Name: Préparation de bicouches artificielle pour des expériences délectrophysiologie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-31T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Apprenez la préparation de bicouches lipidiques planaires pour l'étude des canaux ioniques en électrophysiologie. Cette méthode détaille le montage de la chambre, les électrodes et les techniques de nettoyage essentielles.

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Les auteurs n'ont rien à divulguer.

préparation de bicouches artificielle pour des expériences d&#39;électrophysiologie

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Bicouches lipidiques planes, aussi appelé bicouches lipidiques artificielles, vous permettent d&#39;étudier les canaux ioniques mener dans un environnement bien défini. Ces bicouches peuvent être utilisés pour de nombreuses études différentes, telles que la caractérisation de peptides membranaires actifs, la reconstitution des canaux ioniques ou des enquêtes sur la façon dont les changements dans les propriétés de bicouche lipidique altérer la fonction de bicouche-enjambant les canaux. Ici, nous montrons comment former une bicouche planaire et la façon d&#39;isoler de petites parcelles de la bicouche, et dans une seconde vidéo sera également démontrer une procédure pour l&#39;utilisation de canaux de gramicidine pour déterminer les changements dans les propriétés élastiques bicouche lipidique. Nous démontrons également les différentes étapes nécessaires pour préparer la chambre de bicouche, les électrodes et comment tester que le bicouche est adapté à un seul canal de mesure.

Bicouches lipidiques planes, aussi appelé bicouches lipidiques artificielles, vous permettent d&#39;étudier les canaux ioniques mener dans un environnement bien défini. Ici, nous démontrons les différentes étapes nécessaires pour préparer la chambre de bicouche, les électrodes et comment tester que le bicouche est adapté à un seul canal de mesure.

Préparation de bicouches artificielle pour des expériences d&#39;électrophysiologie

Les bicouches lipidiques planaires, également appelées bicouches lipidiques artificielles, permettent d'étudier les canaux conducteurs d'ions dans un environnement bien défini. Ces bicouches peuvent...

Bonjour, je suis le Dr. Olaf Anderson du Département de physiologie et de biomécanique du Weill Cornell Medical College à New York. Bonjour, je suis Ruchi Kaur, étudiante en médecine et doctorat dans le laboratoire du Dr. Olaf Anderson. Bonjour, je m'appelle John Kim.Je suis technicien de recherche. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment vous préparer à des expériences sur des canaux uniques dans des bicouches lipidiques simples. Nous allons vous montrer comment préparer la chambre et comment préparer les électrodes Bilayer Punch.Nous avions l'habitude d'isoler les petites zones de membrane où nous effectuons les mesures. Commençons donc. Notre dispositif électrophysiologique se compose des éléments suivants : une table antivibrations suspendue dans l'air afin de minimiser les vibrations mécaniques, une cage de Faraday pour se protéger contre les bruits électriques, les sons et les vibrations, ainsi qu'un support.Pour la chambre bilaminée, nous utilisons une veste à eau circulante pour le contrôle de la température, dans laquelle la chambre bilaminée est placée, ainsi qu'un micromanipulateur pour monter l'étage d'extrémité de l'amplificateur de patch-clamp. Une unité de filtrage électronique est utilisée pour filtrer davantage le signal de sortie de l'amplificateur de patch-clamp à 500 hertz. Pour visualiser les transitions de courant, un oscilloscope est utilisé afin d'afficher le signal de courant, à la fois la sortie de l'amplificateur de patch-clamp et celle du filtre électronique.Enfin, vous aurez besoin d'un ordinateur équipé d'un système d'acquisition de données qui numérise le signal du patch clamp. À 20 kilohertz, nous utilisons un logiciel développé en interne pour l'enregistrement et l'analyse des données. Tous les équipements sont mis sous tension 20 minutes avant le début des travaux.Ensuite, nous allons préparer la chambre dans laquelle les expériences sont réalisées. La chambre est divisée en deux moitiés par un septum, constitué d'une fine feuille de téflon d'environ 100 microns d'épaisseur et remplie d'une solution électrolytique. Nous formons la bicouche sur le trou présent dans le septum, ce qui permet la connexion entre les solutions électrolytiques.Le trou doit avoir un diamètre compris entre un et 1,5 millimètre. En utilisant de la vaseline comme produit d'étanchéité, placez une fenêtre en verre dans la moitié avant de la chambre en téflon, faites passer des vis en acier inoxydable à travers une entretoise métallique et les quatre trous situés dans la moitié arrière de la chambre. En utilisant de la vaseline comme produit d'étanchéité, placez une cloison circulaire en téflon de manière qu'elle soit prise en sandwich entre les deux moitiés de la chambre assemblée.Veillez à ce que le trou dans la cloison soit centré. Appliquez de la vaseline sur les deux faces de la cloison afin de garantir l'étanchéité des compartiments d'électrolyte et leur isolation électrique. Continuez à passer les vis à travers la moitié avant de la chambre et l'armature métallique avant.Serrer l'assemblage afin de garantir que toutes les composantes soient fermement maintenues en place, sans toutefois trop serrer pour permettre le nettoyage de la chambre et le retrait de la vaseline. Une pipette Pasteur est chauffée, polie et courbée à angle droit. Chauffer et polir la pipette jusqu'à obtenir une extrémité lisse permet d'éviter d'abîmer le verre ou le téflon.Ensuite, nettoyez la chambre avec un mélange de chloroforme et de méthanol en proportion de deux pour un, ou avec la solution fch. À l’aide de la pipette, retirez l’excès de vaseline avec la solution fch sans l’étaler sur tout le téflon et le verre. Utilisez au moins 10 volumes de fch.Une fois cette étape terminée, des barreaux d'agitation magnétiques sont ajoutés aux chambres. Ensuite, nettoyez les chambres avec de l'éthanol à 95 %. Et enfin, avec de l'eau de haute pureté, soit de l'eau distillée, de l'eau UE ou un équivalent.Comme précédemment, utilisez une pastille à feu polie, votre pipette pour aspirer le liquide. Enfin, répétez le nettoyage avec de l'éthanol FCH et de l'eau. Puis de l'eau, de l'éthanol et du fol.Nous allons maintenant fabriquer la micro-pipette en verre servant d'électrode, qui assurera la connexion électrique avec le compartiment arrière de la chambre. À l'aide d'un micropipeteur P-97 Flaming/Brown de Sutter Instruments, nous tirons la capillaire en verre afin d'obtenir deux micro-pipettes, chacune présentant une pointe fine et un tronçon court. Nous utilisons des capillaires en verre borosilicaté dont le diamètre externe est de 0,8 millimètre et le diamètre interne de 0,5 millimètre. Une capillaire en verre est insérée dans le micropipeteur et fixée en vue du tirage du filament.Le polar devrait être en platine, car nous n'avons pas obtenu de succès. Tirer les pipettes dans des polars d'électrodes avec des filaments en tungstène ; les prochaines étapes seront effectuées à l'aide d'un micro-four équipé d'un filament en platine. Avant d'utiliser le micro-four, vous devez vous assurer que le filament est bien recouvert de verre. Vous pouvez utiliser soit un verre doux au silicate de soude, soit un verre dur au borosilicate. Vous devrez régler la chaleur de votre micro-fourneau afin que le verre s'écoule régulièrement et recouvre le filament uniformément d'une couche fine. Placez maintenant la micropipette dans le micro-fourneau et cassez l'extrémité.Nous procédons en ramollissant délicatement la gaine de verre du filament à une température relativement basse. Ensuite, vous déplacez doucement l'extrémité de la micropipette vers la gaine de verre du filament afin que les deux fondent ensemble, puis vous éteignez la chaleur du filament, qui se rétracte et provoque la rupture de la pipette. Nous obtenons ainsi une ouverture fine et régulière d'environ 30 microns de diamètre.Encore une fois, à l'aide du micro-foret, créez un coude à angle droit dans la micropipette à trois ou quatre millimètres de l'extrémité, placez la pipette à quelques centaines de microns au-dessus du filament, puis allumez la chaleur afin que le filament devienne rouge. Le filament se déplacera en raison de la dilatation thermique. Abaissez ensuite doucement la pipette sur le filament et celui-ci s'inclinera.Vous contrôlez l'ampleur de la courbure en ajustant la chaleur du filament. Lorsque la courbure atteint environ 80 degrés, vous déplacez rapidement la pipette vers le haut et vers l'avant. Cela nécessite une certaine coordination.Vous souhaitez obtenir un coude de 90 degrés en utilisant les mêmes paramètres. Polissez la pointe de la micropipette à la flamme, en veillant à ce que le filament reste recouvert de verre. Nous silanisons maintenant la pointe de la pipette avec une solution à 10 % de tri-octylsilène dans le benzène.Cela rend la surface de la pipette hydrophobe afin qu'elle interagisse correctement avec la membrane. Laissez la solution remonter par capillarité de quelques millimètres à l'intérieur de la pipette. Évaporez le solvant à l'aide du micro-four à faible température et vous avez terminé.Maintenant, nous allons vous montrer comment préparer l'électrode en argent. Prenez un morceau de fil d'argent d'environ cinq centimètres de long et d'un millimètre de diamètre. Enroulez-le trois à quatre fois en une bobine ayant un diamètre intérieur de deux à trois millimètres.Gardez le reste en tant que queue qui s'incurve de manière à former un angle droit avec l'hélice. Recouvrez la queue et les cinq à dix millimètres adjacents du fil d'argent de chlorure d'argent fondu. Préparez maintenant la solution de formation du bicouche.Dans notre cas, le lipide dial phosphatidylcholine se trouve dans le décane. Le lipide est conservé dans des tubes en verre à moins 40 degrés Celsius sous forme de 150 microlitres d'aliquots de lipide et de chloroforme. Prenez un tube en verre du congélateur, laissez-le atteindre la température ambiante, puis faites évaporer le chloroforme sous un courant d'azote sec.Dans une hotte chimique, ajoutez 50 microlitres de décane terminal et vortexez. Afin d'obtenir un bon contact entre la solution formant la bicouche et le téflon entourant le trou sur lequel nous formons la bicouche, nous repeignons la cloison en téflon autour du trou. Tout d'abord, nettoyez une pipette Pasteur polie au feu avec du fch.Plongez ensuite la pipette nettoyée dans du phospholipide à 2,5 % dans l'undécane, en laissant le lipide monter d'environ un millimètre à l'intérieur de la pipette. Déposez une goutte de lipide sous forme de film sur le trou dans la paroi en téflon. Laissez sécher le lipide pendant environ 10 à 15 minutes et répétez l'opération.Bonjour.Aujourd'hui, nous vous avons montré comment préparer des bicouches lipidiques pour des expériences sur des canaux unitaires. Dans la vidéo accompagnante, nous vous montrerons comment isoler de petits fragments de membrane, comment enregistrer l'activité de canaux unitaires, comment modifier cette activité à l'aide de petites molécules, et comment analyser les résultats. Très bien, c'est tout.Merci d'avoir regardé. Bonne chance avec votre expérience.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Soutenu bicouches planaires sont des outils puissants qui peuvent être utilisés pour modéliser les interactions moléculaires dans une synapse immunologique. Ici, nous montrons des méthodes pour l'ancrage des protéines d'adhésion cellulaire connue pour moduler la formation des synapses au feuillet supérieur de la bilyer lipides et de visualiser la formation des synapses en microscopie TIRF.

Soutenu bicouches planaires pour la formation des synapses immunologiques Etude de et Kinapse

Fonction de la protéine membranaire est réglementé par la composition lipidique des cellules à membrane. Cette vidéo détaille-article comment la forme d'un patch correctif en utilisant des électrodes bicouche, ainsi que la façon d'utiliser les canaux de gramicidine en tant que reporters des propriétés des membranes modifiées.

Méthodes Single Molecule pour surveiller les changements dans les propriétés élastique bicouche

Procédures pour les reconstitution complète d'un canal de de potassium tension-à déchenchements périodiques prototype dans des membranes de lipides sont décrits. Les canaux reconstitués sont adaptés à des dosages biochimiques, les enregistrements électriques, le dépistage du ligand et des études cristallographiques d'électrons. Ces méthodes peuvent avoir des applications générales aux études structurales et fonctionnelles d'autres protéines membranaires.

Reconstitution d&#39;un canal Kv dans les membranes lipidiques des études structurales et fonctionnelles

Canaux mécanosensibles bactériennes peuvent être utilisés comme capteurs dans des dispositifs mécano biomoléculaires. Bicouches gouttelettes d'interface (DIB), blocs de construction inspiré de cellule à ces dispositifs, représentent de nouvelles plateformes pour intégrer et stimuler les canaux mécanosensibles. Ici, nous démontrons une nouvelle méthode de formation de DIB, permettant l'étude des canaux mécanosensibles sous stimulation mécanique basé micropipette.

Multifonctionnel, Micropipette à base Méthode de constitution et la stimulation de la société Bacterial mécanosensible Canaux ioniques en gouttelettes interface Bilayers

Nous démontrons un système stockable, transportable lipidique formation bicouche. Une membrane lipidique à deux couches peut être formée à l'intérieur de 1 heure avec un taux de succès supérieur à 80% lors d'un précurseur de membrane congelée est ramené à température ambiante. Ce système permettra de réduire les processus laborieux et expertise associés aux canaux ioniques.

Formation automatisée Lipid bicouche Membrane Utilisation d&#39;un Thin Film Polydiméthylsiloxane

Nous présentons ici un protocole pour la formation des bicouches lipidiques en utilisant une méthode de bicouche contacter bulle. Une bulle d’eau est soufflée dans un solvant organique, par laquelle il se forme une monocouche à l’interface eau-huile. Deux pipettes sont manipulés pour ancrer les bulles pour former une bicouche.

Bicouche lipidique expérimente le Contact bulle bicouches pour Patch-colliers

Doux, faible puissance, biomoléculaire memristors tirer parti même composition, structure et mécanismes de bio-synapses de commutation. Présenté ici un protocole d’assembler et de caractérisation biomoléculaire memristors provient des bicouches lipidiques formés entre les gouttelettes d’eau dans l’huile d’isolation. L’incorporation des résultats de peptides activés par tension alaméthicin memristive conductance ionique à travers la membrane.

Assembly and Characterization of Biomolecular Memristors consistant en des Membranes lipidiques dopé au canal ionique

Ce protocole détaille l’utilisation d’un système de chauffage à température contrôlée par rétroaction pour promouvoir l’assemblage de monocouche lipidique et la formation de bicouches d’interface de gouttelettes pour les lipides avec des températures de fusion élevées, ainsi que des mesures de capacité pour caractériser les changements induits par la température dans la membrane.

Ensemble à température contrôlée et caractérisation d’une bicouche d’interface de gouttelettes

Ce protocole décrit la formation de cellules imitant les vésicules unilipidiques et multilipidiques, les bicouches lipidiques soutenues et les bicouches lipidiques en suspension. Ces modèles in vitro peuvent être adaptés pour incorporer une variété de types de lipides et peuvent être utilisés pour étudier diverses interactions entre molécules et macromolécules.

Assemblage de modèles de bicouches lipidiques supportées et suspendues imitant des cellules pour l’étude des interactions moléculaires

Ici, un protocole pour effectuer et analyser la liaison, la mobilité et l’assemblage de molécules uniques sur des membranes lipidiques artificielles encombrées à l’aide de la microscopie à fluorescence interne totale à molécule unique (smTIRF) est présenté.

Diffusion et assemblage d’une molécule unique sur des membranes lipidiques encombrées de polymères

Un protocole expérimental est présenté pour assembler, stimuler électriquement et analyser les bicouches d’interface de gouttelettes dopées à la gramicidine A. Les relations structure-fonction lipide-protéine sont quantifiées en mesurant les variations de la surface membranaire, du flux ionique et de la conductance à canal unique, et en reliant ces réponses à des changements de conduction ionique similaires à la plasticité dans un modèle membranaire inspiré par des synapses électriques.

Caractérisation de la structure et de la fonction membranaire lipide-protéine à l’aide de bicouches d’interface de gouttelettes

Apprenez la préparation de bicouches lipidiques planaires pour l'étude des canaux ioniques en électrophysiologie. Cette méthode détaille le montage de la chambre, les électrodes et les techniques de nettoyage essentielles.

Préparation de bicouches artificielle pour des expériences d'électrophysiologie

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