Analysant l'expression de gènes à partir communautés microbiennes marines utilisant Transcriptomique environnement

Cette procédure commence par l'acquisition de biomasse microbienne marine à partir d'échantillons d'eau par préfiltration à travers des filtres de cinq et trois micromètres, suivie de la collecte sur un filtre de 0,22 micromètre. L'ARN total est ensuite extrait des organismes retenus sur le filtre de 0,22 micromètre. Notre ARN est éliminé de l'ARN total par dégradation enzymatique sélective, puis l'ARNm enrichi est amplifié linéairement par ajout d'une queue polyA et par transcription in vitro.

L'ARN antisense amplifié est ensuite converti en ADNc double brin à l'aide d'un hexamère aléatoire. L'ADNc obtenu peut être cloné et séquencé ou directement soumis à un séquençage par pyroséquençage. Bonjour, je suis Rachel Persky du laboratoire de la Dre Marianne Moran au Département des sciences marines de l'Université de Géorgie.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'analyser l'expression génique à partir d'échantillons environnementaux, en utilisant la méta-transcriptomique environnementale. Scott Gifford vous montrera comment traiter des échantillons environnementaux afin de recueillir l'ARN.

Je vais vous montrer comment extraire l'ARN à partir des échantillons et des RIN de Johanna. AON démontrera la suppression de l'ARN. Maria Kosta passera ensuite en revue les étapes d'amplification de l'ARN et de synthèse de l'ADN complémentaire.

Commençons. Pour initier le prélèvement d'ARN environnemental, nous mettons en place le système de filtration en plaçant une extrémité du tube dans l'eau à la profondeur souhaitée pour l'échantillonnage, et en raccordant l'autre extrémité à un filtre à haut débit de trois micromètres, le pompe étant positionnée entre les deux extrémités du tube. Le filtre de trois micromètres est ensuite relié à la colonne de filtration de 0,22 micromètre, et l'écoulement de sortie est dirigé depuis la colonne de 0,22 micromètre vers un récipient gradué.

Faites circuler plusieurs litres d'eau dans le système pour rincer. Une fois terminé, retirez le tube de l'eau tout en laissant la pompe en marche afin d'évacuer l'eau restante de la conduite. Ensuite, utilisez une paire de forceps pour placer un filtre de 0,22 micromètre sur la tour de filtration et fermez-la.

Replongez l'extrémité du tuyau dans l'eau et mettez la pompe en marche. Laissez l'air s'échapper des deux filtres et surveillez le volume d'eau filtrée à l'aide du bidon. Une fois le volume souhaité filtré, retirez le tuyau de l'eau et purgez l'eau restante du système.

Dès que le filtre est sec, retirez rapidement la plaque supérieure du filtre et pliez le papier filtre. Placez le filtre dans un tube whirl pack et congélez-le instantanément dans de l'azote liquide. Avant de commencer l'expérience, il est important de noter que, puisque les ARN sont omniprésents et que les ARNm se dégradent rapidement, des précautions standard pour travailler dans un environnement exempt de ribonucléases doivent être respectées, y compris pour les surfaces de travail et les pipettes.

À cet effet, des gants propres doivent être portés lors de la manipulation de tout matériau utilisé dans cette procédure. Les échantillons doivent être traités dans un délai aussi court que possible. Pour commencer l'extraction d'ARN total à partir du filtre de 0,22 micromètre, nous préparons des tubes à billes en ajoutant huit millilitres de tampon RLT contenant de l'éthanol bêta méto à un tube conique de 50 millilitres.

Ensuite, un à deux millilitres de billes à ARN provenant d'un kit d'extraction de sol mobile sont ajoutés. Retirez rapidement le filtre congelé du congélateur et maintenez-le dans le pack thermique. Fracturez-le à l'aide d'un maillet.

Ajoutez le filtre broyé au tube conique de 50 millilitres préparé et scellez le couvercle du tube avec du ruban parafilm ou du ruban de laboratoire. Vortexez pendant 10 minutes. Ensuite, centrifugez le tube de 50 millilitres à 5 000 tr/min pendant une minute. À température ambiante, retirez autant que possible le lysat et transférez-le dans un tube de 15 millilitres avant de centrifuger à nouveau pendant cinq minutes.

À 5 000 ×g, le surnageant est ensuite transféré dans un nouveau tube de 50 millilitres et un volume égal d'éthanol à 100 % est ajouté au lysat. À l’aide d’une seringue de 10 millilitres, aspirez le lysat à travers une aiguille de 18 à 21 gauge et faites-le repasser environ cinq fois. Pour les étapes suivantes d’extraction, utilisez le kit KaiGen R et easy mini selon les instructions du fabricant, en appliquant le lysat sur la colonne fournie, soit à l’aide du collecteur sous vide, soit par centrifugations répétées.

Quantifiez l'ARN total par spectrophotométrie. Après avoir déterminé le rendement total en ARN, nous utilisons le kit Ambien turbo DNA free selon les instructions du fabricant pour éliminer toute contamination par l'ADN. Maintenant que les extractions d'ARN sont terminées, je vais remettre l'ARN total à Johanna, qui effectuera les étapes de suppression de l'ARNr premier et second.

Merci Rachel. Pour commencer la suppression de l'ARNr, mélangez doucement et centrifugez brièvement le tampon de réaction 10x pour l'ARNm uniquement, avant de l'utiliser, dans un tube stérile de 0,5 millilitre sans ARN. Combinez alors les volumes appropriés de tampon de réaction 10x, d'inhibiteur d'ARN, d'échantillon d'ARN total et d'exonucléase Terminator. Selon le protocole d'Epicentre, incubez la réaction à 30 degrés Celsius pendant 60 minutes dans un thermocycleur avec un couvercle chauffant ou dans un bain d'eau.

Ensuite, arrêter la réaction par une précipitation au phénol-éthanol en ajoutant d'abord de l'eau sans ARNse jusqu'à un volume total de 200 microlitres, puis en ajoutant un volume égal d'une solution phénol-chloroforme (un pour un) à l'ARNm centrifugé. Recueillir la phase aqueuse, puis précipiter avec de l'éthanol à cent pour cent et du sel. Ce point constitue un arrêt possible du protocole.

L'ARN peut être conservé à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce que l'on soit prêt à utiliser l'échantillon dans des applications en aval. Une fois l'enrichissement initial en ARNm terminé, nous utiliserons les kits Ambien Microbe Enrich et Microbe Express conformément aux instructions du fabricant afin d'éliminer tout ARNr résiduel de notre échantillon. Pour faciliter l'élimination de l'ARNr eucaryote, nous utiliserons le kit Microbe Enrich.

Tous les volumes sont déterminés en lisant les instructions du fabricant. Commencez par pipeter 300 microlitres de tampon de liaison dans un tube de 1,5 millilitre. Ajoutez de 5 à 100 microgrammes d'ARN total dans un volume maximal de 30 microlitres et vortexez.

Ajoutez délicatement deux microlitres du mélange d'oligonucléotides de capture pour cinq microgrammes d'ARN dans le tampon de liaison et tapez doucement sur le tube. Faites une courte centrifugation du mélange. Dénaturez le mélange à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis incubez le mélange à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Pendant cette incubation, préparez les billes magnétiques oligo en les lavant une fois avec de l'eau sans nucléase et une fois avec le tampon de liaison, en récupérant les billes sur un support magnétique entre chaque lavage. Conservez les billes sur de la glace et laissez-les atteindre la température ambiante. Cinq minutes avant utilisation, chauffez la solution de lavage à 37 degrés Celsius dans un bloc chauffant.

Ajouter le mélange d'oligonucléotides de capture d'ARN aux billes magnétiques recouvertes d'oligonucléotides, mélanger doucement le tube puis centrifuger brièvement. Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Placer le tube sur le support magnétique et attendre environ trois minutes avant d'aspirer le surnageant contenant l'ARNm, puis le transférer dans un tube de collecte placé sur de la glace.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de lavage préalablement réchauffée sur les billes capturées. Vortexez doucement pour capturer les billes et récupérez le surnageant. Ce surnageant contenant l'ARN doit être transféré dans un tube de collecte placé sur de la glace.

Placer un tube de collecte sur de la glace pendant la préparation du retrait de l'ARNr procaryote à l'aide du kit Ambion Microbe Express, que nous utiliserons pour éliminer l'ARNr procaryote résiduel. Utiliser un Bioanalyzer ou un Experion pour vérifier la contamination par l'ARNr et la qualité de l'ARNm. Ce point constitue une étape possible d'arrêt.

L'ARN peut être conservé à moins 80 degrés Celsius. Une fois que l'ARNr a été éliminé, nous utiliserons le kit Ambien Message AMP Two Bacteria selon les instructions du fabricant afin d'amplifier notre ARNm. Maintenant que nous disposons d'un échantillon pur d'ARNm, je remets l'expérience à Maria, qui vous guidera à travers l'amplification de l'ARNm et la synthèse d'ADNc.

Merci, Hannah. Avant de commencer l'amplification de l'ARNm, calculez les volumes de chaque composant des mélanges maîtres du kit Ambien message AMP two bacteria en ligne. Nous commençons la polyadénylation de l'ARN matrice en plaçant jusqu'à 1000 nanogrammes d'ARN total dans un tube microfuge stérile sans ARNase. Utilisez 6,5 microlitres d'échantillon et aucune eau sans ARNase dans le premier tampon pour synthétiser un ARN par transcription in vitro.

Il est recommandé d'utiliser un four ou un incubateur d'hybridation en raison de leur température uniforme. Étant donné qu'il est extrêmement important que la condensation ne se forme pas à l'intérieur des tubes, nous recommandons vivement une incubation de 14 heures pour la réaction de transcription in vitro. Pour maximiser le rendement en ARN afin d'obtenir le rendement le plus élevé en ARN A, réalisez la IBT dans un volume réactionnel final de 40 microlitres et stockez l'ARN A à moins 80 degrés Celsius en aliquotes d'environ 10 microlitres.

Une fois l'ARN amplifié, il est temps de synthétiser l'ADN complémentaire ou ADNc. Le kit Promega Universal RiboClone™ System de synthèse d'ADNc est utilisé pour synthétiser l'ADNc à partir de l'ARN. Le kit fournit des instructions pour convertir deux microgrammes d'ARN en ADNc. Nous recommandons d'utiliser entre six et dix microgrammes d'ARN et d'ajuster les réactions en conséquence.

Nettoyez l'ADNc en utilisant soit une précipitation à l'éthanol, soit le système de purification d'ADN Promega Wizard. Conformément aux instructions du fabricant, conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius. À ce stade, l'ADNc double brin peut être directement séquencé. À partir de 10 litres d'eau de mer, nous avons extrait environ 10 microgrammes d'ARN environnemental et effectué une amplification 20 fois supérieure par conversion de l'ARNm amplifié en ADNc double brin, obtenant ainsi des quantités suffisantes de matériel pour le séquençage et l'analyse des transcrits environnementaux. Nous venons de vous montrer comment évaluer l'expression génique à partir de communautés microbiennes marines en utilisant la méta-transcriptomique environnementale.

N'oubliez jamais que lors de cette procédure, l'ARNm se dégrade rapidement et que les ARN sont ubiquitaires. Prenez donc les précautions standards pour travailler dans un environnement exempt de ribonucléases et traitez les échantillons aussi rapidement que possible. Voilà tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.