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Advanced Biology

Tri cellulaire magnétique (MACS) : isolement des lymphocytes T thymiques

Magnetic Activated Cell Sorting (MACS): Isolation of Thymic T Lymphocytes

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Immunology

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Magnetic Activated Cell Sorting (MACS): Isolation of Thymic T Lymphocytes

5.1: Flow Cytometry and Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS): Isolation of Splenic B Lymphocytes

5.3: ELISA Assays: Indirect, Sandwich, and Competitive

22,743 Views

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11:35 min

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April 30, 2023

Overview

Source: Meunier Sylvain^1,2,3, Perchet Thibaut^1,2,3, Sophie Novault⁴, Rachel Golub^1,2,3
¹ Unité de lymphopoiesis, Département d’immunologie, Institut Pasteur, Paris, France
² INSERM U1223, Paris, France
³ Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Paris, France
⁴ Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Institut Pasteur, Paris, France

La défense contre les agents pathogènes dépend de la surveillance par le système immunitaire. Ce système est complexe et comprend de nombreux types de cellules, chacune ayant des fonctions spécifiques. Cette composition complexe permet des réponses immunitaires à une grande diversité d’agents pathogènes et de blessures. L’immunité adaptative permet des réponses spécifiques contre des agents pathogènes spécifiques. La majorité des cellules responsables de ce type d’immunité sont les lymphocytes (cellules B et lymphocytes T). Habituellement, les cellules B réagissent aux infections extracellulaires (comme les infections bactériennes), et les lymphocytes T réagissent aux infections intracellulaires (comme les infections virales). Les différents types de cellules dans les populations de lymphocytes peuvent être caractérisés par la combinaison de protéines de surface cellulaire qu’ils expriment et / ou par un panneau de cytokines sécrétées.

Le tri magnétique permet l’enrichissement des populations cellulaires ciblées à l’aide de propriétés magnétiques et l’expression d’une ou plusieurs protéines de surface cellulaire (1, 2). Cette technique se compose de trois étapes. Tout d’abord, les cellules sont incubées avec des perles magnétiques qui sont couplées avec un ou plusieurs anticorps monoclonaux spécifiques. Les cellules qui expriment les protéines de surface qui se lient à ces anticorps se fixent aux perles magnétiques. Ensuite, les populations cellulaires ciblées sont capturées avec un aimant. Pour finir, les cellules ciblées sont élifiées de l’aimant. À la fin, deux produits de tri sont obtenus, l’un contenant des cellules non étiquetées et l’autre contenant les cellules cibles couplées avec les perles magnétiques. Les colonnes peuvent être utilisées pour améliorer l’efficacité du tri magnétique. Dans la colonne, un élément non magnétique allonge le chemin de la cellule à travers la colonne. Par conséquent, le flux cellulaire est ralenti, facilitant la capture cellulaire par l’aimant.

Figure 1 : Représentation schématique de la séparation magnétique. Les leucocytes thymiques sont tachés d’anticorps biotinylated anti-CD3. Après le lavage, les perles couplées de streptavidin (SAV) fixent spécifiquement la biotine sur des anticorps anti-CD3. (1) Les cellules sont transférées dans une colonne. (2) L’aimant ne retient pas les cellules non étiquetées, tandis que les cellules CD3-positives restent dans la colonne. Enfin, la colonne est séparée de l’aimant et (3) les cellules CD3-positives sont élucées dans le milieu. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Il existe deux types de tri magnétique (3). Dans le tri positif, les cellules d’intérêt sont capturées avec les perles magnétiques. Dans le tri négatif, les cellules indésirables sont enlevées en capturant avec les perles magnétiques portant les anticorps appropriés. Cette technique MACS permet un bon enrichissement des cellules ciblées et améliore le pourcentage de cellules récupérées de 1-20% à 60-98% dans un organe. Après le tri, il est nécessaire de vérifier la pureté et le tri des cellules par différentes méthodes (par exemple, cytométrie du débit). La technique MACS est idéale pour enrichir une population cible pour d’autres expériences telles que la culture cellulaire ou l’analyse du cycle cellulaire.

Dans cet exercice de laboratoire, nous démontrons comment isoler les leucocytes thymiques et par la suite enrichir les cellules thymiques CD3-positives du mélange en utilisant la technique de tri de cellules magnétiques.

Procedure

1. Préparation

Avant de commencer, enfilez des gants de laboratoire et des vêtements de protection appropriés.
Laver tous les outils de dissection, d’abord avec un détergent, puis avec 70% d’éthanol, puis les sécher avec un essuie-tout propre.
Préparer 200 ml de solution de sel équilibrée de Hank (HBSS) contenant 2 % de sérum fœtal de veau (FCS).

2. Dissection

Épingler une souris euthanasiée sur une plaque de dissection en position de supine.
À l’aide de ciseaux et de forceps, effectuez une laparotomie longitudinale pour accéder à la cavité thoracique.
Retirez le cœur pour avoir accès au thymus, qui est situé au-dessus du cœur. Ensuite, identifier le thymus, qui est composé de deux lobes blancs et est situé dans la cavité thoracique au-dessus du cœur.
À l’aide de forceps, détachez soigneusement le thymus et placez-le sur le plat Petri avec 5 ml de HBSS 2% FCS.

3. Isolement des cellules immunitaires

Déposer le thymus sur une passoire cellulaire de 40 m sur le même plat Petri. Écraser le thymus avec un piston pour le dissocier dans le même plat.
Transférer le thymus dissocié et le liquide dans un tube centrifugeuse de 15 ml.
Laver le plat Petri avec 5 ml de HBSS 2% FCS et transférer le milieu lavé aussi dans le même tube de centrifugeuse.
Centrifuger le tube à 370 x g pendant 7 min à 20oC et jeter le supernatant en évitant la pastille.
Resuspendre la pastille dans 2 ml d’acétate de potassium pour lyser les érythrocytes. Attendez 2 min, puis faites le volume jusqu’à 14 ml à l’aide de HBSS 2% FCS.
Centrifuger le tube à nouveau à 370 x g pendant 7 min à 20oC. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 5 ml de HBSS 2% FCS.
Estimer la concentration cellulaire à l’aide de l’essai de coloration bleu trypan et ajuster la concentration cellulaire finale à 10⁷ cellules/mL en utilisant le volume approprié de HBSS 2% FCS.

4. Étiquetage magnétique des cellules immunitaires

Prenez deux tubes FACS. Étiqueter un tube, les « lymphocytes T non enrichis », et l’autre tube, les « lymphocytes T enrichis », qui seront séparés à l’aide de l’étiquetage magnétique.
Distribuer la solution cellulaire dans chacun des deux tubes FACS.
Centrifuger le tube des « lymphocytes T enrichis » à 370 x g pendant 3 min à 20 oC et jeter le supernatant en évitant la pastille.
Resuspendre la pastille dans 250 l de mélange d’anticorps biotinylated anti-CD3 (tableau 1, Mix 1).

mélanger	Étiquetage des réactifs	dilution
1	Anticorps biotinylated anti-CD3	1/400 (en HBSS 2% FCS)
2	Perles couplées de Streptavidin	1/5 (en HBSS 2% FCS)
3	Anti-CD3 BV421	1/200 (en HBSS 2% FCS)

Tableau 1 : Composition du mélange d’anticorps. Les mélanges 1 et 2 sont utilisés pour la séparation magnétique. Mix 3 est utilisé pour évaluer l’enrichissement cellulaire après la séparation magnétique.

Incuber le mélange suspension-anticorps cellulaire pendant 15 minutes à 4 oC dans l’obscurité.
Ajouter 3 ml de HBSS 2% FCS aux tubes et les centrifuger à nouveau à 370 x g pendant 3 min à 20oC.
Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 250 perles couplées à la streptavidine (tableau 1, Mix 2).
Incuber le mélange cellulaire et les perles pendant 20 min sur la glace.
Ensuite, ajouter 3 ml de HBSS 2% FCS et bien mélanger et centrifuger à nouveau à 370 x g pendant 3 min à 20oC.
Resuspendre la pastille dans 2 ml de HBSS 2% FCS.

5. Séparation magnétique des cellules CD3-Positives

Placez la colonne sur l’aimant et ajoutez 3 ml de HBSS 2% FCS pour humidifier le système. Attendez 5 minutes.
Ensuite, pipet les cellules étiquetées dans la colonne.
Après que la suspension de cellule passe par la colonne, lavez la colonne X3 fois avec 3 ml de HBSS 2% FCS.
Ensuite, retirez la colonne de l’aimant et placez-la dans un tube de collecte de 15 ml.
Pour éliner les cellules cibles, ajouter 5 mL de HBSS 2% FCS à la colonne et rincer la colonne avec le piston.
Répétez l’étape d’élution avec un autre 5 ml de HBSS 2% FCS.

6. Évaluation de l’enrichissement cible-cellule par cytométrie de flux

Transférer 500 l de suspension de cellules élucées sur un tube FACS étiqueté « cellules T enrichies ». Transférer 200 l de suspension des « lymphocytes T non enrichis » à un deuxième FACS.
Ensuite, centrifuger les deux tubes à 370 x g pendant 7 min à 20oC.
Jeter le supernatant, puis ajouter 100 l d’anticorps fluorescents Mix 3 (voir tableau 1) aux deux tubes.
Incuber les deux tubes pendant 20 min à 4 oC dans l’obscurité.
Ensuite, ajouter 3 ml de HBSS 2% FCS aux tubes et les centrifuger à 370 x g pendant 3 min à 20oC.
Jeter le supernatant, puis resuspendre chaque tube dans 250 L de HBSS 2% FCS.
Maintenant, évaluez le taux d’enrichissement cellulaire CD3-positif par cytométrie de flux.

7. Analyse des données

Ouvrez l’icône ‘FlowJo’ et faites glisser les fichiers pour chaque tube dans la fenêtre “All Sample“.
Double clic sur le fichier “cellules T enrichies” pour afficher l’intrigue de point affichant la diffusion vers l’avant (FSC-A) sur l’axe X et la diffusion latérale (SSC-A) sur l’axe Y.
Cliquez sur “Polygone” pour faire le tour des populations de lymphocytes.
Ensuite, double clic sur la population encerclée pour créer une nouvelle fenêtre.
Sélectionnez “FSC-W” sur l’axe Y et “FSC-A” sur l’axe X, et encerclez les cellules négatives FSA-W. Dans la fenêtre “Inpopulation identification“, nommez la population cellulaire “cellules uniques”.
Double clic sur la population encerclée pour créer une nouvelle fenêtre. Sélectionnez «CD3» sur l’axe Y et encerclez les cellules CD3-positives. Dans la fenêtre “Sous-population d’identification” nom de votre population cellulaire “cellules T”.
Répétez l’opération avec les « lymphocytes T non enrichis ».
Pour visualiser la population cellulaire, cliquez sur “Layout editor” et faites glisser la population de “lymphocytes T” des fichiers ” cellules T enrichies ” et ” cellules T non enrichies ” dans l’onglet.
Des parcelles de points représentant les lymphocytes CD3MD apparaîtront. Les cellules CD3MD ne devraient apparaître que dans la population d’intérêt dans le tube enrichi CD3MD.
Pour évaluer l’enrichissement des lymphocytes CD3MD dans les cellules triées, cliquez sur « Éditeur detable», puis faites glisser la population de « lymphocytes T » à partir de fichiers « cellules T enrichies » et « cellules T non enrichies » dans le tableau.
Sur le menu “Statistique“, sélectionnez “Fréquence des lymphocytes” cellules pour vérifier le pourcentage de cellules CD3 dans tous les lymphocytes, puis cliquez sur “Create table“.
Les valeurs de paramètres apparaîtront dans un nouveau tableau. Pour les « lymphocytes T enrichis », la fréquence des cellules CD3 MD devrait être d’environ 80 %.

Le tri des cellules activées par magnétique, ou MACS, est une technique qui permet aux chercheurs de séparer les cellules en fonction d’épitopes spécifiques exprimées sur leurs surfaces.

Le processus commence généralement par l’extraction d’un organe ou d’un tissu, comme le thymus. Ensuite, les cellules sont séparées mécaniquement, généralement par concassage, jusqu’à ce que le tissu soit dissocié en cellules simples. Les cellules indésirables peuvent être enlevées à ce stade par l’ajout de produits chimiques. Par exemple, l’ammonium-chlorure-potassium, ou tampon ACK, peut être utilisé pour lyser les érythrocytes indésirables.

Ensuite, un anticorps conjugué à une molécule appelée biotine est ajouté à la suspension, et ces complexes se lient aux épitopes de la surface des cellules cibles. La biotine a une forte affinité pour une autre molécule appelée streptavidine. Dans l’étape suivante, des molécules de streptavidin fusionnées aux perles magnétiques sont ajoutées aux cellules étiquetées d’anticorps. Lorsque la biotine et la streptavidine entrent en contact, elles se lient étroitement. Le résultat est que les cellules d’intérêt sont recouvertes de perles magnétiques. Ce complexe est parfois appelé un sandwich. Dans ce cas, CD3 sur la membrane cellulaire sur le fond, puis anti-CD3 conjugué à la biotine, et enfin, streptavidin conjugué à des perles magnétiques.

Ces cellules étiquetées peuvent maintenant être placées dans une colonne contenant une matrice qui, assistée par la gravité, permet aux cellules de passer lentement par un aimant. Ce faisant, les cellules étiquetées par perles magnétiques colleront au bord du tube le plus proche de l’aimant, tandis que les cellules non étiquetées continueront dans un tube de collecte ci-dessous. Ensuite, les cellules étiquetées peuvent être retirées de la colonne en enlevant simplement l’aimant, en ajoutant une solution d’éluence, et en appliquant une pression douce avec un piston pour les rincer hors de la colonne et dans un tube de collecte frais. En fin de compte, ce processus permet de récupérer de 60 à 98 % les cellules d’intérêt.

Dans cette procédure, nous allons isoler les leucocytes thymiques d’une souris et utiliser MACS pour trier les lymphocytes T CD3-positifs avant de confirmer l’efficacité du tri à l’aide de FACS.

Pour commencer, mettez tout équipement de protection approprié, y compris une blouse de laboratoire et des gants. Ensuite, lavez une paire de ciseaux et de forceps disséquants avec 70 % d’éthanol et séchez-les avec un essuie-tout propre. Préparez ensuite 200 millilitres de sérum fœtal de veau HBSS 2%, ou FCS, en mélangeant quatre millilitres de FCS avec 196 millilitres de HBSS.

Épingler une souris euthanasiée en position de supine sur une plaque de dissection. À l’aide de ciseaux et de forceps, effectuer une laparotomie longitudinale pour accéder à la cavité thoracique. Tout d’abord, enlever le cœur pour accéder au thymus, qui est situé au-dessus du cœur. Ensuite, identifiez le thymus, qui est composé de deux lobes blancs. À l’aide de forceps, détachez soigneusement le thymus et placez-le sur un plat Petri avec cinq millilitres de HBSS 2% FCS.

Pour isoler les cellules immunitaires, placez d’abord le thymus sur une passoire à cellules de 40 micromètres dans le plat Petri. Écraser le tissu à l’œil d’un piston pour le dissocier dans le plat. Après cela, rincer le piston et la passoire avec HBSS 2% FCS pour récupérer toutes les cellules adhérées. Ensuite, pipette les cellules de thymus dissociés et le liquide de la vaisselle Petri dans un tube centrifugeur de 15 millilitres. Laver le plat Petri avec cinq millilitres de HBSS 2% FCS et transférer cette solution de lavage à la centrifugeuse de 15 litres tube également.

Ensuite, centrifuger le tube à 370 fois g pendant sept minutes à 20 degrés Celsius. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille en deux millilitres de tampon de lysing ACK pour lyser les érythrocytes. Incuber pendant deux minutes à température ambiante sur le dessus du banc. Ensuite, porter le volume à 14 millilitres avec HBSS 2% FCS. Centrifuger le tube à 370 fois g pendant sept minutes à 20 degrés Celsius. Ensuite, jetez le supernatant et resuspendre les cellules en cinq millilitres de HBSS 2% FCS.

Estimer la concentration cellulaire à l’aide d’une diapositive Malassez comme le montre le protocole pour l’isolement FACS des lymphocytes B et ajuster la concentration cellulaire à 10 à la septième cellule par millilitre avec HBSS 2% FCS.

Transférer 500 microlitres de solution cellulaire dans deux tubes FACS. Étiqueter un tube de lymphocytes T non enrichis et les autres lymphocytes T enrichis par tube, qui seront séparés à l’aide de l’étiquetage magnétique.

Centrifuger le tube enrichi de lymphocytes T à 370 fois g pendant trois minutes à 20 degrés Celsius. Jetez le supernatant et resuspendre la pastille dans 250 microlitres de biotine couplée anticorps anti CD3 dilué un sur 400 dans HBSS 2% FCS. Incuber les cellules pendant 20 minutes sur la glace et dans l’obscurité. Ajouter trois millilitres de HBSS 2% FCS aux tubes et les centrifuger à nouveau à 370 fois g pendant trois minutes à 20 degrés Celsius. Jetez le supernatant et resuspendre la pastille dans 250 microlitres de perles couplées à la streptavidine diluées une sur cinq dans LE HBSS 2% FCS. Incuber le mélange de cellules et de perles pendant 20 minutes sur la glace. Ensuite, ajoutez trois millilitres de HBSS 2% FCS au tube, pipette de haut en bas pour mélanger, et centrifugeuse à nouveau à 370 fois g pendant trois minutes à 20 degrés Celsius. Resuspendre la pastille en deux millilitres de HBSS 2% FCS.

Placez la colonne sur l’aimant et ajoutez trois millilitres de HBSS 2% FCS pour humidifier le système. Ensuite, pipette les cellules tachées dans la colonne. Après que la suspension de cellule passe par la colonne, lavez la colonne trois fois avec trois millilitres de HBSS 2% FCS. Ensuite, retirez la colonne de l’aimant et placez-la dans un tube de 15 millilitres. Pour éliner les cellules cibles, ajouter cinq millilitres de HBSS 2% FCS à la colonne et rincer la colonne avec un piston. Répétez cette étape avec un autre cinq millilitres de HBSS 2% FCS.

Pour évaluer l’efficacité de l’isolement cellulaire cible, transférez d’abord 500 microlitres de suspension de cellules élucées à un tube FACS et étiquetez-le enrichi t-cells. Ensuite, centrifuger les tubes enrichis et non enrichis à 370 fois g pendant sept minutes à 20 degrés Celsius. Jeter le supernatant, puis ajouter 100 microlitres d’anticorps fluorescents dilués un sur 200 dans HBSS 2% FCS aux deux tubes. Incuber les cellules pendant 20 minutes sur la glace et dans l’obscurité. Ensuite, ajoutez trois millilitres de HBSS 2% FCS aux tubes et centrifugez-les à 370 fois g pendant trois minutes à 20 degrés Celsius. Jeter le supernatant, puis resuspendre les granulés dans 250 microlitres de HBSS 2% FCS. Maintenant, évaluez le taux d’enrichissement cellulaire CD3-positif utilisant la cytométrie de flux comme indiqué dans le protocole FACS.

Maintenant, nous allons déterminer la fréquence des lymphocytes CD3-positifs parmi tous les thymocytes qui ont été isolés du thymus de souris. Pour commencer, cliquez deux fois sur l’icône FlowJo et faites glisser les fichiers pour chaque tube dans la fenêtre de l’échantillon. Ensuite, double clic sur le fichier de lymphocytes T enrichis pour afficher les cellules enregistrées à partir de cet échantillon sur une parcelle de point qui affiche la diffusion vers l’avant, FSCA, sur l’axe X, et la diffusion latérale, SSCA, sur l’axe y.

Cliquez sur le polygone pour faire le tour des populations de lymphocytes. Ensuite, double clic sur la population encerclée pour créer une nouvelle fenêtre. Sélectionnez FSC-W sur l’axe y, et FSC-A sur l’axe X et encerclez les cellules négatives FSA-W. Dans la fenêtre d’identification des sous-populations, nommez votre population cellulaire Cellules uniques. Ensuite, cliquez sur OK sur la fenêtre d’identification de la sous-population, puis double clic sur la population encerclée pour créer une nouvelle fenêtre. Sélectionnez CD3 sur l’axe y et encerclez les cellules CD3-positives. Dans la fenêtre d’identification des sous-populations, nommez vos lymphocytes T de la population cellulaire. Répétez l’opération avec le fichier de lymphocytes T non enrichis. Pour visualiser votre population cellulaire, cliquez sur Layout Editor et faites glisser la population de lymphocytes T à partir de lymphocytes T enrichis et de fichiers De lymphocytes T non enrichis dans l’onglet.

Des parcelles de points représentant des lymphocytes cD3-positifs apparaîtront. Les cellules CD3-positives devraient seulement apparaître dans la population d’intérêt dans le tube enrichi CD3-positif. Pour évaluer l’enrichissement des lymphocytes positifs CD3 dans les cellules triées, cliquez sur l’éditeur de table, puis faites glisser la population de lymphocytes T à partir de lymphocytes T enrichis et de fichiers de lymphocytes T non enrichis dans le tableau. Sur le menu statistique, sélectionnez Fréquence des cellules lymphocytes pour vérifier le pourcentage de cellules CD3-positives dans tous les lymphocytes. Ensuite, cliquez sur Créer la table. Les valeurs de paramètres apparaîtront dans un nouveau tableau. Pour les lymphocytes T enrichis, la fréquence des cellules CD3-positives devrait être d’environ 80% ou au-dessus.

Results

Dans ce protocole, des cellules CD3-positives ont été enrichies des leucocytes thymiques utilisant le tri de cellules magnétiques (figure 1). Avant l’enrichissement des cellules magnétiques, les cellules CD3-positives représentaient 53,6 % du total des cellules thymiques (figure 2, panneaux supérieurs). Après l’enrichissement des cellules magnétiques, le pourcentage de cellules CD3-positives a augmenté à 95% (figure 2, panneaux inférieurs). Ainsi, MACS est une technique simple, rapide et efficace d’enrichissement cellulaire pour enrichir les populations cellulaires désirées à partir d’un mélange de suspension cellulaire.

Figure 2 : Stratégie de gating et tri des tests de pureté. Les cellules sont d’abord fermées en fonction de leur morphologie (à gauche : FSC-A, SSC-A), puis les cellules sont tracées contre CD3 (à droite : CD3, SSC-A). Le panneau supérieur représente la suspension de cellules de thymus avant l’enrichissement cellulaire. Le panneau inférieur représente la suspension de cellules de thymus après tri de cellules magnétiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Applications and Summary

La technologie de séparation magnétique est une méthode courante pour trier facilement et rapidement une population de cellules cibles. En utilisant des anticorps spécifiques aux lymphocytes T et des perles magnétiques, nous avons enrichi la fréquence des lymphocytes T dans notre échantillon. Le taux de pureté à la fin de l’expérience dépend du pourcentage de cellules cibles dans la suspension cellulaire initiale. Les cellules obtenues après le tri des cellules magnétiques peuvent être utilisées à diverses fins telles que le transfert cellulaire ou l’analyse du cycle cellulaire. Une autre méthode de tri, utilisant la cytométrie de flux, peut être utilisée pour enrichir les cellules. Cette technique donne un taux de pureté très élevé après le tri cellulaire mais il faut plus d’étapes et prend plus de temps.

References

Owen, C. S. and Sykes, N. L. Magnetic labeling and cell sorting. Journal of Immunological Methods. 73 (1), 41-48 (1984).
Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W. and Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).
Plouffe, B. D., Murthy, S. K. and Lewis, L. H. Fundamentals and application of magnetic particles in cell isolation and enrichment: a review. Reports on Progress in Physics. 78 (1), (2014).

Transcript

Magnetic-activated cell sorting, or MACS, is a technique that allows researchers to separate cells based on specific epitopes expressed on their surfaces.

The process typically begins with extraction of an organ or tissue, such as the thymus. Then, the cells are mechanically separated, usually by crushing, until the tissue is dissociated into single cells. Unwanted cells can be removed at this stage via the addition of chemicals. For example, ammonium-chloride-potassium, or ACK buffer, can be used to lyse unwanted erythrocytes.

Next, an antibody conjugated to a molecule called biotin is added to the suspension, and these complexes bind to the epitopes of the surface of the target cells. Biotin has a high affinity for another molecule called streptavidin. In the next step, streptavidin molecules fused to magnetic beads are added to the antibody labeled cells. When the biotin and streptavidin come into contact, they tightly bind. The result is that the cells of interest are coated with magnetic beads. This complex is sometimes referred to as a sandwich. In this case, CD3 on the cell membrane on the bottom, then anti-CD3 conjugated to biotin, and finally, streptavidin conjugated to magnetic beads.

These labeled cells can now be placed into a column containing a matrix which, assisted by gravity, allows the cells to pass slowly by a magnet. As they do so, the magnetic bead-labeled cells will stick to the edge of the tube nearest the magnet, while the non-labeled cells will continue on into a collection tube below. Next, the labeled cells can be removed from the column by simply removing the magnet, adding an eluent solution, and applying gentle pressure with a plunger to flush them out of the column and into a fresh collection tube. Ultimately, this process allows for 60 to 98% retrieval of the cells of interest.

In this procedure, we will isolate thymic leukocytes from a mouse and use MACS to sort out CD3-positive T-cells before confirming the efficiency of sorting using FACS.

To begin, put on any appropriate protective equipment including a lab coat and gloves. Next, wash a pair of dissecting scissors and forceps with 70% ethanol and dry them with a clean paper towel. Then prepare 200 milliliters of HBSS 2% fetal calf serum, or FCS, by mixing four milliliters of FCS with 196 milliliters of HBSS.

Pin a euthanized mouse in a supine position on a dissection plate. Using scissors and forceps, perform a longitudinal laparotomy to access the chest cavity. First, remove the heart to gain access to the thymus, which is located above the heart. Then identify the thymus, which is composed of two white lobes. Using forceps, carefully detach the thymus and place it on a Petri dish with five milliliters of HBSS 2% FCS.

To isolate the immune cells, first place the thymus on a 40 micrometer cell strainer in the Petri dish. Crush the tissue with a plunger to dissociate it into the dish. After this, rinse the plunger and strainer with HBSS 2% FCS to recover any adhered cells. Then, pipette the dissociated thymus cells and fluid from the Petri dish into a 15 milliliter centrifuge tube. Wash the Petri dish with five milliliters of HBSS 2% FCS and transfer this wash solution to the 15 milliliter centrifuge tube also.

Next, centrifuge the tube at 370 times g for seven minutes at 20 degrees Celsius. Discard the supernatant and resuspend the pellet in two milliliters of ACK lysing buffer to lyse the erythrocytes. Incubate for two minutes at room temperature on the bench top. Then, bring the volume to 14 milliliters with HBSS 2% FCS. Centrifuge the tube at 370 times g for seven minutes at 20 degrees Celsius. Then, discard the supernatant and resuspend the cells in five milliliters of HBSS 2% FCS.

Estimate the cell concentration using a Malassez slide as shown in the protocol for FACS isolation of B lymphocytes and adjust the cell concentration to 10 to the seventh cells per milliliter with HBSS 2% FCS.

Transfer 500 microliters of cell solution into two FACS tubes. Label one tube non-enriched T-cells and the other tube enriched T-cells, which will be separated using magnetic labeling.

Centrifuge the enriched T-cells tube at 370 times g for three minutes at 20 degrees Celsius. Discard the supernatant and resuspend the pellet in 250 microliters of biotin coupled anti CD3 antibody diluted one in 400 in HBSS 2% FCS. Incubate the cells for 20 minutes on ice and in the dark. Add three milliliters of HBSS 2% FCS to the tubes and centrifuge them again at 370 times g for three minutes at 20 degrees Celsius. Discard the supernatant and resuspend the pellet in 250 microliters of streptavidin-coupled beads diluted one in five in HBSS 2% FCS. Incubate the mixture of cells and beads for 20 minutes on ice. Next, add three milliliters of HBSS 2% FCS to the tube, pipette up and down to mix, and centrifuge again at 370 times g for three minutes at 20 degrees Celsius. Resuspend the pellet in two milliliters of HBSS 2% FCS.

Place the column on the magnet and add three milliliters of HBSS 2% FCS to humidify the system. Then, pipette the stained cells into the column. After the cell suspension passes through the column, wash the column three times with three milliliters of HBSS 2% FCS. Next, remove the column from the magnet and place it in a 15 milliliter tube. To elute the target cells, add five milliliters of HBSS 2% FCS to the column and flush the column with a plunger. Repeat this step with another five milliliters of HBSS 2% FCS.

To evaluate the effectiveness of target cell isolation, first transfer 500 microliters of eluted cell suspension to a FACS tube and label it enriched T-cells. Then, centrifuge both the enriched and non-enriched tubes at 370 times g for seven minutes at 20 degrees Celsius. Discard the supernatant, then add 100 microliters of fluorescent antibody diluted one in 200 in HBSS 2% FCS to both tubes. Incubate the cells for 20 minutes on ice and in the dark. Next, add three milliliters of HBSS 2% FCS to the tubes and centrifuge them at 370 times g for three minutes at 20 degrees Celsius. Discard the supernatant, then resuspend the pellets in 250 microliters of HBSS 2% FCS. Now, evaluate the CD3-positive cell enrichment rate using flow cytometry as shown in the FACS protocol.

Now, we will determine the frequency of CD3-positive lymphocytes among all thymocytes that were isolated from the mouse thymus. To start, double click on the FlowJo icon and drag the files for each tube in the all sample window. Then, double click on the enriched T-cells file to display the cells recorded from that sample on a dot plot that displays forward scatter, FSCA, on the x-axis, and side scatter, SSCA, on the y-axis.

Click on polygon to circle the lymphocyte populations. Next, double click on the circled population to create a new window. Select FSC-W on the y-axis, and FSC-A on the x-axis and circle the FSA-W negative cells. In the sub population identification window, name your cell population Single Cells. Next, click on OK on the sub population identification window, then double click on the circled population to create a new window. Select CD3 on the y-axis, and circle the CD3-positive cells. In the sub population identification window, name your cell population T-cells. Repeat with the non-enriched T-cells file. To visualize your cell population, click Layout Editor and drag the T-cell population from enriched T-cells and non-enriched T-cells files into the tab.

Dot plots representing CD3-positive lymphocytes will appear. CD3-positive cells should only appear in the population of interest in the CD3-positive enriched tube. To evaluate the enrichment of CD3-positive lymphocytes in the sorted cells, click on Table Editor and then drag the T-cells population from enriched T-cells and non-enriched T-cells files into the table. On the statistic menu, select Frequency of Lymphocyte Cells to check the percentage of CD3-positive cells in all lymphocytes. Then, click on Create Table. Parameter values will appear in a new table. For the enriched T-cells, the frequency of CD3-positive cells should be around 80% or above.

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