Tests ELISA : Indirect, en sandwich et par compétition

1. ELISA indirect

Un ELISA indirect est celui où l'anticorps antigène-spécifique primaire est identifié par un anticorps conjugué secondaire. Le protocole suivant est un exemple d'une méthode eLISA indirecte, où les échantillons sériques de souris infectées par le virus de la grippe A (IAV) sont testés pour la présence d'anticorps IgG spécifiques au IAV. Une force de cet exemple est que différents anticorps secondaires peuvent être utilisés qui reconnaissent tous les isotypes d'anticorps ou des isotypes spécifiques (par exemple, IgG).

Enrobage d'antigène à la microplaque

1. Enrober les puits d'une plaque ELISA de 96 puits d'antigène purifié en piétine50 ll d'antigène purifié (2 mg/mL de virus purifié A/PR/8 de la grippe A dans un tampon Tris-HCl de 0,05 M (pH 9,5)) dans chaque puits de la plaque.
2. Couvrir la plaque d'un couvercle adhésif et l'incuber toute la nuit à 4 oC pour permettre à l'antigène de se lier à la plaque.
3. À l'achèvement de l'incubation, retirez la solution de revêtement en faisant glisser la plaque sur un évier.

Blocage

4. Bloquez les autres sites de liaison protéique dans les puits enduits en ajoutant un tampon de blocage de 200 l, 5 % de sérum d'âne dans 1X PBS est utilisé ici, par puits. Les réactifs de blocage alternatifs incluent 5% de lait sec non gras ou BSA en PBS ou sérum normal d'un animal dans lequel l'anticorps secondaire a été généré.
5. Incuber pendant au moins 2 heures à température ambiante ou toute la nuit à 4 oC.
6. Après l'incubation, retirez le tampon de blocage en faisant glisser la plaque, puis lavez la plaque avec du PBS contenant 1 % de Tween-20.

Incubation avec l'anticorps primaire

7. Préparer une dilution en série de l'échantillon de sérum, qui contient l'anticorps primaire, pour obtenir une plage de dilution de 1 à 204 800, en utilisant 1X PBS. Pour ce faire, diluer d'abord le sérum 1:12.5, puis effectuer une dilution 4X (plage de dilution - 1:12.5 à 1:204,800).
8. Ajouter 100 l d'échantillons de sérum dilués en série aux puits.
9. Couvrir la plaque d'un couvercle adhésif et incuber à température ambiante pendant 1 à 2 h.
10. Après l'incubation, faire glisser la plaque sur un évier et laver la plaque avec du PBS contenant 1% De Tween-20.

Incubation avec l'anticorps secondaire

11. Ajouter 100 L d'un anticorps secondaire conjugué en zymatique, peroxidase de raifort, anti-souris à âne satisme hrP secondaire dans cette expérience, à chaque puits.
12. Incuber la plaque pendant 1 heure à température ambiante.
13. Après l'incubation, faire glisser la plaque sur un évier, puis laver la plaque avec DU PBS contenant 1% Tween-20.

découverte

14. Ajouter 100 l de substrat indicateur (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)) à une concentration de 1 mg/mL à chaque puits.
15. Incuber la plaque avec le substrat pendant 5-10 min à température ambiante.
16. Après 10 min, arrêtez la réaction enzymatique en ajoutant 100 'L 2N acide sulfurique (H₂SO₄).
    Dans les 30 minutes suivant l'ajout de la solution d'arrêt, lisez la plaque à l'aide d'un lecteur microplaque à 405 nm pour déterminer l'absorption des puits.

2. Sandwich ELISA

Dans cette version ELISA, l'échantillon expérimental est "sandwiché" entre un anticorps de capture non conjugué et un anticorps de détection conjugué, qui sont tous deux spécifiques à la même protéine, mais à des épitopes différents. Dans l'exemple suivant d'ELISA sandwich, la concentration de TNFmD humain a été déterminée dans l'échantillon inconnu à l'aide d'une courbe standard générée à partir de la dilution sérielle 2.5X d'une norme connue, la TNF humaine recombinante (indiquant à la concentration de 75 pg/mL).

Anticorps de capture de revêtement à la microplaque

1. Enrober les puits d'une plaque ELISA de 96 puits d'anticorps de capture purifiés en ajoutant 100 ll d'anticorps de capture (1-10 g/mL) à chaque puits de la plaque.
2. Couvrir la plaque d'un couvercle de plaque adhésif et l'incuber toute la nuit à 4 oC.
3. Après l'incubation, retirer la solution de revêtement de la plaque en faisant glisser la plaque sur un évier.

Blocage

4. Bloquer les autres sites de liaison protéinée dans les puits enduits d'anticorps en ajoutant une solution de blocage de 200 L, 5 % de lait sec non gras contenant du PBS, aux puits.
5. Incuber pendant au moins 2 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 oC.
6. Après l'incubation, retirez le tampon de blocage en faisant glisser la plaque, puis lavez la plaque avec du PBS contenant 1 % de Tween-20.

Ajouter des échantillons d'essai contenant de l'antigène

7. Ajouter 100 l'échantillon d'essai aux puits. Sceller la plaque avec un couvercle adhésif.
8. Incuber de 1 à 2 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 oC.
9. Après l'incubation, retirer les échantillons en faisant glisser la plaque sur l'évier, puis laver les puits avec 200 L 1X PBS contenant 1% Tween-20.

Ajouter un anticorps de détection conjugué aux enzymes

10. Ajouter 100 l d'anticorps de détection conjugués aux enzymes dans les puits à une concentration préoptimisée.
11. Sceller la plaque avec un couvercle adhésif et incuber à température ambiante pendant 2 h.
12. Retirez l'anticorps de détection non lié en faisant glisser la plaque sur un évier et lavez les puits avec un PBS de 200 L 1X contenant 1 % de Tween-20.

découverte

13. Ajouter 100 l de substrat indicateur à une concentration de 1 mg/mL. Tout anticorps de détection enzymatique lié convertira le substrat en un signal détectable.
14. Incuber la plaque de 5 à 10 min à température ambiante.
15. Après 5-10 min, arrêtez la réaction enzymatique en ajoutant 100 'L 2N H₂SO₄ aux puits. Dans les 30 minutes suivant l'ajout de la solution d'arrêt, lisez la plaque à l'aide d'un lecteur de microplaques pour déterminer l'absorption des puits.

3. ELISA compétitif

Les étapes d'un ELISA compétitif sont différentes de celles utilisées dans l'ELISA indirect et sandwich, la principale différence étant l'étape de liaison concurrentielle entre l'antigène de l'échantillon et l'antigène " add-in ". L'antigène de l'échantillon est incubé avec l'anticorps primaire non étiqueté. Ces complexes anticorps-antigènes sont ensuite ajoutés à la plaque ELISA, qui a été pré-enduite avec le même antigène. Après une période d'incubation, tout anticorps non lié est emporté. Il existe une corrélation inverse entre la quantité d'anticorps libres disponibles pour lier l'antigène dans le puits et la quantité d'antigène dans l'échantillon d'origine. Par exemple, un échantillon avec l'antigène abondant aurait plus de complexes d'anticorps antigène-primaires, laissant peu d'anticorps non liés pour se lier à la plaque ELISA. Un anticorps secondaire conjugué à l'enzyme spécifique à l'anticorps primaire est ensuite ajouté aux puits, suivi du substrat.

Enrobage d'antigène à la microplaque

1. Enrober les puits d'une plaque ELISA de 96 puits de 100 l d'antigène purifié à une concentration de 1-10 g/mL.
2. Couvrir la plaque d'un couvercle adhésif et incuber la plaque pendant la nuit à 4 oC.
3. Après l'incubation, retirer la solution antigène non liée des puits en faisant glisser la plaque sur un évier.

Blocage

4. Bloquer les autres sites de liaison protéinée dans les puits enduits en ajoutant 200 l de tampon de blocage à chaque puits, qui peut être soit 5% de lait sec non gras ou BSA dans PBS.
5. Incuber la plaque pendant au moins 2 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 oC.

Échantillon d'incubation (antigène) avec l'anticorps primaire

6. Tout en bloquant les puits, préparer le mélange antigène-anticorps en mélangeant 150 oL d'antigène échantillon et 150 L d'anticorps primaires pour chaque puits dans l'assay.
7. Incuber ce mélange pendant 1 h à 37oC.

Ajouter le mélange antigène-anticorps au puits

8. Maintenant, retirez le tampon de blocage des puits en faisant glisser la plaque sur un évier.
9. Ensuite, lavez les puits avec 1X PBS contenant Tween-20.
10. Ajouter 100 l l de l'échantillon d'anticorps antigènes primaires.
11. Incuber la plaque à 37oC pendant 1 h.
12. Retirer le mélange d'échantillons en faisant glisser la plaque sur un évier.
13. Ensuite, lavez les puits avec 1X PBS contenant 1% Tween-20 pour enlever tout anticorps non lié.

Ajouter l'anticorps secondaire

14. Ajoutez 100 L d'un anticorps secondaire conjugué enzymatique, qui dans ce cas est l'anticorps AP-conjugué, à chaque puits.
15. Incuber la plaque pendant 1 h à 37oC.
16. Après l'incubation, laver la plaque avec 1X PBS contenant 1% Tween-20.

découverte

17. Ajouter 100 l de la solution de substrat à chaque puits.
18. Attendez 5-10 min.
19. Après 10 min, arrêtez la réaction enzymatique en ajoutant 100 acide sulfurique L 2N aux puits. Ensuite, mesurez l'absorption dans un lecteur de microplaque dans les 30 minutes suivant l'ajout de la solution d'arrêt