Name: Microinjection dovocytes de Xenopus laevis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Découvrez la microinjection d'ovocytes de Xenopus laevis pour étudier le transport nucléocytoplasmique. Cette méthode combine la microinjection de substrats d'import nucléaire et la microscopie électronique à ultracoupe pour visualiser les mécanismes cellulaires.

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Nous remercions David Theilmann (Pacific Agri-Food Research Centre, à Summerland, en Colombie-Britannique) pour fournir les AcMNPV baculovirus et de discussion utile. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation canadienne pour l&#39;innovation (FCI), les Instituts canadiens de recherche en santé du Canada (IRSC), la Fondation Michael Smith pour la recherche en santé (MSFHR), et les sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) .

Partie 1: Préparation des ovocytes de Xenopus pour la microinjection <ol><li> Placer un petit morceau (environ 2 cm) de Xenopus laevis ovaire dans un tube conique de 50 ml contenant 20 ml de solution de collagénase (5 mg / ml de collagénase en calcium sans modification Barth salin: 88 mM de NaCl, 1 mM de KCl, 0,82 mm MgSO 4, 10 mM Hepes, pH 7,5). La collagénase est utilisée pour enlever les cellules folliculaires qui entourent l&#39;ovocyte. </li><li> Placer le tube sur une plateforme shaker et le rock en douceur (à 100 RPM) pendant une heure. Cette fois-ci varie en fonction de différents lots de la collagénase. Ainsi, après une heure, prendre un petit échantillon d&#39;ovocytes et de les examiner sous un microscope à dissection. Correctement de-folliculated ovocytes doivent être bien séparés les uns des autres, et il devrait être facile à insérer une aiguille de verre dans l&#39;ovocyte. Si les ovocytes ne sont pas suffisamment dé-folliculated, ils sont laissés dans la solution de collagénase et vérifié à nouveau toutes les cinq minutes. </li><li> Lavez les ovocytes à trois reprises avec une solution saline modifiés Barth (MBS: 88 mM de NaCl, 1 mM de KCl, 0,82 mM MgSO 4, 0,33 mM Ca (NO 3) 2, 0,41 mM de CaCl2, 10 mM Hepes, pH 7,5), et de les transférer un plat de 100 mm de diamètre de Petri contenant MBS majoré de 1% de pénicilline / streptomycine. Les ovocytes sont maintenant prêtes à être microinjectés. Si la micro-injection sera effectuée sur un autre jour, de stocker les ovocytes à 4 ° C jusqu&#39;à une semaine. </li><li> En utilisant un microscope à dissection, sélectionnez matures ovocytes stade VI pour la microinjection. Ces ovocytes sont grandes, avec un bon contraste entre l&#39;hémisphère animal noir et de l&#39;hémisphère de couleur crème végétale. </li><li> Transférer les ovocytes matures stade VI dans une plaque de microtitration (Nunc, volume 10 ul bien). Cela devrait être fait avec soin, en utilisant une pipette de 200 pl avec une pointe de pipette qui a été coupé à la fin pour permettre d&#39;aspiration sans perturbation des ovocytes. </li></ol> Partie 2: microinjection d&#39;ovocytes de Xenopus <ol><li> Préparer le substrat d&#39;importation soit microinjectés en ajoutant une petite quantité de bleu de bromophénol à 1%, pour aider à la visualisation de la micro-injection. Par exemple, nous ajoutons 1 pl de bleu de bromophénol à 10 ul de substrat. </li><li> Placer une petite bande de Parafilm sur un plat de 100 mm de diamètre de Petri, et dispenser une baisse de 5 pl de la solution à injecter sur la bande de Parafilm. </li><li> Remplir une aiguille d&#39;injection préalablement étalonné (obtenu en tirant un 6,6-ul micropipette Drummond avec la Injecter + Matic Puller) avec la solution à injecter. Pour cela, le microinjecteur est réglé sur le mode d&#39;aspiration. Pour calibrer l&#39;aiguille d&#39;injection faire des marques de points sur l&#39;aiguille tous les 0,5 mm, ce qui correspond à un volume de 50 nl. </li><li> Pour l&#39;injection cytoplasmique, insérez la pointe de l&#39;aiguille dans un ovocyte dans l&#39;hémisphère végétatif, très proche de l&#39;hémisphère animal, à un angle d&#39;environ 45 degrés. Tournez le réglage microinjecteur d&#39;microinject et microinject chaque ovocyte avec 50 nl du substrat à l&#39;importation. Les marques de point sur l&#39;aiguille sont utilisés pour contrôler la quantité de substrat qui a été injecté. </li><li> Transfert des ovocytes injectés à un petit (35 mm de diamètre) boîte de Pétri remplie de MBS, et incuber à température ambiante pour la quantité désirée de temps (le temps des points sont choisis de manière à permettre l&#39;observation du substrat à l&#39;importation associés avec les PNJ, ce qui se produit entre 10 et 30 minutes pour les protéines et les virus qui sont activement transportés vers les PNJ, ce temps dépend aussi sur le site d&#39;injection et de la taille de la protéine / virus). </li><li> Lorsque l&#39;incubation est terminée, le transfert d&#39;ovocytes dans un flacon en verre de 4 ml contenant du glutaraldéhyde à 2% en MBS, et de fixer une nuit à 4 ° C. </li></ol> Partie 3: Dissection d&#39;ovocytes de Xenopus <ol><li> Le lendemain, lavez les ovocytes 3 fois avec MBS. </li><li> Transfert des ovocytes à une petite boîte de Petri remplie avec le tampon de faible teneur en sel (LSB: 1 mM de KCl, 0,5 mM MgCl2, 10 mM d&#39;HEPES, pH 7,5). En utilisant un microscope à dissection et la dissection des pinces à épiler, retirez le pôle végétal de chaque ovocyte. Il est utile pour stabiliser l&#39;ovocyte étant disséqués avec une paire de pincettes, tandis que l&#39;autre paire est utilisée comme des ciseaux pour enlever le pôle végétal. A ce stade, il est possible d&#39;évaluer le succès de la micro-injection par la présence d&#39;une teinte bleue dans le cytosol. Le protocole est poursuivi uniquement pour les ovocytes qui ont été microinjectés succès. En outre, si les échantillons doivent être préparés pour EM, cette étape de dissection, il est beaucoup plus facile de trouver le noyau lors de la coupe et la coupe des échantillons. </li><li> Fixer les ovocytes disséqués à nouveau avec du glutaraldéhyde à 2% en LSB pendant une heure à température ambiante. </li><li> Après fixation, laver les ovocytes disséqués à trois reprises avec LSB. </li></ol> Partie 4: Préparation des ovocytes injectés pour l&#39;intégration et EM-mince de sectionnement <ol><li> Transfert des ovocytes disséqués sur une lame de dépression. Aspirer le plus de liquide que possiblesible, puis rapidement (afin qu&#39;elles ne se dessèchent pas) couvrir les ovocytes disséqués avec 2% d&#39;agarose à faible point de fusion. Alors que l&#39;agarose est encore molle, utilisez une pointe de pipette pour séparer les uns des autres ovocytes, et de s&#39;assurer que chaque ovocyte est face vers le haut ou vers le bas (pas de côté). </li><li> Laisser l&#39;agarose à solidifier pendant environ 10 minutes. Une fois que l&#39;agarose se solidifie, utiliser une lame de rasoir pour couper l&#39;agarose en petits morceaux, chacun contenant un ovocyte disséqués. </li><li> Placez les ovocytes d&#39;agarose-incorporé dans un flacon en verre de 4 ml, et les après-fixer avec 1% OsO 4 en LSB pendant une heure à température ambiante. </li><li> Laver l&#39;échantillon à trois reprises en LSB. Si nécessaire, conserver l&#39;échantillon à 4 ° C la nuit et continuer le protocole le jour suivant. </li><li> Séquentiellement déshydrater les échantillons dans une série ascendante de l&#39;alcool (50, 70 et 90% d&#39;éthanol pour 20 minutes chacun). Il est suivi par deux changements dans l&#39;éthanol à 100% pendant 15 min chacune. Enfin déshydrater les échantillons avec de l&#39;acétone à 100% pendant 15 min. </li><li> Infiltrez les échantillons avec un mélange 1:1 d&#39;Epon (Fluka) et l&#39;acétone pendant une heure, suivie d&#39;une infiltration avec un mélange 2:1 d&#39;Epon et de l&#39;acétone pendant deux heures, et enfin dans le plus pur Epon pendant au moins six heures. </li><li> Placer les échantillons dans des moules plats intégrant rempli de frais et pur Epon. Les ovocytes sont orientés de telle façon que le côté du noyau plus proche du site d&#39;injection - dans ce cas le côté de l&#39;ovocyte qui a été disséqué - sera sectionné en premier. Cette étape permet d&#39;optimiser les chances de visualiser l&#39;importation du substrat choisi. </li><li> Enfin, la polymérisation de la Epon pendant deux jours à 60 ° C. </li><li> Afin de visualiser les échantillons, les blocs sont taillés, puis sectionnés à l&#39;aide un ultramicrotome. Les articles sont transférés sur des grilles EM, teinté en utilisant la procédure standard, et visualisées avec un microscope électronique à transmission. Nous n&#39;allons pas montrer cette partie du protocole car elle est la procédure standard EM. </li></ol> Partie 5: Résultats du représentant: Si le protocole a été un succès, puis l&#39;enveloppe nucléaire (NE) et les PNJ doivent être clairement visibles dans EM micrographies. Selon le injecté substrat et la quantité de temps entre l&#39;injection et la fixation, le substrat doit être visible à la face cytoplasmique de l&#39;APN, dans le PNJ, ou sur le front nucléaire de l&#39;APN. La figure 1 montre une coupe transversale NE à cytoplasme adjacent (c) et le noyau (n) à partir d&#39;un ovocyte de Xénope qui a été injecté avec des capsides de l&#39;AcMNPV de baculovirus, incubée à 4 ° C pendant quatre heures, et traitées pour l&#39;intégration et de section mince EM tel que décrit. Pointes de flèches point à des PNJ. Un accueil capside à la face cytoplasmique d&#39;un PNJ est indiquée par une flèche blanche. En revanche, la figure 2 montre une coupe transversale NE à cytoplasme adjacent (c) et le noyau (n) à partir d&#39;un ovocyte de Xénope qui a été injecté avec le virus minute parvovirus de la souris (MVM), incubée à température ambiante pendant quatre heures, et traitées pour l&#39;intégration et de section mince EM tel que décrit. En utilisant cette technique, nous avons constaté que MVM induit des perturbations de la NE (Cohen et Pantè, 2005). Les parenthèses indiquent des ruptures dans le NE. Pointes de flèches point à des PNJ. Capsides MVM putatifs associés à la NE sont indiquées par des flèches blanches. <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="Figure 1" width="600" height="459" /> Figure 1: Micrographie électronique d&#39;un NE section transversale cytoplasme adjacent (c) et le noyau (n) à partir d&#39;un ovocyte de Xénope qui a été injecté avec des capsides du baculovirus Ac MNPV, incubée à 4 ° C pendant quatre heures, et traitées pour enrobage et de lames minces EM tel que décrit. Pointes de flèches point à des PNJ. Capsides sont indiquées par des flèches blanches. Barre d&#39;échelle: 100 nm. <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="Figure 2" width="600" height="264" /> Figure 2: Micrographie électronique d&#39;un NE section transversale cytoplasme adjacent (c) et le noyau (n) à partir d&#39;un ovocyte de Xénope qui a été injecté avec le virus minute parvovirus de la souris (MVM), incubée à température ambiante pendant quatre heures, et traitées pour l&#39;intégration et de section mince EM tel que décrit. Pointes de flèches point à des PNJ. Les parenthèses indiquent des ruptures dans le NE. Capsides MVM putatifs associés à la NE sont indiquées par des flèches blanches. Barre d&#39;échelle: 100 nm.

<ol><li>Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li>
<li>Panté, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li>
<li>Rabe, B., Vlachou, A., Panté, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li>
<li>Cohen, S., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+Envelope%3A+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li>
<li>Panté, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li>
</ol>

Microinjection d&#39;ovocytes de Xenopus combinée avec de fines coupes-EM est un outil très efficace pour étudier le transport nucléocytoplasmique. Ce système a été utilisé pour cartographier les étapes distinctes de l&#39;importation par le NPC, d&#39;interaction exemple d&#39;un substrat import nucléaire avec des composants structurels de l&#39;APN, comme les filaments cytoplasmiques et nucléaires panier (revu par Pantè, 2006). Il a également été utilisée pour étudier l&#39;import nucléaire de l&#39;énergie n...

microinjection d&#39;ovocytes de xenopus laevis

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection d&#39;ovocytes de Xenopus laevis suivie mince sectionnement microscopie électronique (EM) est un excellent système pour étudier le transport nucléocytoplasmique. En raison de son gros noyau et une forte densité de complexes des pores nucléaires (NPC), transport de matières nucléaires peuvent être facilement visualisés dans l&#39;ovocyte de Xénope. Beaucoup de perspicacité dans les mécanismes de l&#39;importation et l&#39;exportation nucléaire a été acquise grâce à l&#39;utilisation de ce système (revu par Pantè, 2006). En outre, nous avons utilisé la microinjection d&#39;ovocytes de Xenopus pour disséquer les voies import nucléaire de plusieurs virus qui se répliquent dans le noyau hôte. Ici nous démontrer la micro-injection cytoplasmique des ovocytes de Xenopus avec un substrat import nucléaire. Nous montrons aussi la préparation des ovocytes injectés pour la visualisation par de minces coupes-EM, y compris la dissection, la déshydratation, et l&#39;inclusion des ovocytes dans une résine époxy intégration. Enfin, nous fournissons des résultats représentatifs pour les ovocytes qui ont été micro-injecté avec la capside du nucléopolyhédrovirus baculovirus Autographa californica (AcMNPV) ou le virus minute parvovirus de la souris (MVM), et de discuter des applications potentielles de cette technique.

Ici nous démontrons micro-injection cytoplasmique de la<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Ovocytes avec un substrat import nucléaire, ainsi que la préparation des ovocytes injectés pour la visualisation par microscopie électronique mince sectionnement.

Microinjection d&#39;ovocytes de Xenopus laevis

La microinjection d'ovocytes de Xenopus laevis suivie d'une microscopie électronique (ME) en coupes fines constitue un excellent système pour étudier le transport nucléocytoplasmique...

L'injection microscopique de cytes Opus Lavu, suivie d'une microscopie électronique en coupes minces, constitue un excellent système pour l'étude du transport nucléo-cytoplasmique. Dans cette expérience, les ovocytes sont défolliculés à l'aide de collagénase et les cytes au stade six sont sélectionnés puis placés dans une plaque multipuits. Les cytes sont ensuite micro-injectés avec un substrat d'importation nucléaire, après une incubation des cytes à température ambiante afin de permettre au substrat d'entrer dans le noyau.Les cytes sont fixées et disséquées. Les cytes disséquées sont incluses dans de l'agarose à bas point de fusion, fixées à nouveau avec du tétraoxyde d'osmium, déshydratées et incluses dans une résine époxy. Les échantillons inclus dans la résine époxy sont coupés en sections à l'aide d'un ultramicrotome et les sections sont placées sur une grille en cuivre pour microscope électronique.Après la coloration, les coupes sont visualisées au microscope électronique en transmission. Bonjour, je suis Sarah Cohen du laboratoire de la Dre Nellie Pane du Département de zoologie de l'Université de la Colombie-Britannique. Je suis Shelly Ow, également du laboratoire Panta.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure de microinjection de cellules Zenap Lavis. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l'importation nucléaire de cargaisons telles que les virus. Commençons donc.Pour commencer l'expérience, placez un petit morceau d'environ deux centimètres d'ovaire Zenap Lavis dans un tube conique de 50 millilitres contenant 20 millilitres de solution de collagénase. La collagénase élimine les cellules folliculaires qui entourent les cytes, puis placez le tube sur la platine agitatrice et agitez doucement à 100 tr/min pendant 30 minutes. Ce temps varie selon les différents lots de collagénase.Ainsi, après une heure, prélevez un petit échantillon de cytes et examinez-les au microscope stéréoscopique. Les cytes correctement défoliés doivent être bien séparés les uns des autres. Insérez une aiguille en verre dans un cyte pour vérifier qu'elle s'insère facilement.Si les cytes ne sont pas suffisamment défoliées, les laisser dans la solution de collagénase et vérifier toutes les cinq minutes. Une fois que les cytes sont suffisamment dérégulées, les laver trois fois avec du sérum physiologique modifié au bar et les transférer dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant du MBS additionné de 1 % de pénicilline-streptomycine. À l’aide d’un microscope stéréoscopique, sélectionner les cytes au stade six mature pour la microinjection.Ces ovocytes sont de grande taille et présentent un bon contraste entre l'hémisphère animal noir et l'hémisphère végétal de couleur crème. Transférez les ovocytes au stade mature six dans une plaque multipuits. Pour ce faire, utilisez une pipette de 200 microlitres munie d'une pointe dont l'extrémité a été coupée afin de permettre une aspiration sans perturbation des ovocytes, puis transférez délicatement les ovocytes dans la plaque multipuits.Nous utilisons une boîte de culture sans micro-puits ayant un volume de puits de 10 microlitres. Les sites EO sont désormais prêts à être micro-injectés. Préparez le substrat d'importation à micro-injecter en ajoutant un microlitre de bleu de bromophénol à 1 % à 10 microlitres de substrat. Le colorant bleu de bromophénol permet la visualisation de la micro-injection.Ensuite, placez une petite bande de paraforme sur une boîte de Pétri de 100 millimètres de diamètre et déposez une goutte de cinq microlitres de la solution d'injection sur la bande de paraforme. Ensuite, obtenez une aiguille d'injection en tirant une micropipette Drummond de 6,6 microlitres à l'aide du dispositif Inject Plus Matt Puller. Étalonnez l'aiguille d'injection en traçant des points sur l'aiguille tous les 0,5 millimètre, ce qui correspond à un volume de 50 nanolitres. Réglez le micro-injecteur en mode aspiration et remplissez l'aiguille avec la solution d'injection destinée à l'injection cytoplasmique.Insérez la pointe de l'aiguille dans un cyte de l'hémisphère végétatif, très près de l'hémisphère animal, selon un angle d'environ 45 degrés. Ensuite, réglez le micro-injecteur sur l'option de micro-injection et injectez chaque cyte avec 50 nanolitres de substrat d'importation. Surveillez attentivement les marques en point sur l'aiguille afin de contrôler la quantité de substrat injectée une fois les injections terminées.Transférez les cytes dans une boîte de Pétri de 35 millimètres remplie de MBS. Incubez les cytes à température ambiante pendant la durée souhaitée. Choisissez des points temporels permettant l'observation du substrat d'importation associé aux complexes pauvres en noyau ou aux NPCs.Nous utilisons généralement des points de prélèvement compris entre 10 et 30 minutes pour les protéines et les virus transportés activement vers le CPC. Ces points de prélèvement dépendent également du site d'injection et de la taille de la protéine ou du virus. Une fois l'incubation terminée, transférez les cytes dans un flacon en verre de quatre millilitres contenant 2 % de glutaraldéhyde dans du MBS et fixez-les toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, lavez les cytes trois fois avec du MBS ; nous sommes désormais prêts à disséquer les cytes.Transférez les cytes dans une petite boîte de Pétri remplie de tampon à faible teneur en sel. À l’aide d’un microscope stéréoscopique et de pinces de dissection, retirez le pôle végétatif de chaque ovocyte. Il est utile de stabiliser l’ovocyte avec une première paire de pinces tandis qu’une seconde paire est utilisée comme des ciseaux pour enlever le pôle végétatif. Cette étape de dissection facilite grandement la localisation du noyau lors de la taille et de la sectionnement des échantillons pour la microscopie électronique.À ce stade, la présence d'une teinte bleutée dans le cytoplasme indique une microinjection réussie ; éliminez les cytes qui n'ont pas été microinjectés avec succès. Ensuite, fixez à nouveau les cytes disséqués pendant une heure à température ambiante avec du glutaraldéhyde 2 % dans le LSB. Après la fixation, lavez les cytes disséqués trois fois avec le LSB. Une fois les cytes lavés, nous sommes prêts à préparer les ovocytes injectés pour l'inclusion et la coupe fine en microscopie électronique.Transférez les ovocytes disséqués sur une lame creuse, aspirez autant de liquide que possible, puis agissez rapidement afin qu’ils ne s’assèchent pas. Recouvrez les ovocytes disséqués d’agarose à 2 % à bas point de fusion, tandis que l’agarose est encore molle. Utilisez la pointe d’une pipette pour séparer les ovocytes les uns des autres et vous assurer que chaque ovocyte est positionné soit face vers le haut, soit face vers le bas, mais jamais sur le côté.Laisser la gélose durcir pendant environ 10 minutes. Une fois la gélose solidifiée, utiliser une lame de rasoir pour couper les géloses en petits morceaux, chacun contenant un cyte disséqué. Ensuite, placer les cytes inclus dans les géloses dans un flacon en verre de quatre millilitres et, à l’aide d’un agitateur rotatif, les fixer pendant une heure à température ambiante avec du tétraoxyde d’osmium à 1 % dans le LSB.Après une fixation d'une heure, laver l'échantillon trois fois dans du LSB si nécessaire. Conserver l'échantillon à quatre degrés Celsius pendant la nuit et poursuivre le protocole le lendemain. Déshydrater successivement les échantillons dans de l'éthanol à 50 %, 70 % et 90 % pendant 20 minutes chacun, puis déshydrater deux fois dans de l'éthanol à 100 % pendant 15 minutes chacun.Enfin, déshydratez les échantillons avec de l'acétone à 100 % pendant 15 minutes après la fin des étapes de déshydratation. Infiltrez les échantillons avec un mélange un pour un d'épon, de flua et d'acétone pendant une heure, puis avec un mélange deux pour un d'épon et d'acétone pendant deux heures, et enfin dans de l'épon pur pendant au moins six heures. Une fois l'étape finale d'infiltration terminée, placez les échantillons dans des moules plats pour inclusion remplis d'épon frais et pur.Orientez les cytes de manière à ce que le côté du noyau le plus proche du site d'injection soit sectionné en premier. Dans ce cas, le côté des cytes qui a été disséqué sera sectionné en premier. Cette étape optimise d'abord la probabilité de visualiser l'importation du substrat choisi.Une fois que les cytes sont correctement orientés, polymérisez l'épon pendant deux jours à 60 degrés Celsius. Après l'étape de polymérisation, obtenez des sections de 50 nanomètres d'épaisseur à partir des échantillons inclus dans l'époxyde en utilisant un ultramicrotome. Récupérez les sections sur une grille de microscopie en cuivre, colorez les échantillons et observez-les au microscope électronique en transmission.Si le protocole a été couronné de succès, l'enveloppe nucléaire et les NPC doivent être clairement visibles sur les micrographies électroniques. Selon le substrat injecté et la durée entre l'injection et la fixation, le substrat doit être visible au niveau de la face cytoplasmique du NPC, à l'intérieur du NPC ou à la face nucléaire du NPC. Ce résultat représentatif montre une coupe transversale de l'enveloppe nucléaire avec le cytoplasme et le noyau adjacents provenant d'un zénocyte ayant été injecté avec des capsides du virus VAO.Les fl&egrave;ches A-C-M-N-P-V indiquent les CPC et une capside s'ancrant &agrave; la face cytoplasmique d'un CPC est signal&eacute;e par une fl&egrave;che blanche. En revanche, cette image montre une coupe transversale de l'enveloppe nucl&eacute;aire avec le cytoplasme et le noyau adjacents provenant d'un ovocyte zenap ayant &eacute;t&eacute; inject&eacute; avec le parvovirus de la souris. Gr&acirc;ce &agrave; cette technique, nous avons constat&eacute; que le MVM induit des perturbations de l'enveloppe nucl&eacute;aire.Les crochets indiquent des ruptures dans l'enveloppe nucléaire. Les flèches indiquent les CPC et les capsides putatives de MVM associées à l'enveloppe nucléaire sont indiquées par des flèches blanches. Nous venons de vous montrer comment micro-injecter et disséquer des cellules xap levu.Lors de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que les différents lots de collagénase varient. Testez donc soigneusement votre collagénase afin de déterminer le temps optimal de défollaison. De plus, après l'étape de défollaison et de lavage au MBS, les cytes peuvent être conservés à quatre degrés Celsius jusqu'à une semaine avant la microinjection.Enfin, conservez toujours votre gluté entièrement immergé dans la glace et ne laissez jamais l'osmose sécher. Ils doivent rester complètement submergés pendant toutes les étapes de déshydratation et d'infiltration. Voilà, c'est tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Nous décrivons un système d’ovocytes et de coiffes animales de xénope pour le clonage d’expression de gènes capables d’induire une réponse chez l’ectoderme compétent, et discutons des techniques pour l’analyse ultérieure de ces gènes. Ce système est utile dans l’identification fonctionnelle d’un large éventail de produits géniques.

Clonage fonctionnelle en utilisant un<em&gt; Xenopus</em&gt; Système d&#39;expression de l&#39;ovocyte

Ici, nous présentons un protocole pour utiliser des cartes de destin et des traceurs de lignées pour cibler les injections dans des blastomères individuels qui donnent naissance au rein d’embryons de Xenopus laevis.

Technique à la cible microinjection du Developing<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

Des procédures optimisées pour l’isolement des follicules uniques, les micro-injections d’ARN cytoplasmique, l’élimination des couches cellulaires environnantes et l’expression des protéines dans les ovocytes de xénope sont décrites. En outre, une méthode simple pour des changements rapides de solution dans des expériences électrophysiologiques avec des canaux ioniques ligand-dépendants est présentée.

Xenopus Ovocytes: Méthodes optimisées pour microinjection, suppression des couches de cellules folliculaires, et les changements de solution rapide dans les expériences électrophysiologiques

Cet article décrit une amélioration de la Fluorométrie conventionnelle en tension-clamp (VCF) où les acides aminés non naturels fluorescents (fUAA) sont utilisés à la place des colorants maléimidés, pour sondage des réarrangements structurels dans les canaux ioniques. La procédure comprend l'injection d'ADN ovocytaire de Xenopus, la co-injection d'ARN / fUAA et les mesures simultanées de courant et de fluorescence.

Fluorométrie de tension-serre dans<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocytes utilisant des acides aminés fluorescents non naturels

Ce protocole vise à démontrer comment microinjecter un mélange ADN/DOTAP dans les œilcs d'embryons de Xenopus laevis d'un jour, et comment imager et reconstruire la protéine fluorescente verte individuelle (GFP) exprimant des arborescences axonales optiques dans les midbrains tectal de intacts, les têtards Xenopus vivants.

Microinjection d'ADN dans eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Nous présentons ici un protocole pour exprimer les protéines de jonction lacunaire dans les ovocytes Xenopus et enregistrer le courant jonctionnel entre deux ovocytes apposés à l’aide d’un amplificateur commercial conçu pour les enregistrements à double tension ovocytaire dans un mode de mesure à courant latéral élevé.

Enregistrement du courant de jonction de l’espace des ovocytes Xenopus

Découvrez la microinjection d'ovocytes de Xenopus laevis pour étudier le transport nucléocytoplasmique. Cette méthode combine la microinjection de substrats d'import nucléaire et la microscopie électronique à ultracoupe pour visualiser les mécanismes cellulaires.

Microinjection d'ovocytes de Xenopus laevis

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