Analyse du cycle cellulaire : utilisation de la coloration CFSE et de la cytométrie de flux pour évaluer la prolifération des lymphocytes T CD4 et CD8 après stimulation

1. Préparation

1. Avant de commencer, enfilez des gants de laboratoire et les vêtements de protection appropriés.
2. Stériliser tous les outils de dissection, d'abord avec un détergent, puis avec 70% d'éthanol, puis les essuyer soigneusement.
3. Préparer 50 ml de la solution de sel équilibrée de Hank (HBSS) contenant 2 % de sérum fœtal de veau (FCS).

2. Dissection

1. À l'aide d'un système de distribution de dioxyde de carbone, euthanasiez la souris par hypoxie. Fixez la souris euthanasiée sur une plaque de dissection en position de supine et effectuez une laparotomie longitudinale à l'aide de ciseaux et de forceps.
2. À l'aide de forceps, déplacez les intestins et l'estomac sur le côté droit de l'abdomen pour exposer l'estomac et la rate. La rate est attachée à l'estomac.
3. À l'aide de forceps, détachez soigneusement la rate de l'estomac et placez-la dans le plat Petri contenant 5 ml de HBSS 2% FCS.

3. Isolement des cellules immunitaires

1. Déposer la rate sur une passoire cellulaire de 40 m sur le même plat Petri. Écraser la rate avec un piston pour la dissocier.
2. Transférer la rate dissociée et le liquide dans un tube centrifugeuse de 15 ml.
3. Centrifuger le tube à 370 x g pendant 7 min à 10oC et jeter le supernatant en évitant la pastille.
4. Resuspendre la pastille dans 2 ml d'acétate de potassium pour lyser les érythrocytes. Attendez 2 min, puis faites le volume jusqu'à 15 ml à l'aide de HBSS 2% FCS.
5. Centrifuger le tube à nouveau à 370 x g pendant 7 min à 10oC. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 5 ml de HBSS 2% FCS.
6. Comptez les cellules à l'aide d'un test de coloration bleu trypan et ajuster la concentration cellulaire finale à 10⁷ cellules/mL en utilisant un volume approprié de HBSS 2% FCS.

4. Staining CFSE et stimulation des lymphocytes T

1. Distribuer 10⁷ cellules de rate isolées/tube dans 4 tubes (tubes de 15 ml, étiquetés 1 à 4)