Test ELISPOT : Détection des splénocytes sécrétants l'IFNgamma

1. Mise en place

Buffers et réactifs

1. Saline saline (PBS) tamponnée de phosphate stérile sans calcium ni magnésium
2. Tampon de revêtement- PBS stérile ou tampon de carbonate
3. Assay diluent- 10% sérum bovin fœtal (FBS) en PBS
4. Culture cellulaire moyenne- RPMI 1640 avec 10% FBS, pénicilline/streptomycine, et L-glutamine
5. Tampon de lavage- PBS contenant 0.05% Tween20
6. Eau distillée double (ddH₂O)
7. Substrat de détection- 100 mg AEC (3-amino-9-éthyle-carbazole) en 10 mL DMF (N,N, Dimethylformamide).

équipement

8. Hotte d'écoulement laminaire
9. Incubateur humidifié (fixé à 37oC, 5% CO₂)
10. Lecteur ELISPOT automatisé ou microscope disséquer

Matériaux

11. Plaques ELISPOT
12. Réservoirs stériles et non stériles
13. Pipettors et conseils
14. Pipettes sérologiques stériles
15. Tubes de polypropylène stériles et coniques
16. Deux bouteilles de compression pour le lavage de plaque

Réagents spécifiques d'assay

17. Cellules- cellules primaires ou lignées cellulaires (ici, des splenocytes de souris C57BL/6 ont été utilisés)
18. Stimulants- mitogène ou antigène (ici, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 50 ng/mL) et ionomycine (1 M) ont été utilisés)
19. Anticorps primaires- anticorps biotinylated anti-cytokine de détection d'anticorps (dilué à 2 'g/mL dans le diluant d'analyse)
20. Anticorps secondaire- streptavidin-horseradish peroxidase (SAv-HRP)

2. Procédure

couche

1. En gardant les conditions stériles et à l'intérieur d'une hotte à débit laminaire, diluer l'anticorps purifié anticytokine à une concentration finale de 0,5-4,0 g/mL dans un tampon de revêtement stérile. (Remarque : pour l'utilisation de l'IFN et de l'IL-6 à 5 g/mL).
2. Transférer la solution d'anticorps de capture, 100 l/puits, à la plaque ELISPOT.
3. Couvrir la plaque d'un couvercle de plaque et sceller pour éviter l'évaporation.
4. Incuber la plaque toute la nuit à 4oC.

Blocage

5. Le lendemain, découvrez la plaque ELISPOT dans le capot à débit laminaire. Invertis rapidement la plaque sur des lingettes stériles pour enlever la solution d'anticorps de capture de chaque puits.
6. Ensuite, ajoutez 200 L de milieu de culture cellulaire à chaque puits. Cette étape bloquera la liaison non spécifique pendant l'assiduité.
7. Remplacer le couvercle de la plaque et l'incuber pendant 2 heures à 37 oC.

Cellules de placage et d'activation

8. Pendant que la plaque couve, préparez une solution mitogène 2X contenant 50 ng/mL PMA et 1 ionomycine m dans le milieu de culture cellulaire.
9. Ensuite, préparez les suspensions cellulaires cibles à une concentration de stock de 2 x 10⁶ cellules/mL.
10. Une fois l'incubation terminée, retirez le milieu de culture cellulaire de chaque puits en inversant rapidement la plaque sur des lingettes stériles à l'intérieur du capot à flux laminaire.
11. Ensuite, générer une dilution en série 2X de la solution de suspension de cellules de stock. Pour ce faire, ajoutez d'abord 200 l de la solution de stock de suspension cellulaire préparée dans les puits de la rangée supérieure de la plaque ELISPOT.
12. Ensuite, ajoutez 100 L de milieu de culture de cellules ordinaires aux cinq rangées suivantes de la plaque sous les lignes contenant la solution de stock cellulaire.
13. Après cela, effectuer une dilution en série 2X en pipetting 100 L de la suspension cellulaire de la rangée supérieure dans la rangée directement ci-dessous. Assurer un bon mélange en pipetting doucement cette solution de haut en bas pour assurer une distribution uniforme des cellules.
14. Répétez ce processus pour les quatre rangées restantes.
15. Quitter la sixième rangée avec le milieu de la culture seulement. Il servira de contrôle expérimental.
16. Ensuite, ajoutez 100 L de la solution mitogène préparée aux puits expérimentaux des cinq premières rangées de la plaque. Dans les puits de contrôle et la sixième rangée, ajouter 100 L du milieu de culture cellulaire sans mitogène.
17. Remplacer le couvercle de la plaque et incuber la plaque à 37 oC, 5 % de CO₂ dans un incubateur pendant 20 à 48 heures. (Remarque : 20 à 24 heures est généralement suffisante pour détecter l'IL-2 et le TNF, alors que 48 heures sont optimales pour l'IL-4 et l'IFN).

découverte

Anticorps primaires

18. Préparer l'anticorps anticytokine biotinylated à une concentration de 2 g/mL dans le diluant d'analyse.
19. Préparer 20-25 ml de tampon de lavage à ce moment en mélangeant 0,05% Tween-20 dans PBS.
20. Une fois l'incubation terminée, décapiter la plaque et l'inverser rapidement sur un évier pour enlever tout le liquide des puits. (Remarque : Après ce point, la plaque n'a plus à être stérile).
21. Ensuite, lavez l'assiette en ajoutant un tampon de lavage de 200 l à chaque puits. Expulsez ce liquide en inversant rapidement et en faisant glisser la plaque sur un évier. Répétez ce processus pour un total de cinq lavages.
22. Ensuite, ajoutez 100 L de la solution anticytokine diluée anti-cytokine détection à chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 2 heures à température ambiante ou pendant la nuit à 4oC.

Anticorps secondaires

23. Une fois l'incubation terminée, expulser l'anticorps de détection en inversant et en faisant glisser la plaque au-dessus de l'évier.
24. Comme auparavant, lavez la plaque 5 fois avec un tampon de lavage de 200 l, en expulsant le liquide entre chaque lavage.
25. Ajouter ensuite 100 lde de solution de peroxidase streptavidin-horraie diluée à chaque puits (dilué à sa concentration optimale prédéterminée dans le diluant d'assay).
26. Remplacer le couvercle de la plaque et incuber à température ambiante pendant 1,5 à 2 heures à 37 oC.

Substrat

27. Après l'incubation, pas plus de 15 minutes avant l'utilisation, activez d'abord la solution de substrat AEC selon les instructions du fabricant.
28. Ensuite, jetez le contenu des puits et lavez la plaque cinq fois avec un tampon de lavage, comme avant.
29. Ensuite, ajoutez immédiatement 100 l de solution de substrat AEC préparée dans chaque puits.
30. Incuber la plaque à température ambiante pendant 10 à 20 minutes tout en surveillant le développement de la tache.
31. Arrêtez la réaction en rinçant la plaque avec de l'eau et en faisant glisser la plaque sur l'évier.
32. Blot la plaque sur des essuie-tout et laisser sécher l'assiette pendant la nuit ou jusqu'à ce qu'elle soit complètement sèche. L'enlèvement du plateau en plastique sous la plaque facilitera le séchage.

3. Acquisition et analyse de données

1. Après le séchage, les taches sont prêtes à être comptées avec un lecteur de plaque automatisé. Ici, le lecteur CTL Immunospot est utilisé, mais ce protocole peut être adapté pour n'importe quel lecteur.
2. D'abord allumer l'instrument, puis l'ordinateur. Ensuite, ouvrez le programme CTL et cliquez sur " Compter les scans ".
3. Poussez " éjecter " pour que le plateau s'étende de la machine. Ensuite, retirez l'adaptateur en plastique et alignez la ligne « A » sur la plaque et l'adaptateur ELISPOT.
4. Choisissez un nom de fichier et un emplacement pour que le fichier soit enregistré et chargez la plaque sur le plateau.
5. Ensuite, cliquez sur "charger" sur le logiciel et fermez la porte sur le côté de la machine.
6. Appuyez sur "start- après comptage." Assurez-vous que le fichier est enregistré, puis ouvrez le logiciel de contrôle de qualité "QC" pour analyser les données et compter le nombre de points.

Notes:

1. Le nombre minimum de cellules doit être déterminé dans les expériences préliminaires. Le nombre optimal de places est de 50 euros/puits. Si trop de cellules sont chargées, il sera difficile de détecter des taches distinctes. En outre, les cellules se chevauchent et peuvent ne pas former une monocouche sur la membrane, de ce fait le niveau de détection peut être réduit.
2. Lors de l'optimisation de l'expérience, considérez le niveau d'expression attendu de la protéine cible. Plus l'expression est basse, plus le nombre de cellules requises par puits est élevé.
3. Contrairement à ELISA, il est préférable de laver la plaque à la main plutôt que d'utiliser une laveuse à assiette. Les plaques ELISPOT sont plus délicates et il faut éviter de perforer la membrane PVDF.
4. Il faut limiter le mouvement de la plaque pendant la période d'incubation car elle peut causer des taches à la tache.
5. Les plaques doivent être stockées dans l'obscurité, car l'exposition à la lumière directe provoque la décoloration des taches.