvest, let’s discuss some of the many uses of this procedure in biomedical research.

Neural stem researchers use sterile harvesting technique to extract tissue from mouse neonatal brain, to grow these cells in vitro. This allows them to study the role of neural stem cells in development, and cancer progression.

Another active area of research that involves tissue harvest is metabolic profiling, which involves studying tissue physiology by analyzing the different metabolites in a sample. In this example, scientists, using aseptic technique, collected liver biopsies from wild type and germ-free mice and used nuclear magnetic resonance spectroscopy, or NMR, to elucidate the difference in the liver metabolic profile of the two animal populations.

Lastly, immunologists often perform sterile tissue harvest to study the spread of infection. In this particular experiment, researchers performed intratracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa to induce chronic lung infection. Following that, animals were euthanized and lungs were extracted using aseptic technique to determine the bacterial load at 3, 7, 14, and 28 days post-infection.

You’ve just watched JoVE’s video on harvesting tissues from lab animals using aseptic technique. You should now have a better sense of the steps you need to take to ensure that sterility is maintained throughout the harvest. And you should be able to extract the abdominal and thoracic organs, and brains from these animals without causing any damage to the tissue. As always, thanks for watching!

Tags

Aseptic Method Lab Animals Research Experiments Sterile Technique Laminar Flow Hood Sterilization Sterile Equipment Non-sterile Technician Sterile Technician