Suivi vidéo haute résolution de la locomotion chez les adultes Drosophila melanogaster

Dans le test de suivi vidéo, les mouches doivent être chargées dans une chambre d’observation carrée sans utiliser d’anesthésie. Pour ce faire, un petit entonnoir doit être aligné avec des trous de vis dans la chambre, afin de faire tomber les mouches dans la chambre. À l’aide de cet entonnoir, des vis scellent ensuite les trous de la chambre et une impulsion d’air est administrée à travers les bouches d’aération pour initier la locomotion.

Une caméra vidéo suspendue au-dessus de la chambre, capte cette locomotion et l’envoie à un ordinateur où les trajectoires des mouches sont tracées et analysées. Bonjour, je m’appelle Justin Slawson et je travaille au laboratoire Griffith, au département de biologie de l’Université Brandeis. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de suivi vidéo haute résolution de la locomotion.

Nous allons utiliser cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le comportement des locomotives chez les mouches adultes. Alors commençons. Pour commencer l’expérience, cultivez des mouches et des bouteilles contenant des milieux standard sans levure.

Ce protocole nécessite un grand nombre de mouches, les croisements doivent donc être mis en place en conséquence. Les mouches doivent être cultivées dans un cycle d’obscurité légère de 12 heures à 25 degrés Celsius. Collectez les mouches un à trois jours après Aus, utilisez un diffuseur de dioxyde de carbone pour trier les mouches dans des tubes à essai contenant des milieux sans levure, triez 10 mâles par tube à essai.

Attendez au moins un jour ou deux après l’utilisation du dioxyde de carbone avant d’effectuer les expériences comportementales. Une fois que les mouches ont été collectées et triées, elles peuvent être analysées dans le système de suivi vidéo. Les expériences de suivi vidéo sont réalisées dans une salle d’environnement, qui maintient une température constante de 25 degrés Celsius avec 70 % d’humidité.

Pour filmer des vols en mouvement, vous devrez suspendre une caméra vidéo numérique au-dessus de la zone à enregistrer. Avec la caméra tournée vers le bas, nous suspendons la caméra au-dessus d’une boîte à lumière puisque notre logiciel de suivi est basé sur le contraste. Ensuite, à l’aide d’un câble filaire d’incendie, connectez la caméra à un ordinateur.

Nous utilisons le logiciel Windows Movie Maker pour enregistrer la vidéo directement sur l’ordinateur. Étant donné que des impulsions d’air seront administrées dans ce protocole, une source de flux d’air doit être présente dans la pièce. Des tubes en caoutchouc relient la source d’air à un filtre à charbon pour la filtration de l’air.

Des tubes en caoutchouc relient également l’autre côté du filtre à charbon à un erlenmeyer via un bouchon en caoutchouc creux. Le flacon doit être rempli d’environ un demi-pouce d’eau, ce qui humidifiera l’air. Le flacon doit également avoir un petit bras de poing, qui doit être relié à une valve en forme de Y par plus de tubes en caoutchouc.

Une branche de la vanne en Y se connecte à un débitmètre tandis que l’autre branche se connecte à la chambre de locomotion carrée. Cette chambre de locomotion carrée est basée sur la conception de Wolf Etal 2002 avec l’ajout de petits plateaux de chute pour empêcher les mouches de voler à l’intérieur de la chambre avant de connecter la chambre au système de suivi, n’oubliez pas d’utiliser 70 % d’éthanol pour stériliser tous les composants de la chambre. Laissez les composants rouler avant de les utiliser.

Maintenant que le système de suivi est prêt, nous pouvons livrer les mouches dans la chambre de locomotion pour livrer les mouches dans la chambre. Retirez les vis qui maintiennent normalement le petit dessus en plexiglas de la chambre en place. Positionnez ensuite le dessus en plexiglas de manière à ce que le trou de vis repose directement sur la chambre intérieure.

Anesthésie les mouches immédiatement avant de les conduire. Un test comportemental peut potentiellement compromettre les performances. Pour éviter l’anesthésie, utilisez un entonnoir avec une petite sortie pour frapper doucement les mouches dans la chambre.

Pour fabriquer un entonnoir avec une petite sortie, fixez une pointe de pipette bleue P 1000 à l’extrémité de l’entonnoir. Utilisez des ciseaux pour couper l’extrémité de la pointe de la pipette afin de faire l’ouverture suffisamment grande pour qu’une mouche puisse passer à travers. Ensuite, prenez un tube à essai contenant les mouches et placez-le à l’envers sur l’entonnoir.

Placez ensuite l’extrémité de l’entonnoir dans le trou de vis. Ne déplacez pas l’entonnoir car cela pourrait blesser ou endommager les mouches. Au lieu de cela, frappez doucement tout l’entonnoir de la chambre et tout jusqu’à ce que toutes les mouches soient à l’intérieur de la chambre.

Utilisez un tapis de souris pour absorber le choc de ce choc. Lorsque les mouches sont à l’intérieur, retirez l’entonnoir et repositionnez le dessus en plexiglas sur les lits à vis, puis fixez le dessus en plexiglas en place. Une fois que les mouches sont correctement chargées, placez la chambre sur le dessus d’une boîte lumineuse.

Éteignez les autres lumières de la salle de l’environnement et laissez les mouches s’acclimater dans la chambre pendant 30 minutes. Après la période d’acclimatation de 30 minutes, procéder à l’essai locomoteur pour commencer l’essai. Basculez la vanne en Y dans le système de circulation d’air de sorte que l’air ne s’écoule que vers le débitmètre, allumez l’air et augmentez l’air jusqu’à la vitesse souhaitée.

N’importe quelle vitesse comprise entre quatre et six litres par minute fonctionnera. Nous utilisons généralement cinq à cinq litres et demi par minute. Une fois que la vitesse d’air souhaitée est atteinte, commutez la soupape Y de sorte que l’air s’écoule vers la chambre de locomotion.

Chronométrez cette impulsion d’air pendant 15 secondes, puis coupez brusquement l’air lorsque vous éteignez l’air. Basculez l’appareil photo en mode d’enregistrement. Cette étape demande de la pratique pour être effectuée en une seule fois.

Nous enregistrons 32e essais à 10 images par seconde et au moins huit essais par génotype. Arrêtez l’enregistrement une fois la version d’essai terminée et assurez-vous de sauvegarder le film une fois les versions d’essai terminées. Nous pouvons procéder à l’analyse vidéo pour effectuer le suivi de mouvement des vidéos d’essai locomoteur.

Nous utilisons le système d’analyse d’images dynamiques pour utiliser ce logiciel. Convertissez les vidéos au format de fichier A VI avec QuickTime 7.5 0.5. Ensuite, utilisez la fonction de traçage automatique par seuil pour suivre les mouches en fonction du contraste, suivie de la fonction make path from trace pour numériser.

Ces traces appliquent ensuite la fonction de paramètres de calcul pour générer les vitesses instantanées de chaque mouche dans un fichier de base de données. Cette fonction permet également de lisser les données. Nous utilisons une fenêtre de lissage 5 15 60 15 5.

Une fois que ces informations sont affichées sous forme de fichier de base de données, nous ouvrons et enregistrons les fichiers dans Microsoft Excel. Les fichiers Excel sont traités à l’aide d’un script MATLAB pour compiler les vitesses instantanées et calculer des paramètres supplémentaires nécessaires à la compréhension de la dynamique du mouvement. Et la structure.

Voici un résultat représentatif de ce dosage. La figure de gauche montre des traces d’organismes sauvages de Canton tandis que la figure de droite montre des mouches nulles pour le gène dask, qui ont été générées en croisant deux grandes délétions qui se chevauchent. Comme vous pouvez le voir dans notre paradigme, les mouches nulles Dask présentent une locomotion considérablement réduite par rapport au canton S, ce qui a déjà été rapporté dans la littérature en utilisant un type différent de test locomoteur.

Nous venons de vous montrer comment configurer et exécuter un test de suivi vidéo locomoteur. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’effectuer les tests dans la même fenêtre de temps de deux à trois heures chaque jour afin d’éviter les problèmes de rythme circadien et de toujours faire fonctionner des organismes de type sauvage en premier pour s’assurer que les réponses comportementales sont dans la plage normale un jour donné. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.