Analysant l'expression de gènes à partir communautés microbiennes marines utilisant Transcriptomique environnement

Cette procédure commence par l’acquisition de la biomasse microbienne marine à partir d’échantillons d’eau par préfiltration à travers des filtres à cinq et trois micromètres, suivie d’un prélèvement sur un filtre de 0,22 micromètre. L’ARN total est ensuite extrait des organismes retenus sur le filtre de 0,22 micromètre. Notre ARN est éliminé de l’ARN total par dégradation enzymatique sélective et l’hybridation soustractive enrichie en Mr.N est amplifiée linéairement par filonnage polyA et transcription in vitro.

L’ARN antisens amplifié est ensuite converti en CD NA double brin à l’aide d’un hexamère aléatoire. Le CD NA résultant peut être cloné et séquencé ou directement pyroséquencé. Bonjour, je suis Rachel Persky du laboratoire du Dr Marianne Moran au Département des sciences marines de l’Université de Géorgie.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour examiner l’expression des gènes à partir d’échantillons environnementaux. Utilisation de la méta-transcriptomique environnementale. Scott Gifford vous montrera comment traiter des échantillons environnementaux pour la collecte d’ARN.

Je vais vous montrer comment extraire l’ARN des échantillons et des RIN Johanna. AON démontrera l’élimination de l’ARN. Maria Kosta passera ensuite par les étapes d’amplification de l’ARN et de synthèse de CD NA.

Alors commençons. Pour commencer la collecte d’ARN environnementaux, nous mettons en place le système de conduite de filtration en plaçant une extrémité du tube dans l’eau à la profondeur souhaitée pour l’échantillonnage et fixons l’extrémité opposée à un filtre à haut volume de trois micromètres en plaçant la pompe entre les deux extrémités du tube. Le filtre à trois micromètres est ensuite connecté à la tour de filtre de 0,22 micromètre et le flux sortant est dirigé de la tour de 0,22 micromètre vers une cargaison graduée.

Faites couler plusieurs litres d’eau dans le système pour rincer. Lorsque vous avez terminé, retirez le tube de l’eau pendant que la pompe fonctionne pour purger l’eau restante de la conduite. Ensuite, à l’aide d’une paire de pinces, placez un filtre de 0,22 micromètre sur la tour de filtre et fermez-la.

Remettez l’extrémité de la conduite dans l’eau et allumez la pompe. Laissez l’air être purgé des deux filtres et surveillez le volume d’eau filtré avec le sur la tourie. Une fois que le volume souhaité a été filtré, retirez la conduite de l’eau et versez l’eau restante du système.

Dès que le filtre est sec, retirez rapidement la plaque filtrante supérieure et pliez le papier filtre. Placez le filtre dans un tourbillon et congelez-le dans de l’azote liquide. Avant de commencer l’expérience, il est important de noter qu’étant donné que les ARN sont omniprésents et qu’ils se dégradent rapidement, les précautions standard pour travailler dans un environnement sans ribonucléase doivent être suivies, y compris les surfaces de travail et les pipettes.

Dans cet esprit, des gants propres doivent être portés lors de la manipulation de tout matériau utilisé dans cette procédure. Et les échantillons doivent être traités dans les plus brefs délais. Pour commencer l’extraction totale de l’ARN à partir du filtre de 0,22 micromètre, nous préparons des tubes de perles en ajoutant huit millilitres de tampon RLT avec du bêta-métoéthanol ajouté à un tube conique de 50 millilitres.

Ensuite, un à deux millilitres de billes d’ARN provenant d’un kit mobile d’extraction de sol à puissance électrique sont ajoutés. Retirez rapidement le filtre congelé du congélateur et gardez-le dans le sac à main. Brisez-le avec un maillet.

Ajoutez le filtre brisé dans le tube conique de 50 millilitres préparé et scellez le couvercle du tube avec un parfum ou un vortex de ruban adhésif de laboratoire pendant 10 minutes. Ensuite, centrifugez le tube de 50 millilitres à 5 000 tr/min pendant une minute. À température ambiante, retirez autant de lysat que possible et transférez-le dans un tube de 15 millilitres avant de centrifuger à nouveau pendant cinq minutes.

À 5 000 fois G, le surnageant est ensuite transféré dans un nouveau tube de 50 millilitres et un volume de 100 % d’éthanol est ajouté au lysat. À l’aide d’une seringue de 10 millilitres, aspirez le lysat à travers une aiguille de calibre 18 à 21 et repassez-le environ cinq fois. Pour les étapes d’extraction suivantes, utilisez le KaiGen R et le mini kit easy en suivant les instructions du fabricant, en appliquant le lysat sur la colonne fournie avec le collecteur à vide ou avec une centrifugation répétée.

Quantifier la spectrospectrométrie d’ARN total. Après avoir déterminé le rendement total en ARN, nous utilisons le kit Ambien turbo DNA free selon les instructions du fabricant pour éliminer toute contamination par l’ADN. Maintenant que les extractions d’ARN sont terminées, je vais remettre l’ARN total à Johanna, qui va faire la première et la deuxième étape d’élimination de l’ARNr.

Merci Rachel. Pour commencer l’élimination de l’ARNR, mélangez doucement et centrifugez brièvement l’ARNm seulement 10 fois le tampon de réaction avant de l’utiliser dans un tube stérile de 0,5 millilitre sans ARN, combinez les volumes appropriés de tampon de réaction 10 fois l’inhibiteur d’ARN, l’échantillon d’ARN total et l’exonucléase terminatrice. Selon le protocole de l’épicentre, incubez la réaction à 30 degrés Celsius pendant 60 minutes dans un thermocycleur avec un couvercle chauffé ou un bain-marie.

Ensuite, terminez la réaction avec une précipitation d’éthanol phénolique En ajoutant d’abord de l’eau libre d’ARN à un volume total de 200 microlitres, puis en ajoutant un volume d’une solution individuelle de phénol chloroforme à la centrifugeuse d’ARNm. Récupérez la phase aqueuse, puis précipitez avec de l’éthanol à cent pour cent et assautez. Il s’agit d’un point d’arrêt potentiel.

L’ARN peut être stocké à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à utiliser l’échantillon dans des applications en aval. Une fois que nous aurons terminé le premier enrichissement en ARNm, nous utiliserons les kits Ambien microbe enrich et microbe express conformément aux instructions du fabricant pour éliminer tout ARNr résiduel de notre échantillon. Pour faciliter l’élimination de l’ARNR eucaryote, nous utiliserons le kit d’enrichissement microbien.

Tous les volumes sont déterminés en lisant les instructions du fabricant. Pour commencer la pipette, 300 microlitres de tampon de liaison dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter cinq à 100 microgrammes d’ARN total dans un volume maximum de 30 microlitres et vortex.

Ajoutez doucement deux microlitres d’oligomélange de capture pour cinq microgrammes d’ARN dans le tampon de liaison et tapotez doucement le tube. Essorez brièvement le mélange. Dénaturez le mélange à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes avant de l’agenouiller à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Au cours de cette incubation, préparez les billes d’oligo mag en les lavant une fois dans de l’eau libre de nucléases et une fois dans un tampon de liaison, et en capturant les billes sur un support magnétique entre les lavages. Conservez les perles sur de la glace et réchauffez-les à température ambiante. Cinq minutes avant l’utilisation, chauffez la solution de lavage à 37 degrés Celsius dans un bloc de chaleur.

Ajoutez le mélange d’oligo-munitions de capture d’ARN aux billes d’oligo-aimants lavées, enterrez-les, mélangez doucement le tube et essorez. Incuber brièvement le mélange à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Placez le tube dans le support magnétique et attendez environ trois minutes avant d’aspirer l’ARNm contenant le surnageant, puis de le transférer dans un tube de collecte sur de la glace.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de lavage préchauffée aux billes capturées. Et doucement vortex, capturez les perles et récupérez le fou surnageant. Ce surnageant avec Mr.NA dans le tube de collecte sur de la glace.

Placez un tube de prélèvement sur de la glace tout en vous préparant à éliminer l’ARNR procaryote à l’aide du kit ambi microbe express, que nous utiliserons pour éliminer le procaryote résiduel, l’ARNR. Utilisez un bioanalyseur ou Experion pour vérifier la contamination par l’ARNR et l’IRM. Qualité NA. Il s’agit d’un point d’arrêt potentiel.

L’ARN peut être stocké à moins 80 degrés Celsius. Une fois l’ARNR retiré, nous utiliserons le kit de bactéries Ambien message AMP two selon les instructions du fabricant pour amplifier notre ARNm. Maintenant que nous avons un échantillon pur d’ARNm, je vais céder la parole à Maria, qui vous expliquera l’amplification de l’ARNm et la synthèse de l’ARNC.

Merci, Hannah. Avant de commencer l’amplification de l’ARNm, de calculer les volumes de chaque composant du message Ambien AMP two bacteria kit master mixes en ligne, nous commençons la polyadénylation de l’ARN matrice en plaçant jusqu’à 1000 nanogrammes d’ARN total dans un tube de micro-fuge stérile sans ARN. Utilisez 6,5 microlitres d’échantillon et pas d’eau exempte d’ARN dans le premier tampon pour synthétiser un ARN par transcription in vitro.

Il est recommandé d’utiliser un four d’hybridation ou un incubateur en raison de leur température uniforme. Et parce qu’il est extrêmement important qu’il ne se forme pas de condensation à l’intérieur des tubes, nous recommandons fortement une incubation par réaction de transcription in vitro de 14 heures. Pour maximiser un rendement en ARN pour le rendement en ARN A le plus élevé, effectuez l’IBT dans un volume de réaction final de 40 microlitres, stockez l’ARN A à moins 80 degrés Celsius en quats d’environ 10 microlitres.

Une fois l’ARN amplifié, il est temps de synthétiser l’ARN complémentaire ou ADNC. Le clone universel de ribot Promega. Le kit de système de synthèse CDNA est utilisé pour synthétiser le CD NA à partir d’un NA. Le kit fournit des instructions pour convertir deux microgrammes, un NA en CD NA. Nous recommandons une entrée de six à 10 microgrammes par NA et une mise à l’échelle des réactions en conséquence.

Nettoyez le CD NA à l’aide d’une précipitation d’éthanol ou du système de nettoyage de l’ADN promega wizard. Selon les instructions du fabricant, stocker des échantillons à moins 80 degrés Celsius L’ADNC double brin peut être directement séquencé à ce stade à partir de 10 litres d’eau de mer, nous avons extrait environ 10 microgrammes d’ARN environnemental et amplifié à 20 fois par conversion de l’IRM amplifié. De l’ADN NA à l’ADNC double brin ont été générés en quantités suffisantes de matériel pour le séquençage et l’analyse des transcrits environnementaux. Nous venons de vous montrer comment évaluer l’expression des gènes des communautés microbiennes marines à l’aide de la méta-transcriptomique environnementale.

Rappelez-vous toujours que lors de cette procédure, l’ARNm se dégrade rapidement et les ARN sont omniprésents. Prenez donc les précautions standard pour travailler dans un environnement sans noyau de côtes et traitez les échantillons le plus rapidement possible. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.