Immunohistochimie et immunocytochimie : Imagerie tissulaire par microscopie optique

L’immunocytochimie et l’immunohistochimie sont des méthodes de coloration d’une protéine d’intérêt dans les cellules et les tissus en culture, respectivement. Le principe de base des deux techniques connexes consiste à utiliser des anticorps spécifiques marqués avec un système de détection pour identifier et visualiser la protéine et déterminer son emplacement dans les cellules et les tissus, ainsi que les niveaux relatifs. Dans l’une ou l’autre expérience, le processus commence par la préparation de l’échantillon.

Pour l’immunocyctochimie, qui visualise spécifiquement l’emplacement des protéines ou des antigènes dans les cellules, cela implique trois étapes. La première étape est le placage, qui consiste à cultiver les cellules dans un milieu de croissance sur une lamelle ou une lame, généralement, dans les puits d’une plaque de culture. Ceci est suivi de la fixation, où un agent précipitant ou réticulant comme le paraformaldéhyde est ajouté aux cellules pour préserver l’intégrité structurelle des protéines et empêcher l’activité enzymatique de les dégrader. La dernière étape est la perméabilisation, qui consiste à ajouter un détergent pour rendre les membranes cellulaires perméables à la coloration.

Dans la méthode homologue, l’immunohistochimie, les protéines ou les antigènes sont visualisés dans les tissus et la préparation de l’échantillon comporte cinq étapes. Tout d’abord, l’ensemble du tissu est soumis à une fixation, généralement avec du paraformaldéhyde. Ceci est suivi par l’enrobage du tissu dans un bloc de paraffine, puis la section de ce bloc à l’aide d’une machine appelée microtome pour couper le tissu en fines tranches qui peuvent être placées sur des lames. Ensuite, les lames sont soumises à la déparaffinisation, ou à l’élimination de la paraffine autour de la tranche de tissu. Ensuite, une étape facultative de récupération de l’antigène peut être effectuée. Cela peut être fait en utilisant de la chaleur ou des enzymes pour démasquer les épitopes qui ont été réticulés lors de la fixation, les rendant disponibles pour la liaison des anticorps. Après la préparation appropriée de l’échantillon, un anticorps primaire spécifique à la cible est ajouté à l’échantillon de cellule ou de tissu. Cet anticorps primaire doit se lier à la protéine d’intérêt. Ensuite, un anticorps secondaire est ajouté, qui détecte et se lie à l’anticorps primaire. Cet anticorps secondaire est conjugué à une enzyme appelée HRP ou peut se lier à celle-ci. Lorsque son substrat spécifique, le DAB, est ajouté, le HRP le convertit en un précipité brun insoluble. Cette tache brune marque l’emplacement de la protéine cible. Les lames sont également colorées à l’hématoxyline, qui marque les noyaux en bleu et fournit un point de référence spatial pour déterminer la localisation subcellulaire. Après cela, un support de montage est ajouté à la lame, suivi d’une lamelle de protection afin de sceller et de préserver l’échantillon coloré. Enfin, les lames peuvent être imagées au microscope optique.

Dans cette vidéo, vous observerez la technique de préparation d’échantillons pour les cellules et les coupes de tissus, suivie de l’immunomarquage des sections de tissus.

Tout d’abord, les cellules d’intérêt doivent être placées sur des lamelles. Pour ce faire, en travaillant dans une hotte de culture tissulaire, placez des lamelles individuelles dans les puits d’une plaque à 24 puits. Ensuite, fermez le châssis et allumez la lumière UV pour stériliser les lamelles pendant au moins 15 minutes. Ensuite, éteignez la lumière UV. Pour soulever les cellules d’intérêt d’une boîte confluente de 10 centimètres, aspirez le milieu, lavez-le brièvement avec du PBS et ajoutez de la trypsine aux cellules pendant 2 minutes. Ensuite, tapotez le côté de la plaque pour vous assurer que les cellules se sont détachées et neutralisez la trypsine avec le milieu. Ensuite, ajoutez 0. 5 ml de suspension cellulaire dans chaque puits, en veillant à couvrir les lamelles. Placez la plaque dans un incubateur à CO2 humidifié et laissez les cellules se développer à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 50-70 %.

Une fois que les cellules ont atteint la confluence optimale, aspirez le milieu de culture de chaque puits, puis fixez les cellules en les incubant dans . 5 mL de paraformaldéhyde à 4 % dilué dans 1X PBS pendant 20 minutes à température ambiante. Après avoir retiré le fixateur, rincez les cellules en ajoutant 1 mL de 1X PBS sur chaque lamelle. Aspirez immédiatement le PBS, puis répétez le rinçage 2 fois de plus pour un total de 3 lavages.

Maintenant, perméabilisez les cellules en ajoutant 0,5 ml de Triton X-100 à 0,1 % dans 1X PBS dans chaque puits. Laissez la plaque à température ambiante pendant 15 minutes. Aspirez le tampon de perméabilisation, puis rincez les cellules en ajoutant 1 ml de PBS 1X dans chaque puits. Aspirez immédiatement le PBS et répétez le rinçage 2 fois de plus pour un total de 3 lavages. Maintenant que les cellules sur les lamelles sont fixées et perméabilisées, passez à la procédure de coloration démontrée pour l’exemple d’immunohistochimie suivant, à l’exception du fait que les incubations doivent être effectuées dans les puits de la plaque à 24 puits plutôt que directement sur une lame de coupe de tissu.

Pour commencer, procurez-vous des coupes de tissus préparées, fixées au formol et incluses dans la paraffine. Déparaffinisez les lames en les plaçant dans un support à diapositives, puis en les immergeant complètement dans 250 ml de xylène à 100 %. Laissez les lames incuber pendant 5 minutes dans le xylène. Ensuite, retirez les lames du récipient, essuyez-les avec une serviette en papier et placez-les dans un nouveau bain de xylène dans un récipient frais pendant 5 minutes supplémentaires.

Ensuite, réhydratez les sections dans une série de solutions d’éthanol graduées en commençant par de l’éthanol à 100 % pendant 3 minutes. Essuyez le support de diapositives avec une serviette en papier et transférez les diapositives dans un nouveau récipient rempli de 100 % d’éthanol pendant 3 minutes supplémentaires. Poursuivez ce cycle de lavage, de séchage avec une serviette en papier et de transfert des lames dans un nouveau bain en suivant les concentrations d’éthanol indiquées pendant la durée spécifiée. Après le lavage final à l’éthanol, essuyez le support avec une serviette en papier et incubez les lames dans 100 ml de peroxyde d’hydrogène à 0,3 % pendant 30 minutes à température ambiante afin de bloquer toute activité de peroxydase endogène. Lavez les lames dans 250 mL de 1X PBS pendant 5 minutes. Répétez ce lavage dans un récipient de 1X PBS frais pendant 5 minutes supplémentaires.

Ensuite, effectuez la récupération de l’antigène en immergeant les lames dans 250 ml de tampon de citrate IHC à pH 6,0 et en les faisant bouillir pendant 20 minutes. Ensuite, passez au protocole de coloration.

Pour commencer le processus de coloration de l’IHC, entourez les sections avec un stylo hydrophobe afin d’identifier la zone minimale que le tampon doit couvrir. Ensuite, à l’aide d’une pipette, placez 100 microlitres de tampon de blocage, qui dans cette expérience est du sérum de cheval dilué dans 1X PBS, sur la section. Incuber les lames pendant 1 heure à température ambiante. Ensuite, retirez le tampon de blocage à l’aide d’une pipette.

Ensuite, diluez l’anticorps primaire et le tampon de blocage à une dilution de 1:100 en ajoutant 990 microlitres de sérum de cheval dilué dans 1X PBS dans un 1. Tube Eppendorf de 5 ml, suivi de 10 microlitres de l’anticorps primaire. Ajoutez 100 microlitres de l’anticorps primaire dilué dans chaque section et incubez les lames pendant 30 minutes à température ambiante. Lorsque la minuterie sonne, videz l’anticorps primaire de chaque lame, puis lavez-les dans 250 ml de 1X PBS pendant 5 minutes. Répétez ce lavage une fois de plus en utilisant du PBS 1X frais.

Pendant que les lames sont lavées dans du PBS 1X, diluez l’anticorps secondaire à une dilution de 1:200 en ajoutant 995 microlitres de tampon bloquant dans un tube de 1,5 mL suivi de 5 microlitres de l’anticorps secondaire, qui dans ce cas est un IGG anti-souris de cheval biotinylé. Ajoutez 100 microlitres d’anticorps secondaire dilué dans chaque section, puis incubez les lames pendant 30 minutes à température ambiante. Après 30 minutes, retirez l’anticorps secondaire en l’égouttant des sections, puis lavez les lames dans 250 ml de 1X PBS pendant 5 minutes. Répétez ce lavage en utilisant du 1X PBS frais.

Maintenant, ajoutez 100 microlitres de réactif du complexe avidine-biotine et incubez les sections dans l’obscurité pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les lames en les immergeant dans 250 ml de 1X PBS pendant 5 minutes. Comme pour les étapes de lavage précédentes, répétez ce lavage une fois de plus en utilisant du PBS 1X frais. Ensuite, développez les lames en incubant les sections dans 100 microlitres de DAB pendant 5 minutes maximum. Arrêtez le développement en immergeant les sections dans 250 mL d’eau distillée pendant 5 minutes.

Maintenant, les lames peuvent être contre-teintées, si vous le souhaitez. Pour ce faire, trempez brièvement les lames dans 250 mL de solution d’hématoxyline Harris. Rincez la contre-tache en lavant les lames dans 250 mL d’eau distillée pendant 5 minutes. Répétez ce lavage 1 fois de plus avec de l’eau distillée fraîche. Ensuite, déshydratez les sections. Pour ce faire, incubez d’abord les lames dans de l’éthanol à 95 % pendant 5 minutes. Épongez les lames sur une serviette en papier et transférez-les dans un nouveau récipient d’éthanol frais à 95 % pendant encore 5 minutes. Continuez le cycle de lavage, épongez avec une serviette en papier et transférez les lames dans un nouveau bain, en suivant les solutions indiquées pendant 5 minutes chacune.

Après l’incubation finale, épongez les lames avec une serviette en papier, puis ajoutez une goutte de support de montage, tel que le support organo-limonène, aux diapositives. Maintenant, placez une lamelle sur les sections, en prenant soin de ne pas piéger les bulles d’air. Les lames sont maintenant prêtes à être observées au microscope pour analyse.

Pour observer les sections colorées, utilisez un microscope optique standard pour visualiser la tache et un appareil photo numérique pour capturer l’image. Dans cet exemple particulier d’IHC, les tissus de la rate de souris de type sauvage et de souris spontanées, doublement transgéniques, ou DTG, sont comparés pour étudier l’expression de Dyclin D1 dans le lymphome. Les tissus ont été intégrés à la paraffine, sectionnés et colorés avec un anticorps anticycline D1, et imagés à un grossissement de 20X. Les cellules exprimant la cycline D1 sont indiquées par la couleur brun rougeâtre sur le fond bleu des tissus. En comparant les intensités de coloration entre les images des différentes souris, les rates non hypertrophiées ont des quantités relativement faibles d’expression de la cycline D1, quel que soit le génotype de la souris. En revanche, l’hypertrophie de la rate de la souris DTG montre une coloration brun rougeâtre accrue, indiquant une corrélation entre le développement du cancer et l’expression de la cycline D1 dans ce modèle murin.