Méthodes Single Molecule pour surveiller les changements dans les propriétés élastique bicouche

Bonjour, je suis le Dr Ola Anderson du Département de physiologie et de biophysique du Weill Cornell Medical College à New York. Je m’appelle Olson. Je suis étudiante en biomédecine computationnelle dans le laboratoire d’Olive Anderson.

Et je suis Shail Collingwood, un technicien de recherche également du laboratoire Anderson. Aujourd’hui, nous allons vous montrer comment former un plan, une biocouche, comment isoler une petite membrane à l’aide de l’électrode Biolayer Punch, comment enregistrer l’activité d’un seul canal et comment analyser les résultats et ainsi utiliser les canaux de Gramin comme sondes des propriétés de la couche B lipidique. Dans une vidéo précédente, nous vous avons montré comment vous préparer à ces expériences.

Nous vous avons montré comment préparer la chambre que nous avons utilisée, et nous vous avons montré comment préparer l’électrode de poinçonnage bicouche que nous utilisons pour isoler la petite couche de membrane où nous enregistrons l’activité du canal. Commençons donc à préparer des expériences bicouches à 2,5 mils de la solution d’électrolyte à température équilibrée dans chaque compartiment de la chambre pré-peinte. La solution que nous utilisons habituellement est une molaire de chlorure de sodium plus 10 millimolaires.

Une pièce tamponnée à pH sept, ajustez le microscope et la source de lumière de sorte que le trou dans le téflon soit centré dans votre champ de vision et éclairé de manière brillante. Insérez la micropipette en verre dans un porte-micro-électrode. Connectez une seringue au support avec un morceau de tube tigon.

Remplissez la pipette dans le porte-électrode par aspiration. Veillez à éviter les bulles, car elles pourraient rompre la connexion électrique entre la pastille d’argent dans le porte-électrode et la pointe de la pipette. Appliquez une petite quantité de vaseline sur la vis, puis placez-la dans le porte-micro-électrode.

La vaseline aide à faire un joint étanche à l’air. Branchez le porte-électrode dans la tête de la pince de patch dans la cage de Faraday. Positionnez l’embout de la micropipette au centre et juste derrière le trou dans la cloison en téflon.

Placez l’électrode d’argent enroulée dans la chambre avant. Fixez-le en place avec de la pâte à modeler et connectez-le au circuit de commande de tension. Enfin, équilibrez les électrodes.

Ceci est essentiel car les deux électrodes, celle à l’avant et celle dans le porte-micro-électrode, peuvent avoir des potentiels de demi-cellule légèrement différents. Le potentiel de la demi-cellule est la différence entre l’argent métallique et l’électrode et la solution électrolytique adjacente au revêtement de chlorure d’argent. Équilibrez les électrodes en ajustant le décalage manuel de sorte que le courant circulant entre les deux compartiments fluctue entre moins 200 et plus 200 picoampères sur la pince de brassage.

Le potentiel de décalage changera avec le temps, de sorte que vous équilibrez les électrodes à intervalles réguliers tout au long de l’expérience pour former la membrane bicouche lipidique. Nettoyez une pipette passée polie au feu avec la solution fch comme décrit dans la vidéo ci-jointe. Trempez la pipette nettoyée dans la solution de platelage lipidique et laissez-la monter d’environ un millimètre dans la pipette.

Placez l’embout de la pipette juste devant le trou dans la cloison en téflon et peignez doucement une bulle de la solution lipidique sur le trou. En cas de succès, une bulle lipidique de couleur vive se forme à travers le trou avec une forme de talimen en forme de Taureau ou de beignet qui l’attache à la cloison en téflon. Laissez la membrane s’amincir, ce qui peut être facilité en appliquant un potentiel de 100 à 200 millivolts à travers la membrane.

Placez l’embout de la micropipette en verre dans le Taurus et laissez-le reposer pendant quelques minutes pour assurer une meilleure étanchéité entre la pipette et la bicouche. À ce stade, vous êtes prêt à isoler un patch à membrane à l’aide d’une micro-pipette en verre. Maintenant, dopé, la membrane avec de la gramine.

Cette solution de gramine a été fabriquée à partir d’un stock d’une micromolaire qui a été dilué en une à 10 nanomolaires. Dans l’oxyde de diméthylsulf, généralement un à 10 microlitres de dilution est ajouté de chaque côté de la membrane de sorte que la concentration finale est dans la gamme picaMolaire. Utilisez les barres d’agitation magnétiques pour agiter la solution pendant environ deux minutes et attendez encore 10 minutes avant de former une nouvelle petite membrane pour enregistrer l’activité d’un seul canal.

Ce poids de temps permet à la gramine d’être incorporée dans la membrane. Vérifiez l’activité du canal en appliquant une tension. En général, nous voulons environ un événement de canal par seconde.

Les canaux sont visibles sous forme de changements discrets à la hausse et à la baisse du courant de membrane. Vous êtes maintenant prêt à commencer l’expérience proprement dite. Tout d’abord, enregistrez les traces de courant de contrôle.

Équilibrez l’électrode comme démontré précédemment, formez une petite membrane ou un patch comme décrit dans la vidéo ci-jointe. Appliquez un positif de 200 millivolts et enregistrez l’activité d’un seul canal. Vous devez collecter 100 à 200 transitions de courant monocanal.

Répétez cette étape avec moins 200 millivolts. Cassez le patch en expulsant l’électrolyte à travers la pointe de la pipette. À l’aide de la vis en nylon, rééquilibrez les électrodes, faites reculer la pipette vers la chambre arrière, soufflez l’excès de lipide et formez un nouveau patch.

Vous pouvez également répéter ces étapes pour exiger des enregistrements à d’autres potentiels. Vous êtes maintenant prêt à enregistrer les traces de courant expérimentales au niveau du modificateur bicouche. Dans ce cas, l’antidépresseur fluoxétine des deux côtés de la membrane.

La solution mère de fluoxétine doit être diluée à 25 millimolaires dans du DMSO. Ajouter cinq microlitres de cette solution pour atteindre une concentration de 50 micromolaires dans la chambre DMSO peut affecter les propriétés bicouches. Par conséquent, il est important de limiter la quantité de DMSO dans la solution à 25 microlitres 1 % ou 150 millimolaires.

Remuez pendant cinq minutes et attendez 10 minutes pour permettre au modificateur de s’équilibrer entre la solution aqueuse et la membrane. Maintenant, enregistrez l’activité du canal comme décrit précédemment en présence du modificateur. Répétez ces étapes pour enregistrer l’activité du canal à des concentrations croissantes du modificateur.

Nous apprenons beaucoup sur les changements dans la bicouche en quantifiant la durée de vie des canaux et les taux d’apparition. Pour faire une telle analyse, nous devons détecter la formation et la disparition de canaux. Ici, nous utilisons un algorithme basé sur la transition où l’ordinateur calcule la dérivée première pour déterminer les changements rapides du courant et les marquer comme des événements de canal.

Les événements sont stockés sous forme de série chronologique pour nous aider à déterminer la durée de vie des canaux avant et après la transition. Les niveaux de courant sont également stockés et nous aident à déterminer les amplitudes des canaux pendant que l’expérience est en cours. L’ordinateur construit un histogramme d’amplitude de transition de courant, qui vous permet de suivre l’acquisition des transitions de courant.

Il vous permet également d’évaluer la qualité de l’expérience. Si les amplitudes de transition actuelles se dispersent largement, vous avez des problèmes. Si l’histogramme est serré, vous vous en sortez bien.

Lorsque vous avez accumulé plus de 200 événements de transition, calculez le courant moyen et l’écart type pour les transitions dans le pic principal. Vous pouvez estimer le taux d’apparition du canal simplement en divisant le nombre de transitions dans l’histogramme d’amplitude de transition actuel par le temps d’observation. N’oubliez pas de diviser également par deux, car un canal est compté deux fois dans l’histogramme : une fois lorsqu’il apparaît et une fois lorsqu’il disparaît.

Analysez la série chronologique des événements de transition pour obtenir les distributions à vie des canaux. La détermination des durées de vie est simple dans les traces de courant où vous n’avez pas plus d’un canal conducteur à la fois. Dans ce cas, l’ordinateur détecte si chaque transition est une apparition ou une disparition de canal, et un événement de disparition ne peut appartenir qu’à l’événement d’apparition précédent.

Le temps entre les deux transitions est la durée de vie du canal. Dans les cas où les transitions de canal se produisent trop près pour être distinguées, vous devez attribuer manuellement des apparences et des disparitions. L’affectation est plus complexe si vous avez deux canaux ou plus qui conduisent simultanément, car vous ne savez plus quelle disparition de canal appartient à quelle apparence de canal.

Pour cette raison, il est préférable d’avoir une faible activité de canal. Vous pouvez résoudre le problème de l’attribution en utilisant un générateur de nombres aléatoires pour attribuer des apparences aux disparitions. Ainsi, vous vous retrouvez avec une série de durées de vie de canaux.

Ceci est converti en un histogramme de durée de vie, qui est à son tour converti en un graphique de survie, déterminez la durée de vie moyenne en ajustant une distribution exponentielle unique au graphique de survivant à l’aide d’un ajustement de courbe de carrés loués non linéaires et d’expériences où la grande membrane ne se brise pas. Lorsque vous ajoutez le modificateur bicouche, on peut comparer l’effet sur les taux d’apparition des canaux. Une telle comparaison n’est pas justifiée si la fonction protéique de la membrane est régulée par la composition lipidique de la membrane cellulaire.

Cette régulation est due à une combinaison d’interactions spécifiques entre les protéines lipidiques et d’interactions plus générales entre la bicouche lipidique et les protéines membranaires. Ces interactions sont particulièrement importantes dans la recherche pharmacologique. Comme de nombreux produits pharmaceutiques actuels sur le marché sont des amphi qui peuvent modifier les propriétés de la bicouche lipidique, ce qui peut à son tour entraîner une altération de la fonction des protéines membranaires.

Les canaux de Gramin peuvent être utilisés comme transducteurs de force moléculaire pour signaler si les amphiphiles peuvent modifier les propriétés de la bicouche lipidique. Tracer les changements de durée de vie et de taux d’apparition en fonction du modificateur. La concentration donne un aperçu des changements dans les propriétés bicouches.

L’augmentation de la fréquence signifie que la bicouche est plus facilement déformée pour s’adapter au site de Gram et à la dimérisation. L’augmentation de la durée de vie signifie que la déformation bicouche associée à la formation de canaux n’est pas aussi coûteuse en énergie. Un modificateur peut augmenter la fréquence et la durée de vie en augmentant l’élasticité de la membrane ou en affectant la courbure.

Nous avons maintenant montré comment utiliser les canaux chromo pour vérifier si de petites molécules modifient les propriétés de la bicouche élastique. Et c’est tout. Merci d’avoir regardé.

Bonne chance dans vos expériences.