Tri cellulaire magnétique (MACS) : isolement des lymphocytes T thymiques

1. Préparation

1. Avant de commencer, enfilez des gants de laboratoire et des vêtements de protection appropriés.
2. Laver tous les outils de dissection, d'abord avec un détergent, puis avec 70% d'éthanol, puis les sécher avec un essuie-tout propre.
3. Préparer 200 ml de solution de sel équilibrée de Hank (HBSS) contenant 2 % de sérum fœtal de veau (FCS).

2. Dissection

1. Épingler une souris euthanasiée sur une plaque de dissection en position de supine.
2. À l'aide de ciseaux et de forceps, effectuez une laparotomie longitudinale pour accéder à la cavité thoracique.
3. Retirez le cœur pour avoir accès au thymus, qui est situé au-dessus du cœur. Ensuite, identifier le thymus, qui est composé de deux lobes blancs et est situé dans la cavité thoracique au-dessus du cœur.
4. À l'aide de forceps, détachez soigneusement le thymus et placez-le sur le plat Petri avec 5 ml de HBSS 2% FCS.

3. Isolement des cellules immunitaires

1. Déposer le thymus sur une passoire cellulaire de 40 m sur le même plat Petri. Écraser le thymus avec un piston pour le dissocier dans le même plat.
2. Transférer le thymus dissocié et le liquide dans un tube centrifugeuse de 15 ml.
3. Laver le plat Petri avec 5 ml de HBSS 2% FCS et transférer le milieu lavé aussi dans le même tube de centrifugeuse.
4. Centrifuger le tube à 370 x g pendant 7 min à 20oC et jeter le supernatant en évitant la pastille.
5. Resuspendre la pastille dans 2 ml d'acétate de potassium pour lyser les érythrocytes. Attendez 2 min, puis faites le volume jusqu'à 14 ml à l'aide de HBSS 2% FCS.
6. Centrifuger le tube à nouveau à 370 x g pendant 7 min à 20oC. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 5 ml de HBSS 2% FCS.
7. Estimer la concentration cellulaire à l'aide de l'essai de coloration bleu trypan et ajuster la concentration cellulaire finale à 10⁷ cellules/mL en utilisant le volume approprié de HBSS 2% FCS.

4. Étiquetage magnétique des cellules immunitaires

1. Prenez deux tubes FACS. Étiqueter un tube, les « lymphocytes T non enrichis », et l'autre tube, les « lymphocytes T enrichis », qui seront séparés à l'aide de l'étiquetage magnétique.
2. Distribuer la solution cellulaire dans chacun des deux tubes FACS.
3. Centrifuger le tube des « lymphocytes T enrichis » à 370 x g pendant 3 min à 20 oC et jeter le supernatant en évitant la pastille.
4. Resuspendre la pastille dans 250 l de mélange d'anticorps biotinylated anti-CD3 (tableau 1, Mix 1).

mélanger	Étiquetage des réactifs	dilution
1	Anticorps biotinylated anti-CD3	1/400 (en HBSS 2% FCS)
2	Perles couplées de Streptavidin	1/5 (en HBSS 2% FCS)
3	Anti-CD3 BV421	1/200 (en HBSS 2% FCS)

Tableau 1 : Composition du mélange d'anticorps. Les mélanges 1 et 2 sont utilisés pour la séparation magnétique. Mix 3 est utilisé pour évaluer l'enrichissement cellulaire après la séparation magnétique.

5. Incuber le mélange suspension-anticorps cellulaire pendant 15 minutes à 4 oC dans l'obscurité.
6. Ajouter 3 ml de HBSS 2% FCS aux tubes et les centrifuger à nouveau à 370 x g pendant 3 min à 20oC.
7. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 250 perles couplées à la streptavidine (tableau 1, Mix 2).
8. Incuber le mélange cellulaire et les perles pendant 20 min sur la glace.
9. Ensuite, ajouter 3 ml de HBSS 2% FCS et bien mélanger et centrifuger à nouveau à 370 x g pendant 3 min à 20oC.
10. Resuspendre la pastille dans 2 ml de HBSS 2% FCS.

5. Séparation magnétique des cellules CD3-Positives

1. Placez la colonne sur l'aimant et ajoutez 3 ml de HBSS 2% FCS pour humidifier le système. Attendez 5 minutes.
2. Ensuite, pipet les cellules étiquetées dans la colonne.
3. Après que la suspension de cellule passe par la colonne, lavez la colonne X3 fois avec 3 ml de HBSS 2% FCS.
4. Ensuite, retirez la colonne de l'aimant et placez-la dans un tube de collecte de 15 ml.
5. Pour éliner les cellules cibles, ajouter 5 mL de HBSS 2% FCS à la colonne et rincer la colonne avec le piston.
6. Répétez l'étape d'élution avec un autre 5 ml de HBSS 2% FCS.

6. Évaluation de l'enrichissement cible-cellule par cytométrie de flux

1. Transférer 500 l de suspension de cellules élucées sur un tube FACS étiqueté « cellules T enrichies ». Transférer 200 l de suspension des « lymphocytes T non enrichis » à un deuxième FACS.
2. Ensuite, centrifuger les deux tubes à 370 x g pendant 7 min à 20oC.
3. Jeter le supernatant, puis ajouter 100 l d'anticorps fluorescents Mix 3 (voir tableau 1) aux deux tubes.
4. Incuber les deux tubes pendant 20 min à 4 oC dans l'obscurité.
5. Ensuite, ajouter 3 ml de HBSS 2% FCS aux tubes et les centrifuger à 370 x g pendant 3 min à 20oC.
6. Jeter le supernatant, puis resuspendre chaque tube dans 250 L de HBSS 2% FCS.
7. Maintenant, évaluez le taux d'enrichissement cellulaire CD3-positif par cytométrie de flux.

7. Analyse des données

1. Ouvrez l'icône 'FlowJo' et faites glisser les fichiers pour chaque tube dans la fenêtre "All Sample".
2. Double clic sur le fichier "cellules T enrichies" pour afficher l'intrigue de point affichant la diffusion vers l'avant (FSC-A) sur l'axe X et la diffusion latérale (SSC-A) sur l'axe Y.
3. Cliquez sur "Polygone" pour faire le tour des populations de lymphocytes.
4. Ensuite, double clic sur la population encerclée pour créer une nouvelle fenêtre.
5. Sélectionnez "FSC-W" sur l'axe Y et "FSC-A" sur l'axe X, et encerclez les cellules négatives FSA-W. Dans la fenêtre "Inpopulation identification", nommez la population cellulaire "cellules uniques".
6. Double clic sur la population encerclée pour créer une nouvelle fenêtre. Sélectionnez «CD3» sur l'axe Y et encerclez les cellules CD3-positives. Dans la fenêtre "Sous-population d'identification" nom de votre population cellulaire "cellules T".
7. Répétez l'opération avec les « lymphocytes T non enrichis ».
8. Pour visualiser la population cellulaire, cliquez sur "Layout editor" et faites glisser la population de "lymphocytes T" des fichiers " cellules T enrichies " et " cellules T non enrichies " dans l'onglet.
9. Des parcelles de points représentant les lymphocytes CD3MD apparaîtront. Les cellules CD3MD ne devraient apparaître que dans la population d'intérêt dans le tube enrichi CD3MD.
10. Pour évaluer l'enrichissement des lymphocytes CD3MD dans les cellules triées, cliquez sur « Éditeur detable», puis faites glisser la population de « lymphocytes T » à partir de fichiers « cellules T enrichies » et « cellules T non enrichies » dans le tableau.
11. Sur le menu "Statistique", sélectionnez "Fréquence des lymphocytes" cellules pour vérifier le pourcentage de cellules CD3 dans tous les lymphocytes, puis cliquez sur "Create table".
12. Les valeurs de paramètres apparaîtront dans un nouveau tableau. Pour les « lymphocytes T enrichis », la fréquence des cellules CD3 MD devrait être d'environ 80 %.