Name: Analysant lexpression de gènes à partir communautés microbiennes marines utilisant Transcriptomique environnement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: Découvrez la méthode de transcriptomique environnementale pour analyser l'expression des gènes dans les communautés microbiennes marines. Cette approche combine l'extraction d'ARN, l'amplification de l'ARNm et la synthèse d'ADNc pour le séquençage.

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Le financement a été fourni par la Gordon and Betty Moore Foundation et subventions de la National Science Foundation accorde MCB-0702125.

<ol><li>Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).</li>
<li>Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. , Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).</li>
<li>Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71 (7), 4121-4121 (2005).</li>
<li>Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).</li>
<li>Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).</li>
<li>Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).</li>
<li>Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).</li>
</ol>

L&#39;enquête de l&#39;expression génique par les communautés microbiennes naturelles est devenue courante ces dernières années comme un moyen d&#39;explorer les rôles et les fonctions écologiques des micro-organismes. Utilisé en combinaison avec la détection, la quantification et la caractérisation des micro-organismes marins, des analyses d&#39;expression génique peut être utilisé pour relier la phylogénie de fonctionner dans les communautés microbiennes naturelles. De nombreuses techniques pour cibler l&#39;expressio...

<table><tbody><tr><td>Tubes à billes PowerSoil</td><td>kit</td><td>MoBio</td><td>12866-25-PBT</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNeasy Mini</td><td>kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNA-&lt;em&gt;free&lt;/em&gt;</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>Kit d'isolement d'ARNm procaryote mRNA-ONLY</td><td>kit</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>MOP51010/MOP51024</td><td></td></tr><tr><td>KIT MICROB&lt;em&gt;Express&lt;/em&gt; d'enrichissement d'ARNm bactérien</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td>AM1905</td><td></td></tr><tr><td>KIT MICROB&lt;em&gt;Enrich&lt;/em&gt;</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td>AM1901</td><td></td></tr><tr><td>Kit MessageAmp II-Bacteria d'amplification d'ARN</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td>AM1790</td><td></td></tr><tr><td>Système universel de synthèse d'ADNc RiboClone</td><td>kit</td><td>Promega Corp.</td><td>C4360</td><td></td></tr><tr><td>Système Wizard de purification de l'ADN</td><td>kit</td><td>Promega Corp.</td><td>A7280</td><td></td></tr></tbody></table>

analysant l&#39;expression de gènes à partir communautés microbiennes marines utilisant transcriptomique environnement

Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics

Analogue à la métagénomique, transcriptomique de l&#39;environnement (metatranscriptomics) récupère et les séquences des ARNm de l&#39;environnement à partir d&#39;un assemblage de micro sans connaissance préalable de ce que les gènes de la communauté pourrait être exprimer. Ainsi, il offre la perspective la plus impartiale sur l&#39;expression du gène de la Communauté<em&gt; In situ</em&gt;. L&#39;environnement protocoles transcriptomique sont techniquement difficiles depuis ARNm procaryotes n&#39;ont généralement pas la poly (A) qui font des queues de messages l&#39;isolement eucaryotes relativement simple<sup&gt; 1</sup&gt; Et à cause de la demi-vie relativement courte des ARNm<sup&gt; 2</sup&gt;. En outre, les ARNm sont beaucoup moins abondantes que ARNr dans les extraits d&#39;ARN total, donc un fond d&#39;ARNr dépasse souvent les signaux d&#39;ARNm. Cependant, des techniques pour surmonter certaines de ces difficultés ont été récemment développés. Une procédure d&#39;analyse des transcriptomes de l&#39;environnement en créant des bibliothèques de clones en utilisant des amorces aléatoires pour inverser-transcrire et amplifier les ARNm de l&#39;environnement a récemment été décrit a été réussie dans deux différents milieux naturels, mais les résultats ont été biaisés par la sélection des amorces aléatoires utilisées pour initier la synthèse d&#39;ADNc<sup&gt; 3</sup&gt;. Les progrès de l&#39;amplification linéaire de l&#39;ARNm de parer à la nécessité pour les amorces aléatoires dans l&#39;étape d&#39;amplification et permettent d&#39;utiliser moins de matières de départ diminue la collecte et le temps de traitement des échantillons et minimisant ainsi la dégradation de l&#39;ARN<sup&gt; 4</sup&gt;.<em&gt; In vitro</emMéthodes de transcription&gt; pour l&#39;ARNm amplifiant impliquent polyadenylating l&#39;ARNm et en incorporant un promoteur T7 sur l&#39;extrémité 3 de la transcription. Amplifié ARN (ARNa) peuvent ensuite être convertis en ADNc double brin en utilisant des hexamères aléatoires et séquencé directement par pyroséquençage<sup&gt; 5</sup&gt;. Une première utilisation de cette méthode à la station ALOHA démontré son utilité pour la caractérisation de l&#39;expression des gènes microbiens communauté<sup&gt; 6</sup&gt;.

Nous présentons une méthode pour générer des ADNc de l&#39;ARNm de l&#39;environnement. En général, l&#39;ARN total est d&#39;abord recueilli de l&#39;environnement, l&#39;ARNr est enlevé sélectivement, l&#39;ARNm est sélectivement amplifié, et l&#39;ADNc synthétisé à partir de la piscine ARNm enrichi est séquencé. Séquences récupérés peuvent être annotés en utilisant des techniques standard de la bioinformatique pour identifier les gènes exprimés.

Analysant l&#39;expression de gènes à partir communautés microbiennes marines utilisant Transcriptomique environnement

À l'instar de la métagénomique, la transcriptomique environnementale (métatranscriptomique) permet d'extraire et de séquencer les ARNm environnementaux provenant d'un assemblage microbien...

Cette procédure commence par l'acquisition de biomasse microbienne marine à partir d'échantillons d'eau par préfiltration à travers des filtres de cinq et trois micromètres, suivie de la collecte sur un filtre de 0,22 micromètre. L'ARN total est ensuite extrait des organismes retenus sur le filtre de 0,22 micromètre. Notre ARN est éliminé de l'ARN total par dégradation enzymatique sélective, puis l'ARNm enrichi est amplifié linéairement par ajout d'une queue polyA et par transcription in vitro.L'ARN antisense amplifié est ensuite converti en ADN bicaténaire à l'aide d'un hexamère aléatoire. L'ADN bicaténaire obtenu peut être cloné et séquencé ou directement soumis à un séquençage par pyroséquençage. Bonjour, je suis Rachel Persky du laboratoire de la Dre Marianne Moran au Département des Sciences Marines de l'Université de Géorgie.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'analyser l'expression génique à partir d'échantillons environnementaux, en utilisant la méta-transcriptomique environnementale. Scott Gifford vous montrera comment traiter des échantillons environnementaux afin de recueillir l'ARN.Je vais vous montrer comment extraire l'ARN à partir des éc

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Analyse bactérienne expression génique par puces à ADN

Construction d'une bibliothèque fosmide avec l'ADN génomique environnementale isolé du continuum profondeur verticale d'un fjord saisonnière hypoxiques est décrite. La bibliothèque clone résultant est capté dans les plaques 384 puits et archivées pour le séquençage et l'aval de criblage fonctionnel par l'application d'un système de picking colonie automatisés.

Grand Insérer production bibliothèque génomique de l&#39;environnement

Une méthode pour l'extraction de métabolite communautés planctoniques microbiens est présenté. Échantillonnage ensemble de la communauté est réalisée par filtration sur des filtres spécialement préparés. Après lyophilisation, aqueuse-solubles métabolites sont extraits. Cette approche permet une application de la métabolomique environnementaux trans-omique enquêtes de communautés microbiennes naturelles ou expérimentales.

Concentration des métabolites issus de communautés planctoniques à faible densité de l&#39;environnement en utilisant métabolomique résonance magnétique nucléaire

La caractérisation de la communauté microbienne est un objectif de longue date en microbiologie environnementale. Les méthodes de séquençage de nouvelle génération permettent désormais de caractériser les communautés microbiennes à une profondeur sans précédent avec un coût et une main-d’œuvre minimes. Nous détaillons ici notre approche pour séquencer les gènes de l’ARN ribosomique 16S bactérien à l’aide d’un séquenceur de paillasse.

La nouvelle génération de séquençage de l&#39;ARN ribosomal 16S gènes amplicons

Ici, nous présentons un protocole complet pour évaluer la disponibilité des nutriments organiques et inorganiques ainsi que l’abondance et la structure des communautés microbiennes et virales dans les environnements marins éloignés.

Démêler les joueurs invisibles dans l&#39;océan - un guide de terrain à la chimie de l&#39;eau et de microbiologie marine

Ce manuscrit décrit l’utilisation de la technologie de pointe fournie par les puces à ADN. Les microréseaux fournissent une vue d’ensemble des changements transcriptomiques chez les bactéries subies dans une condition spécifique. De plus, nous soulignons la facilité avec laquelle de grandes quantités de données peuvent être analysées à l’aide de progiciels pratiques développés en interne.

Un pipeline rapide et fiable pour l&#39;étude de cas analyse bactérienne transcriptome: Serine dépendant régulation des gènes dans<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Ce protocole permet l’extraction et la concentration de protéines et d’ADN à partir de biomasse microbienne prélevée dans l’eau de mer, suivie de la génération de peptides tryptiques adaptés à l’analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse en tandem.

Un microbienne aquatique métaprotéomique Workflow: à partir de cellules à tryptique peptides appropriés pour l&#39;analyse comparative-spectrométrie de masse en tandem

Nous avons développé un protocole rapide, sensible et reproductible pour le profilage de l’expression génique des agents pathogènes au cours d’une infection.

Profil d&#39;expression génique de microbes infectant utilisant une plateforme numérique de codage de bar

Un protocole permettant de quantifier les gènes et les transcrits de l’ARNr bactérien 16S des sédiments côtiers par PCR en temps réel est fourni. La méthodologie comprend la co-extraction de l’ADN et de l’ARN ; préparation d’ARN libre d’ADN ; et la quantification du gène et du transcrit de l’ARNr 16S par RT-q-PCR, y compris la construction de la courbe standard.

ARN-ADN Extraction simultanée de sédiments côtiers et Quantification de 16S ARNr et Transcriptions par PCR en temps réel

Nous présentons ici un protocole pour étudier les impacts de la fracturation hydraulique sur les cours d’eau voisins en analysant leurs communautés microbiennes d’eau et de sédiments.

Évaluation de l’impact de la fracturation hydraulique sur les cours d’eau à l’aide de signatures moléculaires microbiennes

Le protocole détecte les principaux gènes du cycle du méthane dans les zones humides côtières du sud du Texas et visualise leur distribution spatiale afin d’améliorer la compréhension de la régulation du méthane et de ses impacts environnementaux dans ces écosystèmes dynamiques.

Visualisation de la dynamique microbienne du cycle du méthane dans les zones humides côtières

Découvrez la méthode de transcriptomique environnementale pour analyser l'expression des gènes dans les communautés microbiennes marines. Cette approche combine l'extraction d'ARN, l'amplification de l'ARNm et la synthèse d'ADNc pour le séquençage.

Analysant l'expression de gènes à partir communautés microbiennes marines utilisant Transcriptomique environnement

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