Immunohistochimie et immunocytochimie : Imagerie tissulaire par microscopie optique

L’immunocytochimie et l’immunohistochimie sont des méthodes de coloration pour une protéine d’intérêt dans les cellules et les tissus cultivés, respectivement. Le principe de base des deux techniques connexes consiste à utiliser des anticorps spécifiques marqués avec un système de détection pour identifier et visualiser la protéine et déterminer son emplacement dans les cellules et les tissus, ainsi que les niveaux relatifs. Le processus dans l’une ou l’autre expérience commence par la préparation de l’échantillon.

Pour l’immunocyctochimie, qui visualise spécifiquement l’emplacement des protéines ou des antigènes dans les cellules, cela implique trois étapes. La première étape consiste à placage, qui consiste à cultiver les cellules dans les supports de croissance sur un glissement de couverture ou une glissière, généralement, dans les puits d’une plaque de culture. Ceci est suivi par la fixation, où un agent précipitamment ou de liaison croisée comme le paraformaldéhyde est ajouté aux cellules pour préserver l’intégrité structurale des protéines et empêcher l’activité enzymatique de les dégrader. La dernière étape est la perméabilisation, qui consiste à ajouter un détergent pour rendre les membranes cellulaires perméables pour la coloration.

Dans la méthode de contrepartie, l’immunohistochimie, les protéines ou les antigènes sont visualisés dans les tissus et la préparation de l’échantillon comporte cinq étapes. Tout d’abord, le tissu entier est soumis à la fixation, généralement avec du paraformaldéhyde. Ceci est suivi par l’intégration du tissu dans un bloc de paraffine, puis la section de ce bloc à l’aide d’une machine appelée microtome pour couper le tissu en fines tranches qui peuvent être placés sur des diapositives. Ensuite, les diapositives sont soumises à la déparaffinisation, ou l’enlèvement de la paraffine autour de la tranche de tissu. Ensuite, une étape facultative de récupération d’antigène peut être effectuée. Cela peut être fait en utilisant de la chaleur ou des enzymes pour démasquer les épitopes qui ont été reconnectés pendant la fixation les rendant disponibles pour la fixation des anticorps. Après la préparation appropriée de l’échantillon, un anticorps primaire spécifique à la cible est ajouté à l’échantillon de cellules ou de tissus. Cet anticorps primaire doit se lier à la protéine d’intérêt. Ensuite, un anticorps secondaire est ajouté, qui détecte et se lie à l’anticorps primaire. Cet anticorps secondaire est conjugué à une enzyme appelée HRP ou peut se lier à celle-ci. Lorsque son substrat spécifique, le DAB, est ajouté, HRP convertit cela en un précipité brun insoluble. Cette tache brune marque l’emplacement de la protéine cible. Les diapositives sont également tachées d’hématoxylin, qui étiquette les noyaux en bleu et fournit un point de référence spatial pour déterminer la localisation subcellulaire. Après cela, des supports de montage sont ajoutés à la diapositive, suivis d’un bordereau de couverture afin de sceller et de préserver l’échantillon taché. Enfin, les diapositives peuvent être représentées sur un microscope léger.

Dans cette vidéo, vous observerez la technique de préparation de l’échantillon pour les cellules plaquées et les sections tissulaires, suivie de l’immunostaining des sections tissulaires.

Tout d’abord, les cellules d’intérêt doivent être assises sur des couvertures. Pour ce faire, en travaillant dans une hotte de culture de tissu, placez des couvertures individuelles dans les puits d’une plaque de 24 puits. Ensuite, fermez la ceinture et allumez la lumière UV pour stériliser les couvertures pendant au moins 15 minutes. Ensuite, éteignez la lumière UV. Pour soulever les cellules d’intérêt d’un plat confluent de 10 centimètres, aspirer le support, laver brièvement avec du PBS, et ajouter la trypsine aux cellules pendant 2 minutes. Ensuite, appuyez sur le côté de la plaque pour s’assurer que les cellules se sont détachées et neutraliser la trypsine avec des médias. Ensuite, ajoutez 0. 5 ml de la suspension cellulaire dans chaque puits, en veillant à couvrir les couvertures. Placez la plaque dans un incubateur de CO2 humidifié et laissez les cellules se développer à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient de 50 à 70 % de confluents.

Une fois que les cellules atteignent la confluence optimale, aspirez le milieu de culture de chaque puits, puis fixez les cellules en les incuber dans. 5 ml de paraformaldéhyde dilué à 4 % en 1X PBS pendant 20 minutes à température ambiante. Après avoir enlevé le fixatif, rincer les cellules ajouter 1 ml de 1X PBS sur chaque coverslip. Immédiatement aspirer le PBS, puis répéter le rinçant 2 fois de plus pour un total de 3 lavages.

Maintenant, perméabliser les cellules en ajoutant 0,5 ml de 0,1% Triton X-100 en 1X PBS à chaque puits. Laisser l’assiette à température ambiante pendant 15 minutes. Aspirer le tampon de perméabilisation, puis rincer les cellules en ajoutant 1 ml de 1X PBS dans chaque puits. Immédiatement aspirer hors du PBS et répéter le rinçant 2 fois de plus pour un total de 3 lavages. Maintenant que les cellules sur les couvertures sont fixes et perméabilisées, procédez à la procédure de coloration démontrée pour l’exemple suivant d’immunohistochimie à l’exception que les incubations devraient être exécutées dans les puits de la plaque de 24 puits plutôt que directement sur une diapositive de section de tissu.

Pour commencer, obtenir des sections de tissus préparées, fixées à la formaline et à la paraffine. Déparaffiniser les diapositives en les plaçant dans un toboggan, puis les plonger complètement dans 250 ml de xylène 100%. Laisser les lames incuber pendant 5 minutes dans le xylène. Ensuite, retirez les lames du contenant, essuyez-les avec un essuie-tout et placez-les dans un nouveau bain de xylène dans un contenant frais pendant 5 minutes supplémentaires.

Ensuite, réhydratez les sections dans une série de solutions d’éthanol gradué s’ensuivent avec 100 % d’éthanol pendant 3 minutes. Essuyez le toboggan à l’eau avec un essuie-tout et transférez les lames dans un nouveau contenant d’éthanol à 100 % pendant encore 3 minutes. Poursuivez ce cycle de lavage, de séchage avec un essuie-tout et transférez les glissières dans un nouveau bain suivant les concentrations indiquées d’éthanol pour le temps spécifié. Après le lavage final à l’éthanol, essuyez la grille à l’aide d’un essuie-tout et incubez les glissières dans 100 ml de peroxyde d’hydrogène de 0,3 % pendant 30 minutes à température ambiante afin de bloquer toute activité endogène de peroxidase. Laver les toboggans en 250 ml de 1X PBS pendant 5 minutes. Répétez ce lavage dans un récipient de 1X PBS frais pendant 5 minutes supplémentaires.

Ensuite, effectuez la récupération d’antigène en immergeant les diapositives dans 250 ml de tampon de citrate IHC au pH 6.0 et en les faisant bouillir pendant 20 minutes. Ensuite, passez au protocole de coloration.

Pour commencer le processus de coloration pour iHC, encerclez les sections avec un stylo hydrophobe pour identifier la zone minimale que le tampon doit couvrir. Ensuite, utilisez une pipette pour placer 100 microlitres de tampon de blocage, qui dans cette expérience est sérum de cheval dilué en 1X PBS, sur la section. Incuber les toboggans pendant 1 heure à température ambiante. Après cela, retirez le tampon de blocage à l’aide d’une pipette.

Ensuite, diluer l’anticorps primaire et bloquer tampon à une dilution 1:100 en ajoutant 990 microlitres de sérum de cheval dilué dans 1X PBS dans un 1. 5 mL eppendorf tube, suivie de 10 microlitres de l’anticorps primaire. Ajouter 100 microlitres de l’anticorps primaire dilué à chaque section, et couver les diapositives pendant 30 minutes à température ambiante. Lorsque la minuterie retentit, égouttez l’anticorps primaire de chaque diapositive, puis lavez-les en 250 ml de 1X PBS pendant 5 minutes. Répétez ce lavage une fois de plus en utilisant frais 1X PBS.

Tandis que les glissières se lavent dans 1X PBS, diluent l’anticorps secondaire à une dilution 1:200 en ajoutant 995 microlitres de tampon de blocage à un tube de 1,5 ml suivi de 5 microlitres de l’anticorps secondaire, qui dans ce cas est biotinylated cheval anti-souris IGG. Ajouter 100 microlitres de l’anticorps secondaire dilué à chaque section, puis couver les diapositives pendant 30 minutes à température ambiante. Après 30 minutes, retirez l’anticorps secondaire en le vidant des sections, puis lavez les glissières en 250 ml de 1X PBS pendant 5 minutes. Répétez ce lavage à l’aide de 1X PBS frais.

Maintenant, ajoutez 100 microlitres de réactif complexe avidin-biotine, et incubez les sections dans l’obscurité pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les toboggans en les immergeant dans 250 ml de 1X PBS pendant 5 minutes. Semblable aux étapes de lavage précédentes, répétez ce lavage une fois de plus en utilisant frais 1X PBS. Ensuite, développer les diapositives en couvant les sections dans 100 microlitres de DAB pour un jusqu’à 5 minutes. Arrêtez le développement en immergeant les sections dans 250 ml d’eau distillée pendant 5 minutes.

Maintenant, les diapositives peuvent être contre-tachées, si désiré. Pour ce faire, trempez brièvement les diapositives dans 250 ml de Harris Hematoxylin Solution. Rincer la contre-tache en lavant les lames dans 250 ml d’eau distillée pendant 5 minutes. Répétez ce lavage 1 fois de plus à l’aide d’eau fraîche distillée. Ensuite, déshydratez les sections. Pour ce faire, d’abord couver les diapositives dans 95% d’éthanol pendant 5 minutes. Blot les diapositives sur un essuie-tout, et les transférer dans un nouveau récipient d’éthanol frais 95% pendant un autre 5 minutes. Poursuivre le cycle de lavage, de ballonnement avec un essuie-tout et de transférer les glissières dans un nouveau bain, en suivant les solutions indiquées pendant 5 minutes chacune.

Après l’incubation finale, épongez les diapositives avec un essuie-tout, puis ajoutez une goutte de support de montage, comme le mont Organo-Limonene, aux diapositives. Maintenant, placez un bordereau sur les sections, en prenant soin de ne pas piéger les bulles d’air. Les diapositives sont maintenant prêtes à être observées au microscope pour analyse.

Pour observer les sections tachées, utilisez un microscope léger standard pour visualiser la tache, et un appareil photo numérique pour capturer l’image. Dans cet exemple particulier d’IHC, les tissus de rate de type sauvage et spontanés, double-transgéniques, ou Souris DTG, sont comparés pour étudier l’expression dyclin D1 dans le lymphome. Les tissus étaient paraffins-incorporés, sectionnés, et souillés avec l’anticorps anticyclin D1, et imaged au grossissement 20X. Cyclin D1 cellules exprimantes sont indiqués par la couleur brun-rougeâtre sur le fond du tissu bleu. En comparant les intensités de coloration parmi les images des différentes souris, les rates non agrandies ont des quantités relativement faibles d’expression Cyclin D1 quel que soit le génotype de la souris. En revanche, la rate agrandie de la souris DTG, montre une coloration redâtre-brun accrue indiquant une corrélation entre le développement du cancer et l’expression Cyclin D1 dans ce modèle de souris.