Méthodes Single Molecule pour surveiller les changements dans les propriétés élastique bicouche

Bonjour, je suis le Dr Ola Anderson du Département de physiologie et de biomécanique du Weill Cornell Medical College à New York. Je m'appelle Olson. Je suis étudiant en biomédecine computationnelle dans le laboratoire d'Olive Anderson.

Et je suis Shail Collingwood, technicienne de recherche également issue du laboratoire Anderson. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment former un plan, une bicouche, comment isoler une petite membrane à l’aide de l’électrode Biolayer Punch, comment enregistrer l’activité unitaire des canaux ioniques et comment analyser les résultats afin d’utiliser les canaux Gramin comme sondes des propriétés de la bicouche lipidique. Dans une vidéo précédente, nous vous avons montré comment vous préparer à ces expériences.

Nous vous avons montré comment préparer la chambre que nous utilisons, et comment préparer l'électrode à perforation de bicouche que nous employons pour isoler la fine couche membranaire où nous enregistrons l'activité des canaux. Perforons donc quelques bicouches. Pour commencer la mise en place des expériences de bicouche, ajoutez 2,5 mils de solution électrolytique préalablement équilibrée en température dans chaque compartiment de la chambre préalablement enduite. La solution que nous utilisons habituellement est du chlorure de sodium à un molaire plus 10 millimolaires.

Régler le tampon à un pH de sept, ajuster le microscope et la source lumineuse de manière à ce que le trou dans le téflon soit centré dans votre champ de vision et uniformément éclairé. Insérer la micropipette en verre dans un porte-électrode. Relier une seringue au porte-électrode à l’aide d’un morceau de tube en tigon.

Remplissez la pipette dans le porte-électrode par aspiration. Veillez à éviter les bulles, car elles pourraient interrompre la connexion électrique entre le pastille d'argent dans le porte-électrode et l'extrémité de la pipette. Appliquez une petite quantité de vaseline sur la vis, puis insérez-la dans le porte-électrode microscopique.

Le vaseline permet de créer un joint étanche à l'air. Branchez le porte-électrode sur le support de la pince patch à l'intérieur de la cage de Faraday. Positionnez la micropipette de manière centrée juste derrière le trou dans la cloison en téflon.

Placez l'électrode en argent enroulée dans la chambre avant. Fixez-la en place à l'aide d'argile à modeler et reliez-la au circuit de commande de tension. Enfin, équilibrez les électrodes.

Ceci est essentiel car les deux électrodes, celle située à l'avant et celle dans le porte-électrode microscopique, peuvent présenter des potentiels de demi-pile légèrement différents. Le potentiel de demi-pile correspond à la différence de potentiel entre le métal argenté de l'électrode et la solution électrolytique adjacente au revêtement de chlorure d'argent. Équilibrez les électrodes en ajustant le décalage manuel de manière à ce que le courant circulant entre les deux compartiments varie entre -200 et +200 picoampères sur le patch-clamp.

Le potentiel de décalage évolue dans le temps, il est donc nécessaire d'équilibrer les électrodes à intervalles réguliers tout au long de l'expérience afin de former la membrane bicouche lipidique. Nettoyez une micropipette polie à la flamme avec la solution fch, comme décrit dans la vidéo accompagnante. Plongez la micropipette nettoyée dans la solution lipidique d'enduction et laissez-la remonter d'environ un millimètre à l'intérieur de la micropipette.

Placer la pointe de la pipette juste devant le trou dans la cloison en téflon et appliquer délicatement une bulle de solution lipidique sur le trou. Lorsque l'opération réussit, une bulle lipidique vivement colorée se forme à travers le trou, ayant une forme de taureau ou de beignet par laquelle elle s'attache à la cloison en téflon. Laisser la membrane s'amincir, ce qui peut être facilité par l'application d'un potentiel de 100 à 200 millivolts à travers la membrane.

Placer la pointe de micropipette en verre dans le Taurus et laisser reposer quelques minutes afin d'obtenir un meilleur scellement entre la micropipette et la bicouche. À ce stade, vous êtes prêt à isoler un fragment membranaire à l'aide d'une micropipette en verre. Doper maintenant la membrane avec du gramin.

Cette solution de gramine a été préparée à partir d'un stock de un micromolaire qui a été dilué à un à 10 nanomolaires. Dans le diméthylsulfoxyde, on ajoute généralement un à 10 microlitres de la dilution de chaque côté de la membrane afin que la concentration finale se situe dans la gamme du picomolaire. Utilisez les barreaux magnétiques pour agiter la solution pendant environ deux minutes, puis attendez encore 10 minutes avant de former une nouvelle petite membrane afin d'enregistrer l'activité unitaire des canaux.

Ce poids temporel permet l'incorporation de la gramine dans la membrane. Vérifiez l'activité du canal en appliquant une tension. Généralement, on souhaite environ un événement par canal par seconde.

Les canaux sont visibles sous forme de changements discrets vers le haut et vers le bas du courant membranaire. Vous êtes maintenant prêt à commencer l'expérience proprement dite. En premier lieu, enregistrez les tracés du courant témoin.

Équilibrez l'électrode comme indiqué précédemment, formez une petite membrane ou un patch comme décrit dans la vidéo accompagnante. Appliquez un potentiel positif de 200 millivolts et enregistrez l'activité du canal unitaire. Vous devez recueillir de 100 à 200 transitions de courant unitaires.

Répétez cette étape avec une tension négative de 200 millivolts. Rompez le patch en expulsant l'électrolyte par l'extrémité de la pipette. À l'aide de la vis en nylon, rééquilibrez les électrodes, retirez la pipette vers la chambre arrière, éliminez l'excès de lipide et formez un nouveau patch.

Vous pouvez également répéter ces étapes pour effectuer des enregistrements à d'autres potentiels. Vous êtes maintenant prêt à enregistrer les tracés de courant expérimentaux en présence du modificateur de bicouche. Dans ce cas, l'antidépresseur fluoxétine est ajouté des deux côtés de la membrane.

La solution mère de fluoxétine doit être diluée à 25 millimolaire dans le DMSO. Ajoutez cinq microlitres de cette solution pour obtenir une concentration de 50 micromolaire dans la chambre. Le DMSO peut affecter les propriétés de la bicouche. Par conséquent, il est important de limiter la quantité de DMSO dans la solution à 25 microlitres, soit 1 % ou 150 millimolaire.

Agiter pendant cinq minutes et attendre 10 minutes pour permettre au modulateur de s'équilibrer entre la solution aqueuse et la membrane. Ensuite, enregistrer l'activité du canal comme décrit précédemment en présence du modulateur. Répéter ces étapes pour enregistrer l'activité du canal à des concentrations croissantes du modulateur.

Nous apprenons beaucoup sur les modifications du bicouche en quantifiant la durée de vie des canaux et leurs taux d'apparition. Pour effectuer une telle analyse, nous devons détecter la formation et la disparition des canaux. Ici, nous utilisons un algorithme basé sur les transitions, dans lequel l'ordinateur calcule la dérivée première afin de déterminer les changements rapides du courant et les marque comme des événements de canal.

Les événements sont stockés sous forme de série chronologique afin de nous aider à déterminer la durée de vie des canaux avant et après la transition. Les niveaux de courant sont également enregistrés et nous aident à déterminer les amplitudes des canaux au fur et à mesure de l'expérience. L'ordinateur construit un histogramme des amplitudes de transition de courant, ce qui permet de suivre l'acquisition des transitions de courant.

Il vous permet également d'évaluer la qualité de l'expérience. Si les amplitudes de transition actuelles sont très dispersées, vous avez un problème. Si l'histogramme est resserré, vous obtenez de bons résultats.

Lorsque vous avez accumulé plus de 200 événements de transition, calculez le courant moyen et l'écart type des transitions dans le pic principal. Vous pouvez estimer simplement le taux d'apparition des canaux en divisant le nombre de transitions dans l'histogramme des amplitudes de courant par la durée d'observation. N'oubliez pas de diviser également par deux, car un canal est compté deux fois dans l'histogramme : une fois lorsqu'il apparaît et une fois lorsqu'il disparaît.

Analysez la série temporelle des événements de transition afin d'obtenir les distributions de durée de vie des canaux. La détermination des durées de vie est simple dans les enregistrements de courant où un seul canal conducteur est présent à tout moment. Dans ce cas, l'ordinateur détecte si chaque transition correspond à l'apparition ou à la disparition d'un canal, et un événement de disparition ne peut appartenir qu'à l'événement d'apparition précédent.

La durée entre les deux transitions correspond à la durée de vie du canal. Dans les cas où les transitions du canal sont trop rapprochées pour être distinguées, vous devez attribuer manuellement les apparitions et les disparitions. L'attribution est plus complexe lorsque deux canaux ou plus sont conducteurs simultanément, car on ne sait alors pas quelle disparition de canal correspond à quelle apparition.

Pour cette raison, il est préférable d'avoir une faible activité du canal. Vous pouvez résoudre le problème d'attribution en utilisant un générateur de nombres aléatoires pour associer des apparitions à des disparitions. Ainsi, vous obtenez une série de durées de vie des canaux.

Ceci est converti en un histogramme de durée de vie, qui est à son tour transformé en une courbe de survie, permettant de déterminer la durée de vie moyenne en ajustant une distribution exponentielle simple à la courbe de survie à l’aide d’un ajustement de courbe par moindres carrés non linéaires, et ce, dans des expériences où la grande membrane ne se rompt pas. Lorsque vous ajoutez le modificateur de bicouche, il est possible de comparer l’effet sur les taux d’apparition des canaux. Une telle comparaison n’est pas justifiée si la grande membrane se rompt, car la fonction des protéines membranaires est régulée par la composition lipidique de la membrane cellulaire.

Cette régulation est due à une combinaison d'interactions spécifiques entre lipides et protéines, ainsi qu'à des interactions plus générales entre le doublet lipidique et les protéines membranaires. Ces interactions sont particulièrement importantes dans la recherche pharmacologique. En effet, de nombreux médicaments actuels sur le marché sont amphiphiles et peuvent modifier les propriétés du doublet lipidique, ce qui peut à son tour entraîner une altération de la fonction des protéines membranaires.

Les canaux Gramin peuvent être utilisés comme des transducteurs moléculaires de force pour indiquer si des amphiphiles peuvent modifier les propriétés de la bicouche lipidique. Représenter graphiquement les variations de la durée de vie et du taux d'apparition en fonction de la concentration du modificateur permet d'obtenir des informations sur les changements des propriétés de la bicouche.

Une fréquence accrue signifie que la bicouche est plus facilement déformable pour accueillir le site Gram et la dimérisation. Une durée de vie accrue indique que la déformation de la bicouche associée à la formation du canal n'est pas aussi coûteuse sur le plan énergétique. Un modificateur peut augmenter la fréquence et la durée de vie en augmentant l'élasticité de la membrane ou en influant sur sa courbure.

Nous avons maintenant montré comment utiliser les canaux chromo pour vérifier si des petites molécules modifient les propriétés élastiques des bicouches. Et voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé.

Bonne chance avec vos expériences.