Microinjection d'ARNm et oligonucléotides antisens morpholino dans embryons de poissons zèbres.

Cette procédure commence par la préparation du morpho et de l’ARNm de la coiffe transcrit in vitro. Une micropipette est remplie en siphonnant la solution contenant du morpho et le volume d’injection est ensuite calibré à l’aide d’un micromètre à un étage de cellule. Les embryons de poisson-zèbre sont ensuite collectés et disposés dans une chambre de micro-injection pour les micro-injections de vitellus.

La solution de travail est injectée dans le jaune juste en dessous de la cellule et les mouvements cytoplasmiques sont utilisés pour transporter la solution pour les micro-injections cellulaires. Injecter la solution dans le cytoplasme cellulaire après les injections. Incuber les embryons à 28,5 degrés Celsius dans le milieu E trois et noter les phénotypes d’intérêt aux stades ultérieurs.

Bonjour, je suis Shiloh Yuen du laboratoire, le fils du Dr Sasha et du département de génétique de la faculté de médecine de l’Université Yale. Aujourd’hui, nous allons faire la démonstration d’une technique de micro-injection robuste pour effectuer des études de surexpression de l’ARNm et d’inactivation du gène morpho-oligonucléotidique chez le poisson zèbre. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le rôle du cil S dans les maladies kystiques des reins.

Alors commençons. Une approche puissante pour les études de la fonction des gènes consiste à micro-injecter in vitro de l’ARN coiffé transcrit dans des embryons de poisson zèbre. Dans cette démonstration, nous allons micro-injecter un transcrit marqué EGFP et utiliser l’expression de la GFP d’embryons entiers vivants comme lecture visible pour une injection réussie.

Tout d’abord, nous effectuerons une réaction de transcription in vitro de l’ARN de la coiffe sur le transcrit qui vous intéresse. Dans notre laboratoire, nous insérons régulièrement A-C-D-N-A d’intérêt dans un vecteur PC deux plus et effectuons une réaction de synthèse in vitro de grandes quantités d’ARN coiffé à l’aide du kit M message M machine SP six. Ensuite, nous purifierons l’échantillon d’ARN en le faisant passer dans le mini kit RN easy ou par extraction au phénol chloroforme et précipitation d’isopropanol.

Déterminez soigneusement la concentration de la préparation d’ARN et conservez-la à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi le jour de l’injection. Décongelez légèrement le vortex de l’échantillon d’ARN et tournez-le brièvement. Préparez maintenant une solution de travail avec de l’eau stérile et une concentration finale de 0,025 à 0,05 % de rouge de phénol, le rouge de phénol sert de marqueur visible pour l’injection de la solution dans l’embryon.

Ici, nous préparerons une solution de travail de 100 nanogrammes par microlitre d’ARNm EGFP avec 0,05 % de rouge de phénol. Enfin, gardez l’échantillon de travail sur de la glace et renvoyez le stock d’ARN à moins 80 degrés Celsius. Passez à la préparation du morpho lorsque vous êtes prêt à injecter cet échantillon.

Les oligonucléotides antisens de Morino sont largement utilisés pour modifier l’expression génique en bloquant la traduction d’une protéine ciblée ou en modifiant la NA prem. Les morphos d’épissage chez le poisson zèbre servent de puissant outil de génétique inverse en détruisant la fonction des gènes. Ici, nous allons micro-injecter un oligo-morphe ciblé sur le site d’initiation translationnelle de pkd deux. Nous utilisons régulièrement 300 M d’un oligo-morphe, spécialement conçu pour un gène d’intérêt obtenu à partir de gene tools LLC.

Nous ajoutons ensuite 100 microlitres d’eau stérile pour faire une solution mère de trois millimolaires, puis nous aliquotes la solution et la conservons à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi le jour de l’injection. Nous chauffons la solution morino à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, nous refroidissons immédiatement la solution sur de la glace et l’essorons brièvement, cette étape dénature toutes les structures secondaires de l’oligo et garantit que la solution est complètement solubilisée.

Ensuite, nous préparerons une solution fonctionnelle en diluant la solution de Morpho dans de l’eau stérile et une concentration finale de 0,025 à 0,05 % de rouge pinal. Dans cette démonstration, nous préparerons une solution de travail de 0,5 millimolaire de PKD deux morino avec 0,05 % de rouge de phénol. Conservez la solution de travail à température ambiante et procédez au remplissage de la micro-pipette lorsque vous êtes prêt à injecter cet échantillon.

Pour commencer, nous devrons fabriquer des micro-pipettes à utiliser pour les injections. Cela se fait en chauffant et en tirant des tubes capillaires en verre de silicate BOS dans un dispositif polaire à micro-pipette. Une fois les aiguilles tirées, elles sont conservées dans une boîte de Pétri sur une petite quantité d’argile ou de ruban adhésif.

Ensuite, nous préparerons des plaques de chambre de micro-injection en versant 1,5 % d’aros dans une XE trois plaques moyennes moulées avec des auges en forme de coin. Cela servira de méthode facile pour retenir les embryons pendant l’injection. Les plaques de la chambre agricole sont ensuite laissées se solidifier et stockées à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être utilisées.

Pour commencer à remplir la micro pipette. Coupez l’extrémité distale à l’aide d’une pince ou d’une lame de rasoir chirurgicale pour créer une ouverture qui est à peine visible au microscope à dissection à un grossissement de 50 x. Ensuite, placez deux microlitres de votre solution de travail.

Fixez le dos d’une micropipette à une seringue de cinq millilitres munie d’un tube sur une aiguille hypodermique et immergez légèrement l’extrémité distale de la micropipette dans votre goutte de solution de travail. Veillez à ne pas casser l’embout de la micro pipette. Siphonnez la solution de travail par l’extrémité distale de la micropipette en tirant sur le piston de la seringue.

Ensuite, nous étalonnerons le volume d’injection de la micro-pipette. Placez une goutte d’huile minérale sur une lame micrométrique et allumez l’alimentation et l’alimentation en air de l’appareil de micro-injecteur à impulsions de pression. Ensuite, fixez la micro-pipette au support de micro-pipette de l’appareil de micro-injecteur.

Le micro-injecteur est régulé en pression et les décharges sont activées en appuyant sur la pédale sous le microscope de dissection. Testez le volume d’injection en utilisant le micro-injecteur pour placer une goutte de votre solution de travail sur l’huile du micromètre. Mesurez le diamètre de la goutte pendant qu’elle flotte comme une sphère sur le dessus de l’huile.

Ajustez la durée et la pression d’injection pour calibrer soigneusement votre volume d’injection. Cette étape contribue à la reproductibilité de l’expérience de micro-injection. Dans cette démonstration, toutes les micro-injections seront effectuées avec un diamètre de goutte de 0,15 millimètre.

Enfin, une fois votre volume d’injection calibré, utilisez le bouton de maintien du micro-injecteur pour éviter le remplissage et la fuite de la micro pipette. Il est maintenant temps de préparer les embryons de poisson-zèbre. Le poisson-zèbre s’accouplera au hasard, dans les premières heures de chaque matin pour commencer la préparation, collectera des embryons au stade d’une cellule et les placera dans un milieu XE trois.

À l’aide d’une pipette de transfert de trois millilitres, disposez les embryons le long des auges cunéiformes dans les plaques de la chambre de micro-injection. Retirez le milieu de manière à ce que les embryons soient peu profondément, immergés et non inondés. Cette étape permet de déposer les embryons au fond des auges ainsi que de pénétrer le corion par la micro pipette.

Nous allons maintenant commencer les injections. Tout d’abord, nous manipulerons les embryons avec la micro-pipette afin que le cytoplasme de l’embryon au stade d’une cellule soit visible au microscope de dissection. Veillez à ne pas casser l’embout de la micro pipette, pénétrez le corion puis le jaune avec la micro pipette afin de l’injecter dans l’embryon.

Dans cette démonstration, nous allons d’abord micro-injecter dans le jaune directement sous la cellule et permettre au cytoplasme et à la diffusion d’apporter la solution de travail dans la cellule. Cet écoulement est visible grâce au rouge de phénol ajouté à la solution de travail. Comme il s’agit d’un embryon unicellulaire, il peut être injecté à main levée ou avec un manipulateur.

Nous démontrerons également l’injection directe dans le cytoplasme cellulaire. La micro-injection directe dans la cellule est plus robuste, mais prend du temps car une orientation correcte de l’embryon et une technique de micro-injection sont nécessaires. Comme la membrane cellulaire est plus rigoureuse que la membrane vitelline, il est souvent plus rapide d’entrer dans la micro pipette à travers le jaune pour atteindre la cellule.

Le cytoplasme orientant le pôle de l’animal vers le fond de l’auge et travaillant avec des mains fermes peut aider à cette méthode d’injection. Après la micro-injection, placez les embryons dans une boîte de Pétri avec un milieu E trois et incubez-les à 28,5 degrés Celsius pour un développement normal. Au cours des prochaines heures et des prochains jours du développement de l’embryon, observez les embryons pour les phénotypes qui vous intéressent.

Pour vérifier le succès de la microinjection, nous surveillerons l’expression de la GFP dans les embryons en développement à partir du stade du bouclier par microscopie à fluorescence d’embryon entier in vivo. Au fur et à mesure que l’ARN coiffé injecté se dégrade progressivement et dépend de la stabilité de la protéine exprimée. Sur la base des résultats précédemment publiés, nous nous attendons à ce que la morphine PKD deux imite la courbure de l’axe du corps dorsal telle qu’elle est trouvée chez le poisson-zèbre mutant PKD deux et présente des kystes rénaux environ deux à trois jours après la fécondation.

Nous venons de vous montrer une technique de micro-injection robuste pour effectuer des études de surexpression de l’ARNm et d’inactivation du gène morpho oligonucléotidique chez le poisson zèbre lors de cette procédure, rappelez-vous que c’est important. Injectez avec une main ferme. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.