5.6: Génération d'anticorps monoclonaux à l'aide d'hybridomes

Note: La technique de culture des cellules stériles doit être maintenue lors de la manipulation des cellules hybridome et des milieuis de manière stérile (p. ex., dans un cabinet de biosécurité) jusqu'aux étapes de purification des anticorps.

1. Dégeler les cellules hybrides congelées

1. Incuber le flacon contenant les cellules d'hybridome congelées dans un bain d'eau à 37 oC jusqu'à ce qu'il soit juste décongelé (environ 2 minutes).
2. Ajouter les cellules décongelées à un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de RPMI complet (RPMI complété à 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline, 100 streptomycines g/mL, 1 mM de pyruvate de sodium, 1x acides aminés non essentiels, 50 M M 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES).
3. Centrifugeuse pendant 5 min à 1200 tr/min pour laver les supports de congélation contaminants.
4. Après centrifugation, jetez le supernatant liquide et suspendez à nouveau le granule cellulaire dans un RPMI complet frais de 5 ml. Ensuite, ajoutez les cellules à un flacon de culture tissulaire T75 contenant 15 ml de RPMI complet (volume final de RPMI est de 20 ml).
5. Cultivez les cellules dans un incubateur standard à 37oC avec 5% de CO₂. Les cellules ne sont pas adhérentes en culture.

2. Expansion d'Hybridoma

1. Laisser les cellules se développer pendant environ 3 jours jusqu'à ce que le flacon soit un confluent de 80 %.
   Note: Cette durée peut varier en fonction du nombre de cellules de départ, ainsi que des différences inhérentes dans les taux de croissance des différentes cellules. Il est important que les cellules soient dans la phase de croissance exponentielle.
2. Une fois que le flacon initial atteint 80% de confluence, retirer les cellules de ce flacon Initial T75, placer dans un tube de centrifugeuse conique et tourner (1200 tr/min pendant 5 min) pour granuler les cellules.
3. Resuspendre les cellules en 6 ml de RPMI complet, puis distribuer la suspension cellulaire en trois nouveaux flacons T75 (2 mL/flacon contenant 18 mL de RPMI). Incuber ces trois flacons T75 à 37oC avec 5% de CO₂ jusqu'à ce qu'ils soient environ 80% de confluents (cela devrait prendre environ 3 jours).

3. Production d'anticorps dans le milieu sans sérum

Note: À ce stade, les cellules sont prêtes à poursuivre leur croissance dans un milieu sans sérum conçu pour la croissance des lignées cellulaires hybridome. Dans ce protocole, nous utilisons le milieu HB Basal Liquid disponible dans le commerce, disponible dans le commerce, contenant le produit DE supplément HB101.

1. Les cellules de chacun des trois flacons T75 (à 80 % de confluence) sont collectées et centrifuges (1200 tr/min pendant 5 min).
2. Le granule cellulaire de chaque flacon T75 est resuspendu dans un milieu sans sérum HB101 complété de 10 ml, puis ajouté à deux flacons T225 complétés HB101 sans sérum (c.-à-d. une suspension cellulaire de 5 ml dans chacun des 6 flacons contenant 220-240 mL HB101 dans chaque flacon).
3. Continuer à cultiver les cellules dans les flacons T225 et hb101 à 37 oC avec 5 % de CO₂ pendant trois semaines, ou jusqu'à ce que les cellules commencent à mourir. Les cellules produisent du mAb pendant ces 3 semaines et le sécrètent dans le milieu de culture. Une fois que les cellules commencent à mourir, elles ne produisent plus de mAb.

4. Purification d'anticorps - Jour 1

Note: À ce stade, la stérilité n'a pas besoin d'être maintenue, de sorte que la manipulation des médias d'une manière stérile (p. ex., dans un cabinet de biosécurité) n'est pas nécessaire. En outre, les hybridomas ne sont pas considérés comme un agent de « niveau BSL2 ».

1. Verser les supports des flacons dans des tubes pour un rotor à angle fixe. Faire tourner les tubes dans une centrifugeuse avec un rotor à angle fixe à 10 000 tr/min pendant 8 minutes. Cette étape est conçue pour enlever les débris cellulaires du supernatant de culture.
   Note: La taille des tubes peut varier en fonction du rotor utilisé. La chose importante à retenir est d'avoir le même volume dans les tubes pour s'assurer que le rotor est correctement équilibré avant la centrifugation. Il est probable que le volume entier des médias ne s'insèrera pas dans la centrifugeuse en même temps. Les supports restants seront centrifuges plus tard (étape 4.5) à l'aide des mêmes tubes.
2. Préparer un bécher en plastique de 2 L avec une barre à remuer dans un seau entouré de glace. Déposer sur une plaque à remuer.
3. Fixer un dessus de filtre de 500 ml sur une bouteille de 1 L. Fixez l'unité supérieure de filtre de bouteille à l'aspirateur de maison par l'intermédiaire du tube approprié.
4. Verser le supernatant de l'étape 4.1 (qui contient encore le mAb produit par les cellules hybridotomes) dans le dessus du filtre.
5. Continuer à utiliser le même ensemble de tubes pour granuler les débris de cellules du support (le granule continuera à construire). Attendez d'exécuter le vide jusqu'à ce que le dessus du filtre est plein et un autre lot de supernatant est prêt à verser. Ne laissez pas le filtre sécher ou le filtrage deviendra très lent.
6. Lorsque la bouteille de 1L est presque pleine, retirez le dessus du filtre et versez le supernatant dans un bécher de 2 L préparé à l'étape 4.2. Rattache le dessus du filtre. Gardez une trace du volume.
7. Répétez les étapes de centrifugation et de filtration jusqu'à ce que tous les supports soient traités.
8. Mesurer 295g de sulfate d'ammonium par 1L de supernatant filtré recueilli. En remuant, ajoutez lentement le sulfate d'ammonium au supernatant au cours des deux prochaines heures (25 g toutes les 15 minutes) pour éviter une forte concentration localisée de sel de sulfate d'ammonium qui peut provoquer des protéines indésirables à précipiter.
9. Une fois que tout le sulfate d'ammonium a été ajouté, couvrir le bécher de papier d'aluminium et déplacer avec la plaque à remuer à 4 oC (p. ex., réfrigérateur sans rendez-vous ou chambre froide). Remuer toute la nuit. L'agitation constante de la solution est nécessaire pour solubiliser le sel, mais l'agitation prolongée peut conduire à la dénaturation des protéines dans la solution à l'interface surface/air.
10. Laver les tubes à l'aide du rotor à angle fixe.

5. Purification d'anticorps - Jour 2

1. Verser le sulfate d'ammonium contenant le supernatant du bécher 2L dans des tubes pour un rotor à angle fixe. Tourner en centrifugeuse avec rotor à angle fixe à 6500 tr/min pendant 20 minutes sans frein.
2. Aspirez l'aspirateur le supernatant, en prenant soin de ne pas aspirer le granule car il sera doux. Continuer à utiliser le même ensemble de tubes pour recueillir les granulés du sulfate d'ammonium contenant un supernatant.
3. Après la dernière aspiration, resuspendre chaque granule (qui contient des anticorps) en 1 ml de PBS.
4. Retirez le sulfate d'ammonium de la solution mAb précipitée par dialyse contre de grands volumes de PBS. Pour ce faire, coupez d'abord environ 1 pouce de tube de dialyse (p. ex., Membra-Cel MD25-14 MWCO 12 000-14 000 tubes de dialyse de coupure Dalton) pour chaque mL de solution mAb. Mouillez le tube avec dH₂O. Attachez un noeud à une extrémité de la tubulure et remplissez avec dH₂O pour vérifier que le noeud ne fuit pas. Vide dH₂O de la tubulure.
5. Pipette PBS/solution d'anticorps dans le tube. Rincer les tubes avec un PBS supplémentaire de 0,25 ml et transférer dans la tuyauterie.
6. Fixez le haut du tube aussi près que possible de la solution avec un clip de dialyse orange.
7. Ruban adhésif le dessus de la tubulure sur le dessus extérieur d'un bécher de 4 L. Laisser la partie remplie de la tubulure s'accrocher au bécher. Remplir le bécher avec pbS et ajouter une barre d'agitation.
8. Remuer pendant la nuit pendant 8 heures à 4oC.
9. Remplacer le PBS dans le bécher par du PBS frais et remuer pendant 8 heures deux fois de plus.
10. Transférer l'anticorps de la tuyauterie dans des tubes coniques de 15 ou 50 ml. Centrifugeuse pendant 5 minutes à 1200 tr/min pour enlever tout précipité qui pourrait s'être formé. Transférer le supernatant dans un tube frais.
11. Diluer un aliquot d'anticorps 1:20 avec PBS (5 'l anticorps '95 'l PBS). Quantitate la concentration d'anticorps avec un spectrophotomètre (blanc avec PBS) à 280 nm. Utiliser un coefficient d'extinction de 1,43. La concentration est calculée comme
    
    
12. Aliquot l'anticorps dans les flacons de bouchon à vis et stocker à -80 oC.

Les anticorps sont un outil puissant pour la recherche et le diagnostic, ce qui signifie qu’il est souvent nécessaire d’en produire en grande quantité.

La première étape de la génération d’anticorps consiste à injecter l’antigène d’intérêt dans un animal hôte. L’antigène active les lymphocytes B de l’hôte, qui produisent et libèrent ensuite des anticorps spécifiques à cet antigène. Ensuite, un dépistage régulier de l’antisérum de l’animal hôte pour détecter la présence de l’anticorps cible est effectué, à l’aide d’un test ELISA ou d’une autre méthode de détection. Une fois détectée, la rate de l’animal hôte, qui contient les cellules B, est retirée. Si tous les lymphocytes B de la rate sont maintenant isolés, cela devrait inclure une population qui sécrète des anticorps contre l’antigène d’intérêt. Nous appelons cette population polyclonale, car chaque cellule s’est probablement liée à un épitope différent de l’antigène, et a donc généré son propre anticorps individuel et unique.

Pour générer des anticorps monoclonaux, des anticorps élevés pour reconnaître un épitope spécifique, le lymphocyte B individuel qui produit l’anticorps souhaité, doivent d’abord être isolés et cultivés. Malheureusement, les lymphocytes B ne survivent pas bien en culture. Ainsi, pour surmonter cet obstacle, les scientifiques fusionnent les lymphocytes B avec des cellules myélomateuses immortelles, ce qui donne naissance à des hybridomes. Ces cellules sont ensuite cultivées dans un milieu sélectif qui ne permet aux hybridomes que de se développer et de libérer des anticorps. Encore une fois, le milieu est tamisé à l’aide d’une méthode telle que l’ELISA pour l’anticorps souhaité. Une fois détectés, les hybridomes sont clonés via un processus appelé dilution limite, une dilution en série de la culture parente, qui devrait aboutir à l’ensemencement de cellules uniques dans les puits d’une plaque de criblage. Cela permet la croissance d’hybridomes à partir d’une seule cellule parentale, produisant une lignée cellulaire monoclonale qui ne libère que l’anticorps souhaité. Ces lignées monoclonales peuvent être élargies dans des flacons de culture tissulaire pour produire de grandes quantités d’anticorps monoclonaux. Après cela, lorsque les cellules commencent à mourir, les anticorps peuvent être précipités du milieu avec du sulfate d’ammonium. Normalement, en solution, les anticorps interagissent avec l’eau par le biais d’interactions hydrophiles. Cependant, l’ammonium et le sulfate sont des ions hautement chargés qui séparent les molécules d’eau des anticorps, diminuant la solubilité des anticorps et les faisant précipiter.

Pour commencer, vérifiez d’abord la liste des matériaux et préparez tous les supports, fournitures et surfaces de travail pour le protocole.

Ensuite, allumez un bain-marie et réglez-le à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de RPMI complet dans un tube conique de 15 millilitres et 15 millilitres de RPMI complet dans un flacon de culture cellulaire T75 et mettez-les de côté. En faisant preuve de prudence et en portant l’équipement de protection individuelle approprié, retirez le flacon congelé contenant des cellules d’hybridome de l’entrepôt d’azote liquide. Pour relâcher la pression à l’intérieur du flacon, desserrez légèrement le bouchon. Maintenant, incubez soigneusement le flacon dans le bain-marie, en vous assurant que le capuchon reste au-dessus de la surface de l’eau pour minimiser les risques de contamination. Lorsque les cellules sont presque décongelées, ce qui prend généralement environ deux minutes, placez le flacon dans le capuchon de culture de tissus.

Ensuite, essuyez l’extérieur du flacon avec de l’éthanol à 70 % avant de retirer le bouchon. À l’aide d’une pipette stérile, transférez les cellules dans le tube conique qui contient 10 millilitres de milieu RPMI complet. Ensuite, centrifugez le tube pendant cinq minutes à 1200 tr/min. Après la centrifugation, replacez le tube dans le capuchon et essuyez l’extérieur du tube avec de l’éthanol. Sans déranger la pastille, jetez le surnageant, puis ajoutez cinq millilitres de milieu RPMI complet frais et pipetez doucement de haut en bas pour remettre en suspension. Ensuite, transférez les cellules dans le ballon de culture cellulaire T75 et placez le ballon dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Laissez les cellules atteindre une confluence d’environ 80 %, ce qui prend généralement environ trois jours. Notez que les cellules d’hybridome ne sont pas adhérentes et se développeront en suspension dans le milieu. Le temps nécessaire pour atteindre une confluence suffisante peut varier en fonction du nombre initial de cellules vivantes et du type de cellule d’hybridome utilisé.

Une fois que les cellules sont suffisamment confluentes, utilisez une pipette stérile de 25 millilitres pour les transférer du ballon de culture dans un tube de centrifugation conique. Granulez les cellules par centrifugation à 1200 tr/min pendant cinq minutes. Pendant que les cellules sont dans la centrifugeuse, ajoutez 18 millilitres de RPMI complet dans chacun des trois nouveaux flacons de culture cellulaire T75 et mettez-les de côté. Après la centrifugation, retirez le surnageant et remettez doucement en suspension la pastille cellulaire dans six millilitres de RPMI complet. Ensuite, ajoutez deux millilitres de suspension cellulaire dans chacun des trois nouveaux flacons de culture cellulaire. Enfin, placez les flacons dans un incubateur réglé à 5 % de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius et incubez jusqu’à ce que les flacons soient confluents à environ 80 %, soit environ trois jours.

À ce stade, les cellules sont prêtes à poursuivre leur croissance dans le milieu sans sérum conçu pour les lignées cellulaires d’hybridomes, telles que le milieu liquide basal HB disponible dans le commerce contenant le supplément HB101. Transférez les cellules de chaque fiole de culture cellulaire dans des tubes à centrifuger coniques, puis granulez les cellules par centrifugation à 1200 tr/min pendant cinq minutes. Maintenant, ajoutez 230 millilitres de milieu sans sérum HB101 supplémenté dans chacun des six flacons de culture cellulaire de 225 centimètres carrés et mettez-les de côté. Une fois la centrifugation terminée, retirer le surnageant et remettre en suspension chaque pastille dans 10 millilitres de milieu HB101 supplémenté. Ensuite, dans chaque flacon de culture cellulaire, ajoutez cinq millilitres de suspension cellulaire. Placez les flacons dans l’incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius et continuez à faire pousser les cellules pendant environ trois semaines. Pendant ce temps, les cellules produiront et libéreront l’anticorps monoclonal d’intérêt dans le milieu de culture et l’anticorps sera prêt pour la purification lorsque les cellules commenceront à mourir.

Pour éliminer les débris cellulaires du milieu de culture contenant des anticorps, versez le contenu des flacons de culture dans des tubes pour un rotor à angle fixe. Placez les tubes dans le rotor et assurez-vous qu’il est correctement équilibré avant la centrifugation. Faites tourner les tubes à 10 000 tr/min pendant huit minutes. Pendant que les échantillons sont en centrifugation, placez un bécher en plastique de deux litres avec une barre d’agitation dans un seau à glace, puis placez le seau à glace sur une plaque d’agitation.

Ensuite, fixez un filtre de 500 millilitres à une bouteille d’un litre. Fixez cette unité de filtre à bouteille à un aspirateur domestique à l’aide du tube approprié. Ensuite, versez le surnageant qui contient l’anticorps dans le dessus du filtre. Centrifugez le milieu restant pour séparer les débris cellulaires du surnageant contenant des anticorps. Lorsque le dessus du filtre est plein de surnageant, démarrez l’aspirateur. Ensuite, lorsque la bouteille de collecte d’un litre est presque pleine, retirez le dessus du filtre et versez le surnageant filtré dans le bécher de deux litres sur de la glace. Répétez les étapes de filtration jusqu’à ce que tout le surnageant soit traité.

Lorsque tout l’échantillon a été traité, peser 295 grammes de sulfate d’ammonium par litre de surnageant filtré. Démarrez la plaque d’agitation et ajoutez lentement le sulfate d’ammonium au surnageant au cours des deux prochaines heures. Cela permet d’éviter une forte concentration localisée de sel de sulfate d’ammonium qui peut provoquer la précipitation de protéines indésirables. Une fois que tout le sulfate d’ammonium a été ajouté, couvrez le bécher d’une feuille d’aluminium et déplacez-le, avec la plaque d’agitation, dans une pièce froide à quatre degrés Celsius et réglez-le pour remuer la solution d’anticorps pendant la nuit.

Le lendemain matin, versez la solution d’anticorps contenant du sulfate d’ammonium du bécher de deux litres dans des tubes propres pour le rotor à angle fixe. Centrifugez les tubes à 6500 tr/min pendant 20 minutes sans interruption pour granuler l’anticorps au fond des tubes. Ensuite, aspirez le surnageant sous vide, en faisant attention de ne pas aspirer la pastille molle. Continuez à utiliser le même ensemble de tubes pour recueillir l’anticorps granulé à partir du reste du surnageant contenant du sulfate d’ammonium. Après la dernière aspiration, remettre en suspension chaque pastille d’anticorps dans environ un millilitre de PBS.

Pour retirer le sulfate d’ammonium de la solution d’anticorps, coupez d’abord environ un pouce de tube de dialyse pour chaque millilitre de solution d’anticorps. Ensuite, essuyez le tube avec de l’eau distillée et faites un nœud à une extrémité du tube. Remplissez le tube d’eau distillée pour vérifier s’il y a des fuites du nœud. S’il n’y a pas de fuite après quelques minutes, videz l’eau du tube.

Ensuite, pipetez la solution d’anticorps dans la tubulure. Pour récupérer autant d’anticorps que possible, rincez les tubes avec 0,25 millilitre supplémentaire de PBS et transférez-le également dans le tube. Fixez le haut de la tubulure aussi près que possible de la solution à l’aide d’une pince de dialyse. Ensuite, collez le haut du tube sur le haut extérieur d’un bécher de quatre litres avec la partie remplie du tube suspendue dans le bécher. Maintenant, emmenez le bécher dans la chambre froide à quatre degrés Celsius et placez-le sur une plaque à mélanger. Remplissez le bécher jusqu’en haut avec du PBS et ajoutez un agitateur. Laissez le tube et la solution remuer pendant la nuit pendant environ huit heures. Le lendemain matin, remplacez le PBS dans le bécher par du PBS frais, puis laissez le bécher remuer à nouveau pendant environ huit heures. Plus tard dans la soirée, répétez le processus une dernière fois. Le matin, ouvrez le tube de dialyse, puis transférez la solution d’anticorps du tube dans des tubes coniques de 15 millilitres. Pour éliminer tout précipitant qui aurait pu se former pendant la dialyse, centrifugez les tubes pendant cinq minutes à 1200 tr/min. Enfin, transférez le surnageant dans des tubes frais.

Pour quantifier la concentration d’anticorps, effectuez d’abord une dilution de 20 fois en ajoutant cinq microlitres d’une aliquote d’anticorps à 95 microlitres de PBS. Ensuite, pipetez l’anticorps dilué dans une cuvette et utilisez un spectrophotomètre pour enregistrer la concentration à 280 nanomètres. Ensuite, calculez la concentration d’anticorps à l’aide de la formule indiquée. Enfin, étiquetez les flacons à bouchon à vis avec le nom de l’anticorps, la concentration, la date de préparation et, le cas échéant, le numéro de lot et le nom de l’expérimentateur, puis aliquotez-le de l’anticorps dans les flacons à bouchon à vis étiquetés. Ceux-ci peuvent être stockés à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

Des exemples de rendements avec la lignée d’hybridome anti-souris CD317 ou PDCA-1 120G8 variaient entre 44 et 99,6 milligrammes, ce qui donne généralement, en moyenne, 67,3 milligrammes. Il est important de noter que chaque cycle de production avec la même lignée cellulaire d’hybridome peut être légèrement différent dans la quantité d’anticorps monoclonaux disponibles à la fin.