Immunohistochimie et immunocytochimie : Imagerie tissulaire par microscopie optique

1. Préparation des cellules pour l'immunocytochimie

1. Cellules de semences d'intérêt sur des toboggans chambrés ou des plaques de couverture chambrées en ajoutant 0,5 ml de suspension cellulaire aux puits d'une plaque de culture de 24 puits.
   Note: Certaines cellules peuvent avoir besoin de croissance sur les couvertures traitées, comme les couvertures traitées à la polylysine. Les conditions de traitement optimales doivent être déterminées par l'utilisateur en fonction du type de cellule utilisé.
2. Placer la plaque dans un incubateur humidifié de CO₂ et permettre aux cellules de se développer à 37 oC jusqu'à 50-70% de confluents.
3. Une fois que les cellules atteignent la confluence optimale, retirez le support de culture de chaque puits et puis fixez les cellules en les incuber dans 0.5 ml de 4% PFA (dilué dans 1X PBS) et incubependant pendant 20 min à la température ambiante.
4. Retirer le fixatif et laver les puits trois fois avec 1 ml de 1X PBS.
5. Ensuite, perméabilisez les cellules en ajoutant 0,5 ml de 0,1 % de Triton-X-100 en 1X PBS à chaque puits et incuber pendant 15 min à température ambiante.
6. Aspirer le tampon de perméabilisation et laver les puits trois fois avec 1 ml de 1X PBS.
7. Les cellules sur les couvertures sont maintenant fixes et perméabilisées. Procéder à la procédure de coloration démontrée pour l'exemple d'immunohistochimie suivant- à l'exception que les incubations devraient être effectuées dans les puits de la plaque de puits 24 plutôt que directement sur une diapositive de section de tissu.

2. Préparation de sections formalines, paraffines pour la coloration

1. Obtenir des sections de tissus incorporées à la formaline fixée s'y prêtent à la paraffine.

Déparaffinisation

2. Immerger les lames dans 100% xylène 2 fois pendant 5 min chacun.

Réhydratation

3. Immerger les lames dans 100% d'éthanol 2 fois pendant 3 min chacun.
4. Immerger les lames dans 95 % d'éthanol pendant 3 min.
5. Immerger les lames dans 70 % d'éthanol pendant 3 min.
6. Immerger les lames dans 50 % d'éthanol pendant 3 min.

Bloquer l'activité endogène de peroxidase

7. Incuber les toboggans en 100 ml de 0,3 % H₂O₂ pendant 30 min à température ambiante.
8. Laver les diapositives avec 1X PBS 2 fois pendant 5 min chacun.

Récupération d'antigène

9. Immerger les diapositives dans le tampon de citrate IHC (pH 6) et les faire bouillir pendant 20 min.
10. Les glissières de tissu sont maintenant prêtes pour la coloration.

3. Préparation de sections fraîchement congelées et intégrées à l'OTC pour la coloration

1. Placer 5 mm de tissu isolé frais dans un moule et ajouter OCT jusqu'à ce que la section soit complètement recouverte.
2. Immerger lentement le bloc tissulaire dans l'azote liquide jusqu'à ce qu'il soit complètement congelé. L'échantillon peut maintenant être stocké à -80 oC jusqu'à 1 an.
3. Une fois prêt pour la section, transférer le bloc de tissu congelé à un cryostat et permettre à l'ensemble de la configuration de venir à -20 oC.
4. Couper des sections de tissu de 5 à 10 m d'épaisseur à l'aide d'un cryostat et utiliser un pinceau pour placer les sections directement sur des lames de verre compatibles au CSI.
5. Laisser sécher les glissières toute la nuit à température ambiante. Les diapositives peuvent également être stockées à -80 oC.
6. Immerger les glissières dans 250 ml de 4 % de PFA pendant 15 min à température ambiante pour fixer les lames avant la coloration. La méthode de fixation optimale doit être déterminée par l'utilisateur.
7. Immerger les toboggans dans 250 ml de 1X PBS 2 fois pendant 5 min chacun.
8. Immerger les toboggans dans 250 ml de 0,3 % H₂O₂ pendant 30 min à température ambiante afin de bloquer toute activité endogène de peroxidase.
9. Immerger les toboggans dans 250 ml de 1X PBS 2 fois pendant 5 min chacun.
10. Les diapositives sont maintenant prêtes pour la coloration.

4. Staining

1. Encerclez le tissu à l'aide d'une barrière hydrophobe à l'aide d'un enclos à barrière.

Blocage

2. À l'aide d'une pipette, placer 100 l de tampon de blocage (sérum de cheval dilué en 1X PBS) - sur la section pendant 1 heure à température ambiante.
3. Supprimer le tampon de blocage à l'aide d'une pipette.

Incubation primaire d'anticorps

4. Incuber le tissu encerclé avec une solution d'anticorps primaire diluée de 100 l (la cycline anti-humaine D1 diluée 1:100 dans le tampon de blocage) pendant 30 min à température ambiante.
5. Égoutter l'anticorps primaire de chaque diapositive et laver les diapositives avec 1X PBS 2 fois pendant 5 min chacun.

Incubation secondaire d'anticorps

6. Incuber l'échantillon avec 100 l d'anticorps secondaires biotinylated dilués (biotinylated cheval anti-souris IgG dilué 1:200) pendant 30 min à température ambiante.
7. Retirez l'anticorps secondaire en égouttant les sections et lavez-les avec 1X PBS 2 fois pendant 5 min chacune.

Développement des couleurs

8. Visualisation à l'aide de HRP : Ajouter 100 l de réactif de complexe avidin-biotine (ABC) et incuber les sections dans l'obscurité pendant 30 min à température ambiante
   Note: Les anticorps étiquetés fluorescents peuvent également être utilisés et visualisés à l'aide d'un microscope approprié.
9. Laver les diapositives avec 1X PBS 2 fois pendant 5 min chacun.
10. Développer les diapositives en couvant les sections dans 100 OL de DAB pendant jusqu'à 5 min.
11. Arrêter le développement en ajoutant de l'eau distillée (dH₂O) pendant 5 min à température ambiante.

Contre-coloration (si désiré)

12. Immerger brièvement les diapositives dans Harris Hematoxylin Solution (ou 0,5 % de méthyle vert en 0,1 m d'acétate de sodium (pH 4,2)) pendant 10 min.
13. Rincer le contre-tache en lavant les lames en dH₂O deux fois pendant 5 min chacune.

déshydratation

14. Immerger les lames dans 95 % d'éthanol 2 fois pendant 5 min chacune.
15. Immerger les lames dans 100% d'éthanol 2 fois pendant 5 min chacun.
16. Immerger les lames dans 100% xylène 2 fois pendant 5 min chacun.
17. Blot les diapositives avec un essuie-tout.

Application de montage et de couverture

18. Ajoutez une goutte de support de montage comme le mont Organo-Limonene aux toboggans et placez une couverture sur les sections.

Analyse microscopique

19. Observez les sections tachées au microscope approprié pour analyse. Ici, un microscope léger standard a été utilisé pour l'observation et un appareil photo numérique monté a été utilisé pour l'imagerie.