$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Pour la plupart des études d’immunologie, la mesure de la prolifération des cellules immunitaires est une étape clé et la méthode à base de colorant fluorescent CFSE est couramment utilisée. Une bonne division cellulaire est importante pour les cellules immunitaires car elle régule à la fois les niveaux et la spécificité d’une réponse immunitaire. Par exemple, les lymphocytes T prolifèrent pour identifier et tuer les cellules cancéreuses et les lymphocytes B subissent une division cellulaire pour produire des anticorps spécifiques. Le principe général du test CSFE consiste à colorer les cellules avec le colorant fluorescent vert CFSE, qui pénètre dans les cellules vivantes et se lie de manière stable aux protéines à l’intérieur, ce qui entraîne un marquage permanent. En conséquence, lorsque la cellule mère contenant un colorant se divise, chaque cellule fille reçoit la moitié de la fluorescence de la cellule mère.
Ce processus se poursuit dans les divisions suivantes, l’intensité du colorant diminuant progressivement à chaque division. Au point final souhaité, l’intensité de fluorescence de chaque cellule est mesurée par cytométrie en flux. Ces données sont ensuite utilisées pour quantifier le nombre et le modèle de divisions que les cellules ont subies. Comme le montre ici, la population cellulaire avec la fluorescence la plus élevée provient de la génération parente. Le deuxième plus élevé appartient à la deuxième génération et ainsi de suite. Le nombre de pics détermine le nombre de divisions cellulaires.
De plus, si des cellules immunitaires primaires sont utilisées, des populations cellulaires spécifiques, comme les cellules T par exemple, peuvent être marquées avec un colorant de fluorescence de couleur différente avec CFSE, et identifiées simultanément à l’aide de la cytométrie en flux multicolore. Les nouvelles données peuvent être tracées sur le même graphique, montrant maintenant la sous-population de lymphocytes T avec différentes intensités de coloration CFSE, par lesquelles le taux de prolifération des lymphocytes T peut être analysé de manière spécifique. Cette vidéo montre le protocole de coloration CFSE des splénocytes de souris, qui sont stimulés par un anticorps anti-CD3. S’ensuit une coloration pour marquer les lymphocytes T et une cytométrie en flux pour suivre leur prolifération cellulaire.
Pour commencer, mettez des vêtements de protection appropriés et des gants de laboratoire. Ensuite, lavez une paire de pinces et de ciseaux à disséquer d’abord avec un détergent, puis avec de l’éthanol à 70 %, puis essuyez-les avec une serviette en papier propre. Préparez 50 millilitres de solution saline équilibrée de Hank, ou HBSS, avec une concentration de 2 % de sérum de veau fœtal, ou FCS, en combinant un millilitre de FCS avec 49 millilitres de HBSS dans un tube de 50 millilitres. Mélangez en pipetant doucement la solution de haut en bas environ 10 fois. Ensuite, isolez les cellules de la rate de souris comme démontré dans le protocole vidéo pour l’isolement FACS des lymphocytes B spléniques.
Étiquetez quatre tubes de 15 millilitres de un à quatre et ajoutez une fois 10 aux sept cellules de rate isolées. Ensuite, ajoutez trois millilitres de HBSS 2 % FCS dans chaque tube. Ensuite, pipetez un microlitre de cinq micromolaires d’ester succinimidylique de carboxyfluorescéine, ou CFSE, dans chaque tube. Incuber les tubes à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone pendant 10 minutes. Les cellules des tubes un et deux ne seront pas stimulées. Ils seront utilisés pour révéler le niveau basal de prolifération des lymphocytes T CD4 et CD8 spléniques.
Pipette 10 millilitres de HBSS 2 % FCS dans ces tubes. Les tubes trois et quatre seront stimulés par des anticorps anti-CD3 afin d’observer les effets sur le cycle cellulaire. Ajoutez 10 millilitres d’anticorps HBSS 2 % FCS et anti-CD3 à une concentration finale de 2,5 microgrammes par millilitre dans les tubes trois et quatre. Ensuite, centrifugez tous les tubes à 370 x g pendant sept minutes à 10 degrés Celsius. Jetez les surnageants. Remettez les granulés en suspension dans deux millilitres de HBSS 2 % FCS et pipetez les solutions obtenues dans des puits séparés sur une plaque à six puits. Étiquetez soigneusement la plaque de un à quatre pour garder une trace de l’identité des échantillons. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant trois jours.
Le troisième jour, ajoutez deux millilitres de HBSS 2 % FCS dans les puits un et trois, qui devraient contenir les cellules des tubes un et trois. Pipette de haut en bas vigoureusement, puis transférez les échantillons dans des tubes FACS de cinq millilitres étiquetés. Remettez la plaque à six puits dans l’incubateur. Les cellules restantes des puits deux et quatre seront analysées le cinquième jour afin d’étudier les effets à long terme de la stimulation sur le cycle cellulaire. Centrifugez les tubes à 370 x g pendant sept minutes à 10 degrés Celsius, puis jetez les surnageants. Maintenant, ajoutez 100 microlitres de mélange d’anticorps dans chaque tube. Incuber les tubes pendant 20 minutes sur de la glace dans l’obscurité. Ensuite, ajoutez un millilitre de HBSS 2 % FCS dans chaque tube et centrifugez les tubes à 370 x g pendant sept minutes à 10 degrés Celsius. Jetez les surnageants. Remettez les granulés en suspension dans 200 millilitres de HBSS 2 % FCS et mélangez bien. Transférez les granulés remis en suspension dans de nouveaux tubes FACS étiquetés.
Ensuite, évaluez la prolifération des lymphocytes T à l’aide de la cytométrie en flux, comme indiqué dans le protocole FACS. Gate les cellules pour sélectionner les cellules lymphoïdes CD3 positives et distinguer les cellules CD4 positives et CD8 positives, et enregistrer les données pour les tubes un et trois. Le cinquième jour, répétez le processus de coloration cellulaire avec les cellules des deux puits restants de la plaque à six puits.
Nous analyserons les effets de la stimulation CD3 sur le cycle cellulaire des cellules CD4 et CD8 positives trois jours et cinq jours après la stimulation. Pour commencer, cliquez sur l’icône FlowJo et faites glisser vos fichiers dans la fenêtre Tous les échantillons. Double-cliquez sur le fichier des cellules non stimulées collectées le troisième jour pour afficher un graphique à points avec dispersion vers l’avant sur l’axe des y et diffusion latérale sur l’axe des x. Cliquez sur le polygone pour encercler les populations de lymphocytes en fonction de leur morphologie. Dans la fenêtre d’identification de la sous-population, nommez les lymphocytes de la population et cliquez sur OK. Ensuite, double-cliquez sur la population encerclée et, dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez Thy1.2 sur l’axe des y et CD3 sur l’axe des x. Ensuite, cliquez sur le polygone pour encercler les cellules CD3 et Thy1.2 double positives. Dans la nouvelle fenêtre d’identification de la sous-population, nommez la population T-Cells et cliquez sur OK. Ensuite, double-cliquez sur la population encerclée. Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez CD4 sur l’axe des y et CD8 sur l’axe des x. Ensuite, cliquez sur le polygone pour entourer la population CD4 positive. Dans la fenêtre d’identification de la nouvelle sous-population, nommez la population Lymphocytes T CD4 et cliquez sur OK. Maintenant, cliquez sur le polygone pour entourer la population CD8 positive. Dans la nouvelle fenêtre d’identification de la sous-population, nommez la population CD8 T-Cells et cliquez sur OK. Répétez ces étapes avec les autres fichiers.
Pour déterminer les fréquences des cellules en division et non divisées, visualisez d’abord les populations de cellules en cliquant sur Éditeur de mise en page. Ensuite, faites glisser les lymphocytes T CD4 et CD8 de chacun des quatre tubes vers la fenêtre Tous les échantillons. Des graphiques représentant vos populations apparaîtront. Pour chaque tube, double-cliquez sur le graphique à points des cellules T CD8 et sélectionnez Histogramme sous Définition du graphique pour visualiser les résultats. Sélectionnez CFSE comme paramètre pour comparer les populations cellulaires stimulées et non stimulées à chaque point temporel. Les cellules non divisées maintiennent des niveaux plus élevés de CFSE, tandis que les cellules proliférantes divisent le contenu de CFSE en cellules en division.
Maintenant, tout en appuyant sur la touche Maj, double-cliquez sur l’histogramme. Dans la nouvelle fenêtre, cliquez sur plage et sélectionnez la plage de CFSE correspondant au pic le plus élevé. Dans la fenêtre d’identification de la sous-population, nommez la population Lymphocytes T CD8 non divisibles et étiquetez la population Lymphocytes CD8 en division. Maintenant, répétez l’opération pour sélectionner les lymphocytes T CD4 divisibles et non diviseurs dans chaque tube. Pour examiner la fréquence de division des cellules CD3 positives, cliquez sur l’éditeur de table. Ensuite, faites glisser les populations d’intérêt, Division des lymphocytes T CD8 et Division des lymphocytes T CD4, dans le tableau. Dans le menu Statistique, sélectionnez Fréquence des cellules T. Ensuite, cliquez sur Créer une table pour afficher la fréquence dans une nouvelle table.
