Tri cellulaire magnétique (MACS) : isolement des lymphocytes T thymiques

Le tri cellulaire activé magnétiquement, ou MACS, est une technique qui permet aux chercheurs de séparer les cellules en fonction d’épitopes spécifiques exprimés à leur surface.

Le processus commence généralement par l’extraction d’un organe ou d’un tissu, comme le thymus. Ensuite, les cellules sont séparées mécaniquement, généralement par écrasement, jusqu’à ce que le tissu soit dissocié en cellules uniques. Les cellules indésirables peuvent être éliminées à ce stade par l’ajout de produits chimiques. Par exemple, le chlorure d’ammonium-potassium, ou tampon ACK, peut être utilisé pour lyser les érythrocytes indésirables.

Ensuite, un anticorps conjugué à une molécule appelée biotine est ajouté à la suspension, et ces complexes se lient aux épitopes de la surface des cellules cibles. La biotine a une grande affinité pour une autre molécule appelée streptavidine. Dans l’étape suivante, des molécules de streptavidine fusionnées à des billes magnétiques sont ajoutées aux cellules marquées par anticorps. Lorsque la biotine et la streptavidine entrent en contact, elles se lient étroitement. Le résultat est que les cellules d’intérêt sont recouvertes de billes magnétiques. Ce complexe est parfois appelé sandwich. Dans ce cas, CD3 sur la membrane cellulaire au fond, puis anti-CD3 conjugué à la biotine, et enfin, streptavidine conjugué à des billes magnétiques.

Ces cellules marquées peuvent maintenant être placées dans une colonne contenant une matrice qui, assistée par la gravité, permet aux cellules de passer lentement grâce à un aimant. Ce faisant, les cellules marquées par des billes magnétiques se colleront au bord du tube le plus proche de l’aimant, tandis que les cellules non marquées continueront dans un tube de collecte en dessous. Ensuite, les cellules marquées peuvent être retirées de la colonne en retirant simplement l’aimant, en ajoutant une solution d’éluant et en appliquant une légère pression avec un piston pour les évacuer de la colonne et les faire entrer dans un nouveau tube de collecte. À terme, ce processus permet de récupérer de 60 à 98 % des cellules d’intérêt.

Dans cette procédure, nous isolerons les leucocytes thymiques d’une souris et utiliserons MACS pour trier les lymphocytes T CD3 positifs avant de confirmer l’efficacité du tri à l’aide de FACS.

Pour commencer, enfilez tout équipement de protection approprié, y compris une blouse de laboratoire et des gants. Ensuite, lavez une paire de ciseaux et de pinces à dissection avec de l’éthanol à 70 % et séchez-les avec une serviette en papier propre. Préparez ensuite 200 millilitres de sérum de veau fœtal HBSS à 2 %, ou FCS, en mélangeant quatre millilitres de FCS avec 196 millilitres de HBSS.

Épinglez une souris euthanasiée en position couchée sur une plaque de dissection. À l’aide de ciseaux et de pinces, effectuez une laparotomie longitudinale pour accéder à la cavité thoracique. Tout d’abord, retirez le cœur pour accéder au thymus, qui est situé au-dessus du cœur. Identifiez ensuite le thymus, qui est composé de deux lobes blancs. À l’aide d’une pince, détachez soigneusement le thymus et placez-le sur une boîte de Pétri avec cinq millilitres de HBSS 2 % FCS.

Pour isoler les cellules immunitaires, placez d’abord le thymus sur une passoire à cellules de 40 micromètres dans la boîte de Pétri. Écrasez le mouchoir à l’aide d’un piston pour le dissocier dans le plat. Après cela, rincez le piston et la passoire avec HBSS 2 % FCS pour récupérer les cellules collées. Ensuite, pipetez les cellules du thymus dissociées et le liquide de la boîte de Pétri dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Lavez la boîte de Pétri avec cinq millilitres de HBSS 2 % FCS et transférez également cette solution de lavage dans le tube à centrifuger de 15 millilitres.

Ensuite, centrifugez le tube à 370 fois g pendant sept minutes à 20 degrés Celsius. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de tampon de lyse ACK pour lyser les érythrocytes. Incuber pendant deux minutes à température ambiante sur la paillasse. Ensuite, portez le volume à 14 millilitres avec HBSS 2 % FCS. Centrifugez le tube à 370 fois g pendant sept minutes à 20 degrés Celsius. Ensuite, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de HBSS 2 % FCS.

Estimez la concentration cellulaire à l’aide d’une lame de Malassez comme indiqué dans le protocole d’isolement FACS des lymphocytes B et ajustez la concentration cellulaire à 10 à la septième cellule par millilitre avec HBSS 2 % FCS.

Transférez 500 microlitres de solution cellulaire dans deux tubes FACS. Étiquetez un tube de cellules T non enrichies et l’autre tube de cellules T enrichies de tube, qui seront séparés à l’aide d’un marquage magnétique.

Centrifugez le tube de lymphocytes T enrichis à 370 fois g pendant trois minutes à 20 degrés Celsius. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille dans 250 microlitres d’anticorps anti CD3 couplé à la biotine dilué un sur 400 dans HBSS 2 % FCS. Incuber les cellules pendant 20 minutes sur de la glace et dans l’obscurité. Ajoutez trois millilitres de HBSS 2 % FCS dans les tubes et centrifugez-les à nouveau à 370 fois g pendant trois minutes à 20 degrés Celsius. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 250 microlitres de billes couplées à la streptavidine diluées une sur cinq dans du HBSS 2 % FCS. Incuber le mélange de cellules et de billes pendant 20 minutes sur de la glace. Ensuite, ajoutez trois millilitres de HBSS 2 % FCS dans le tube, pipetez de haut en bas pour mélanger et centrifugez à nouveau à 370 fois g pendant trois minutes à 20 degrés Celsius. Remettre le granulé en suspension dans deux millilitres de HBSS 2 % FCS.

Placez la colonne sur l’aimant et ajoutez trois millilitres de HBSS 2 % FCS pour humidifier le système. Ensuite, pipetez les cellules colorées dans la colonne. Une fois que la suspension cellulaire a traversé la colonne, lavez la colonne trois fois avec trois millilitres de HBSS 2 % FCS. Ensuite, retirez la colonne de l’aimant et placez-la dans un tube de 15 millilitres. Pour éluer les cellules cibles, ajoutez cinq millilitres de HBSS 2 % FCS dans la colonne et rincez la colonne avec un piston. Répétez cette étape avec cinq autres millilitres de HBSS 2 % FCS.

Pour évaluer l’efficacité de l’isolement des cellules cibles, transférez d’abord 500 microlitres de suspension de cellules éluées dans un tube FACS et étiquetez-le avec des cellules T enrichies. Ensuite, centrifugez les tubes enrichis et non enrichis à 370 fois g pendant sept minutes à 20 degrés Celsius. Jetez le surnageant, puis ajoutez 100 microlitres d’anticorps fluorescents dilués un sur 200 dans HBSS 2 % FCS dans les deux tubes. Incuber les cellules pendant 20 minutes sur de la glace et dans l’obscurité. Ensuite, ajoutez trois millilitres de HBSS 2 % FCS dans les tubes et centrifugez-les à 370 fois g pendant trois minutes à 20 degrés Celsius. Jetez le surnageant, puis remettez les granulés en suspension dans 250 microlitres de HBSS 2 % FCS. Maintenant, évaluez le taux d’enrichissement cellulaire CD3-positif à l’aide de la cytométrie en flux, comme indiqué dans le protocole FACS.

Maintenant, nous allons déterminer la fréquence des lymphocytes CD3 positifs parmi tous les thymocytes qui ont été isolés du thymus de souris. Pour commencer, double-cliquez sur l’icône FlowJo et faites glisser les fichiers de chaque tube dans la fenêtre de tous les échantillons. Ensuite, double-cliquez sur le fichier de cellules T enrichi pour afficher les cellules enregistrées à partir de cet échantillon sur un graphique à points qui affiche la diffusion directe, FSCA, sur l’axe des x, et la diffusion latérale, SSCA, sur l’axe y.

Cliquez sur le polygone pour encercler les populations de lymphocytes. Ensuite, double-cliquez sur la population encerclée pour créer une nouvelle fenêtre. Sélectionnez FSC-W sur l’axe des y et FSC-A sur l’axe des x et encerclez les cellules négatives FSA-W. Dans la fenêtre d’identification de la sous-population, nommez votre population cellulaire Cellules uniques. Ensuite, cliquez sur OK dans la fenêtre d’identification de la sous-population, puis double-cliquez sur la population encerclée pour créer une nouvelle fenêtre. Sélectionnez CD3 sur l’axe des y et encerclez les cellules CD3 positives. Dans la fenêtre d’identification de la sous-population, nommez les lymphocytes T de votre population cellulaire. Répétez l’opération avec la lime à cellules T non enrichie. Pour visualiser votre population cellulaire, cliquez sur Éditeur de mise en page et faites glisser la population de cellules T à partir de fichiers de cellules T enrichies et de cellules T non enrichies dans l’onglet.

Des diagrammes à points représentant des lymphocytes CD3 positifs apparaîtront. Les cellules CD3 positives ne doivent apparaître que dans la population d’intérêt dans la sonde enrichie en CD3 positif. Pour évaluer l’enrichissement des lymphocytes CD3 positifs dans les cellules triées, cliquez sur Éditeur de table, puis faites glisser la population de cellules T à partir des fichiers de cellules T enrichies et de cellules T non enrichies dans la table. Dans le menu des statistiques, sélectionnez Fréquence des cellules lymphocytaires pour vérifier le pourcentage de cellules CD3 positives dans tous les lymphocytes. Ensuite, cliquez sur Créer une table. Les valeurs des paramètres apparaîtront dans une nouvelle table. Pour les lymphocytes T enrichis, la fréquence des lymphocytes CD3 positifs doit être d’environ 80 % ou plus.