Cytométrie en flux et tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) : isolement des lymphocytes B spléniques

Le système immunitaire protège l’organisme contre les agents pathogènes envahissants en générant des leucocytes, également appelés globules blancs. Lorsqu’un agent pathogène réussit à infecter un organisme, une grande variété de leucocytes sont activés et cette réaction coordonnée est appelée réponse immunitaire.

Souvent, il est utile pour les chercheurs d’être en mesure d’identifier le type et le nombre spécifiques de cellules immunitaires qui ont été activées en réponse à un agent pathogène. La cytométrie en flux est une technique qui permet aux chercheurs de séparer les cellules en fonction d’épitopes spécifiques exprimés à leur surface. Ceci est accompli à l’aide d’anticorps monoclonaux marqués au fluorochrome qui se lient à des épitopes spécifiques connus des cellules immunitaires, et lors de l’excitation, ces fluorochromes liés émettent une longueur d’onde de lumière qui peut être détectée et notée par un cytomètre en flux.

Les cytomètres en flux sont composés de trois systèmes. Le système fluidique transporte les cellules dans un flux de sorte qu’elles passent une par une devant un laser. Le système optique est composé de lasers et de détecteurs qui reconnaissent la présence ou l’absence des fluorophores. Enfin, le système électronique convertit les données optiques collectées en fichiers électroniques pour analyse.

Une extension de la cytométrie en flux est le trieur de cellules activé par fluorescence, ou FACS, qui permet d’enrichir des populations cellulaires spécifiques afin qu’elles puissent être étudiées indépendamment. Le tri des cellules est effectué à l’aide d’une buse vibrante à l’intérieur du flux fluidique qui forme des microgouttelettes, chacune contenant une seule cellule. Ensuite, un détecteur détermine si une lumière fluorescente est émise ou non par chaque gouttelette, et sur la base de cette information, un électroaimant donne à chaque cellule une charge négative ou positive. Ensuite, un puissant champ électrique trie les gouttelettes chargées différemment dans des récipients séparés. En fin de compte, l’un des conteneurs contiendra une population homogène de cellules basée sur l’expression d’une molécule spécifique de surface cellulaire.

Dans cette vidéo, vous apprendrez à utiliser la cytométrie en flux pour isoler les leucocytes du tissu de la rate de souris et la FACS pour sélectionner les lymphocytes B.

Pour commencer, mettez des gants de laboratoire et des vêtements de protection appropriés. Ensuite, lavez une paire de ciseaux et de pinces à disséquer d’abord avec un détergent, puis avec de l’éthanol à 70 %, puis séchez-les avec une serviette en papier propre.

Ensuite, ajoutez 49 millilitres de solution saline équilibrée de Hank, ou HBSS, dans un tube de 50 millilitres. Ajoutez un millilitre de sérum de veau fœtal, ou FCS, pour créer une solution HBSS 2 % FCS et mélangez en pipetant doucement de haut en bas environ 10 fois.

Ensuite, placez une souris euthanasiée en position couchée sur une plaque de dissection. À l’aide des ciseaux et de la pince, effectuez une laparotomie longitudinale pour accéder à la cavité abdominale. Utilisez la pince pour déplacer les intestins du côté droit de l’abdomen d’un côté afin d’exposer l’estomac et la rate. La rate est attachée à l’estomac. Ensuite, à l’aide d’une pipette, placez cinq millilitres de HBSS 2 % FCS dans une boîte de Pétri. À l’aide d’une pince, détachez soigneusement la rate de l’estomac et placez la rate dans la boîte de Pétri.

Pour isoler les cellules immunitaires, placez d’abord la rate sur une passoire cellulaire de 40 microns dans une boîte de Pétri. Écrasez la rate à l’aide d’un piston pour la dissocier dans le plat. Ensuite, pipetez la rate dissociée et le liquide de la boîte de Pétri dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Centrifugez le tube à 370 fois g pendant sept minutes à 10 degrés Celsius, puis récupérez le tube avec précaution pour ne pas déranger la pastille.

Maintenant, retirez le surnageant, en évitant la pastille, et jetez le liquide dans un récipient à déchets approprié. Ensuite, ajoutez deux millilitres de tampon de lyse ACK dans le tube à centrifuger pour remettre en suspension et lyser les érythrocytes. Attendez deux minutes puis ajoutez HBSS 2 % FCS pour obtenir un volume total de 15 millilitres. Répétez la centrifugation. Récupérez le tube avec précaution et jetez le surnageant. Remettez le granulé en suspension dans cinq millilitres de HBSS 2 % FCS.

Pour compter les cellules remises en suspension, diluez cinq microlitres de suspension cellulaire avec cinq microlitres de Trypan Blue. Ensuite, déposez délicatement une goutte de cinq microlitres de cette suspension cellulaire diluée entre le verre de protection et la lame Malassez. Maintenant, sous un microscope à un grossissement de 40X, comptez le nombre de cellules présentes. Ensuite, ajustez la concentration cellulaire à 10 à la septième cellule par millilitre en ajoutant le volume approprié de HBSS 2 % FCS.

Pour colorer les cellules immunitaires, commencez par marquer six tubes FACS de un à six. Ensuite, transférez 200 microlitres de la solution cellulaire dans chacun des six tubes. Centrifugez ces tubes à 370 fois g pendant sept minutes à 10 degrés Celsius et retirez le surnageant.

Ensuite, étiquetez six nouveaux tubes FACS de un à six et pipetez 200 microlitres de HBSS 2 % FCS dans chacun. Préparez les six nouveaux mélanges d’anticorps en ajoutant la quantité appropriée d’anticorps dans chaque tube conformément au tableau un. Le mélange est pour les cellules non colorées sans ajout d’anticorps. Les mélanges de deux à cinq contiennent chacun un seul anticorps différent pour les paramètres de compensation. Le mélange six contient les quatre anticorps pour les cellules multi-colorées à utiliser pour le tri.

Ensuite, transférez ces mélanges d’anticorps dans les tubes FACS numérotés correspondants. Incuber ces solutions pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius ou sur de la glace dans l’obscurité. Ensuite, ajoutez un millilitre de HBSS 2 % FCS dans chaque tube, puis centrifugez à nouveau. Jetez le surnageant puis remettez les granulés en suspension dans 200 microlitres de HBSS 2 % FCS. Enfin, transférez les granulés remis en suspension dans de nouveaux tubes FACS étiquetés.

Pour effectuer le FACS, allumez d’abord le trieur. Ensuite, sélectionnez le menu du cytomètre et cliquez sur Démarrage de la fluidique. Suivez les instructions à l’écran.

Dans l’onglet du flux, cliquez sur la croix rouge pour allumer le flux, puis attendez 15 minutes pour que le flux se stabilise. Ajustez l’amplitude du flux jusqu’à ce qu’une goutte claire et détachée apparaisse dans l’onglet du flux. Ensuite, cliquez sur sweet spot pour terminer le réglage de l’amplitude. Insérez le filtre à densité neutre, ou ND, 1.0 devant le laser.

Ouvrez le menu du cytomètre en haut de l’écran et sélectionnez CST, qui signifie Configuration et suivi du cytomètre. Pour effectuer un contrôle de qualité quotidien, diluez d’abord les billes de CST avec du milieu FACS dans un tube FACS en suivant les instructions du fabricant. Ensuite, chargez le tube dans la machine et effectuez le contrôle CST en cliquant sur exécuter dans l’onglet CST.

Lorsque le contrôle CST est terminé, remplacez le filtre ND 1.0 par le filtre ND 2.0 sur le cytomètre. Ensuite, diluez les billes de retard de chute dans un milieu FACS en suivant les instructions du fabricant, puis chargez le tube dans le FACS. Pour assurer un tri correct, effectuez un délai de chute en cliquant d’abord sur la tension, puis sur le filtre optique. Le quadrant droit du filtre optique doit être égal à 100 %, ce qui indique que 100 % des gouttes sont enregistrées par la machine. Si nécessaire, ajustez la vis laser rouge sur le cytomètre à gauche ou à droite pour obtenir 100 % dans le quadrant droit. Il est important de s’assurer que le jet tombe dans le tube de collecte. Pour ce faire, effectuez un tri d’essai en cliquant sur tiroir à déchets puis tri d’essai. Vérifiez que les jets latéraux tombent dans les tubes de collecte. Si ce n’est pas le cas, ajustez la tension sous l’onglet de tri jusqu’à ce qu’ils le fassent.

Naviguez jusqu’au modèle expérimental en sélectionnant l’onglet du navigateur et en cliquant sur vue partagée. Ensuite, ouvrez l’expérience Accudrop_DROP DELAY et cliquez sur le bouton de mise en page de tri. Maintenant, modifiez le taux de seuil sur le tableau de bord d’acquisition en manipulant le débit jusqu’à ce qu’il atteigne 3 000 événements par seconde. Cliquez sur tension, puis sur Filtre optique. Le quadrant gauche doit être égal à zéro et le quadrant droit égal à 100.

Enfin, dans la fenêtre de mise en page de tri, cliquez sur trier, puis sur Annuler. Le quadrant gauche doit être égal à 100 et le quadrant droit égal à zéro. Si le quadrant gauche est inférieur à 95, cliquez sur retard automatique pour indiquer au logiciel d’augmenter automatiquement la tension afin d’obtenir 100 % des baisses dans le quadrant gauche.

Pour commencer la cytométrie en flux, nous utiliserons d’abord des cellules non colorées pour définir la morphologie cellulaire et les pics négatifs des fluorochromes. Pour ce faire, placez le tube un contenant des cellules non colorées dans la machine et sous l’onglet du tableau de bord d’acquisition, cliquez sur charger. Dans l’onglet cytomètre, ajustez les tensions de diffusion directe et latérale jusqu’à ce que vous voyiez votre population cellulaire comme une concentration dense de points à l’écran. Les lymphocytes sont de petites cellules, ils auront donc une faible diffusion vers l’avant et une faible diffusion latérale.

Ensuite, supprimez la fluorescence de fond en ajustant la tension des fluorochromes dans l’onglet du cytomètre jusqu’à ce que les populations cellulaires à un niveau négatif soient dans la première décennie de l’onglet de la feuille de calcul globale. Dans le menu du cytomètre, cliquez sur afficher la configuration et vérifiez que tous les fluorochromes sont présents. Ensuite, placez le tube deux dans le cytomètre et cliquez sur charger. Ajustez le chevauchement spectral dans l’onglet du cytomètre jusqu’à ce que les médianes de population négatives et positives soient alignées dans l’onglet de la feuille de calcul globale. Dans l’onglet acquisition, définissez le paramètre événements à enregistrer sur 10 000 et cliquez sur enregistrer. Répétez ces étapes avec les tubes trois, quatre et cinq.

Ensuite, chargez le tube six qui contient les cellules multi-colorées. Pour isoler les lymphocytes B, il faut d’abord paramétrer les cellules en fonction de leur morphologie. Dans la première fenêtre, tracez la zone de diffusion vers l’avant FSC-A sur l’axe des y et la zone de diffusion latérale SSC-A sur l’axe des x. Dans le nuage de points, chaque point représente une cellule. Cliquez sur la porte polygonale dans la feuille de calcul globale, puis sélectionnez la population avec une faible dispersion vers l’avant et une dispersion latérale intermédiaire. Sur une nouvelle fenêtre de graphique à points, cliquez avec le bouton droit de la souris sur la fenêtre et sélectionnez Afficher les populations dans le menu, puis cliquez sur P1.

Ensuite, dans la nouvelle fenêtre, repérez les cellules CD45 positives viables en traçant la viabilité sur l’axe des y et CD45 sur l’axe des x. Utilisez la porte polygonale pour entourer les cellules avec une faible viabilité et un signal CD45 élevé et sélectionnez P2 pour afficher les cellules sélectionnées dans une nouvelle fenêtre. Dans la fenêtre suivante, recherchez les leucocytes CD45 positifs, à l’exclusion des lymphocytes T. Avec CD45 sur l’axe des x et CD3 sur l’axe des y, encerclez la population avec un signal CD45 élevé et un signal CD3 négatif faible et sélectionnez P3. Enfin, recherchez les cellules CD19 positives qui identifient les lymphocytes B. Avec CD19 sur l’axe des y et CD3 sur l’axe des x, encerclez la population avec un signal CD19 élevé et un signal CD3 négatif faible et sélectionnez P4.

Tous les paramètres de tri sont maintenant définis. Ensuite, dans la fenêtre de mise en page de tri, sélectionnez la population cellulaire qui vous intéresse - P4, qui est la quatrième population qui a été fermée, et indique à la machine de trier uniquement les lymphocytes B. Définissez les événements cibles sur 10 000 cellules et la précision sur la pureté. Nous ne trions qu’une seule population. Cependant, jusqu’à quatre populations différentes peuvent être triées en même temps. Une fois prêt, cliquez sur trier et OK. Ensuite, attendez le tri des cellules.

Une fois le tri des cellules terminé, effectuez un contrôle de pureté en pipetant 10 microlitres des cellules triées dans un nouveau tube FACS avec 90 microlitres de HBSS 2 % FCS. Placez le tube dans le cytomètre, cliquez sur charger, puis sur enregistrer pour analyser les phénotypes des cellules afin de vérifier que la stratégie de déclenchement a fonctionné comme prévu.

Maintenant, nous allons analyser les cellules triées pour déterminer le pourcentage de lymphocytes B parmi les leucocytes qui ont été isolés de la rate de souris. Pour commencer, double-cliquez sur l’icône FlowJo et faites glisser les fichiers de chaque tube dans la fenêtre de tous les échantillons.

Cliquez sur polygone et recréez les stratégies de contrôle utilisées dans la section précédente. Ensuite, cliquez sur l’éditeur de mise en page et faites glisser les populations de lymphocytes B d’intérêt du tube six et le contrôle de pureté dans l’onglet de l’éditeur de mise en page. Des diagrammes à points représentant les lymphocytes B apparaîtront. Dans cet exemple, le graphique en haut à droite représente les lymphocytes B triés à partir de la suspension totale de cellules de rate et le graphique en bas à droite est le contrôle de la pureté. Les cellules ne doivent apparaître que dans la population d’intérêt dans le contrôle de la pureté.

Pour vérifier la pureté des lymphocytes B dans les cellules triées, cliquez sur l’éditeur de tableaux. Faites glisser la population de lymphocytes B du tube six et le contrôle de pureté dans le tableau. Dans le menu des statistiques, sélectionnez la fréquence des cellules CD45 positives pour tester la pureté de cette population cellulaire. Ensuite, cliquez sur créer une table. Les valeurs des paramètres apparaissent dans une nouvelle table. Dans la fenêtre de contrôle de pureté, vérifiez la fréquence des lymphocytes B dans les cellules CD45 positives, qui doit être supérieure à 98 %.