Microinjection d'embryons de poissons zèbres pour analyser la fonction génique

Les poissons-zèbres mâles et femelles sont accouplés dans une cage de reproduction où les œufs fécondés tombent au fond et peuvent être facilement collectés. Les œufs sont ensuite alignés contre une lame de microscope dans une boîte de Pétri. Ensuite, l'aiguille de microinjection chargée est coupée et les paramètres d'injection sont ajustés de manière à ce que le volume injecté ait la taille souhaitée lorsqu'il est mesuré au micromètre.

Enfin, les œufs sont injectés un par un en continu. Bonjour, je suis Jonathan Rosen du laboratoire de John MA, du service de cardiologie de l'hôpital pour enfants de Boston. Et moi, c'est Michael Sweeney, également membre du laboratoire VY.

Aujourd'hui, nous allons démontrer comment l'ARNm ou le morpholino peut être injecté dans des embryons de poisson zèbre. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les effets de l'inhibition ou de la surexpression de produits géniques spécifiques. Commençons donc.

Pour commencer, il est nécessaire de préparer les poissons et les aquariums de reproduction en y installant des séparateurs la veille de l'injection afin d'augmenter la production totale d'œufs. Si désiré, les poissons peuvent être disposés selon un ratio de deux femelles pour un mâle. Le lendemain matin, après allumage des lumières de la pièce, retirer les séparateurs de plusieurs aquariums et laisser environ 20 minutes de temps d'accouplement sans perturbation. À l’aide d’une passoire, recueillir les œufs provenant des cages de reproduction et les rincer avec de l’eau pour œufs avant de les verser dans une boîte de Pétri.

Avec de l'eau d'œufs, les poissons peuvent être regroupés dans des aquariums plus grands afin de produire des cycles supplémentaires d'œufs destinés à l'injection. Ajustez le moment du prélèvement des œufs afin d'obtenir un nombre maximal d'œufs sans les laisser dépasser le stade de la cellule unique. Enfin, placez une lame de microscope dans le couvercle retourné d'une boîte de Pétri de 100 millimètres.

Utilisez une pipette de transfert pour aligner les œufs contre le bord de la lame en formant une colonne unique, puis retirez l'excès d'eau des œufs en appuyant un essuie-tout Kim contre le côté opposé aux œufs. Ensuite, nous préparerons les micro-aiguilles d'injection à l'aide d'un tireur de micro-pipettes. Nous allons étirer une capillaire en verre de un millimètre de diamètre extérieur en deux aiguilles et conserver ces aiguilles dans une boîte de Petri de 150 millimètres en les posant sur des rampes en pâte adhésive, ce qui permet de préparer les aiguilles à l'avance.

Nous utilisons les paramètres suivants. Chaleur 6, pôle 45, vitesse 60, vitesse 80. Charger l'extrémité large de l'aiguille avec trois microlitres de matériau d'injection à l'aide d'une pipette micro-loader.

Agiter la bolée vers l'extrémité de l'aiguille jusqu'à ce qu'il reste peu ou pas de bulles. Ensuite, nous allons activer la source d'air et le micro-injecteur. Insérer l'aiguille dans le micro-injecteur et s'assurer d'un joint étanche à l'intérieur du logement.

Vérifiez que le micromanipulateur est correctement positionné afin de permettre une large gamme de mouvements et de réglages. Amenez l'extrémité de l'aiguille dans le plan de vue du microscope. Surélevez-la par rapport au plateau et focalisez sur la région la plus fine de l'extrémité.

Utilisez une paire de forceps pointus pour pincer l'aiguille en un point qui la laisse suffisamment fine pour percer le chorion et le vitellus, tout en étant encore capable de délivrer une goutte de taille constante. Pour calculer le volume de chaque injection, nous utiliserons une goutte d'huile minérale sur un micromètre, insérerons l'aiguille dans l'huile et appuierons sur la pédale pour injecter une goutte de solution dans l'huile. Surveillez la taille de la goutte tout en ajustant la longueur de l'aiguille et la pression d'injection si nécessaire lors de l'injection dans l'huile.

Une perle d'un diamètre de 0,1 millimètre contient 500 picolitres de matériau d'injection. Des volumes d'injection de 500 picolitres ou d'un nanolitre sont généralement utilisés. Les volumes d'injection idéaux remplissent environ 10 % du volume de l'œuf.

La qualité de l'extrémité de l'aiguille est cruciale pour la facilité de l'injection ainsi que pour la qualité et la reproductibilité des résultats. Il est maintenant temps d'injecter pour commencer la procédure d'injection. Veillez à ce que les embryons n'aient pas dépassé le stade à quatre cellules.

Idéalement, l'embryon doit se trouver au stade uniloculaire. Ensuite, abaisser l'aiguille vers la colonne d'œufs, percer la surface du chorion et pénétrer dans le vitellus d'un seul mouvement fluide tout en observant. En cas de broiement ou de déchirure du sac vitellin, injecter le matériel d'injection dans le vitellus.

Évitez d'injecter des bulles d'air et surveillez attentivement les embryons endommagés de manière visible lors de l'injection au fur et à mesure des manipulations. Ajustez la pression si nécessaire afin de maintenir une taille constante des gouttelettes et, à l’aide d’une pipette, retirez les œufs qui semblent non fécondés ou qui sont détruits pendant le processus d’injection. Une fois une colonne d’œufs terminée, utilisez un faible flux d’eau pour œufs afin de transférer les œufs injectés vers une boîte de Pétri propre, puis répétez l’opération si nécessaire.

Conserver plusieurs embryons non injectés comme témoin. Plus tard au cours de la première journée, éliminer les embryons morts et noter le nombre d'embryons injectés. Remplacer périodiquement l'eau des œufs dans la boîte de culture afin de réduire le risque d'infection.

Notez que, selon ce qui est injecté, les embryons peuvent survivre à un taux inférieur à celui de leurs frères et sœurs non injectés. Heureusement, il est facile d'injecter un très grand nombre d'entre eux, ce qui rend ce problème rarement gênant. Nous allons maintenant présenter quelques résultats représentatifs des injections de morpholinos et d'ARNm.

Le témoin non injecté à 48 heures post-fécondation paraît normal, comme attendu. Cependant, les embryons injectés avec le morpholino HG E trois i trois eeg FFR un, qui inhibe les isoformes de HG contenant la première des deux répétitions de type eeg flike, présentent un œdème cérébral et une injection du cœur en verre. L'ARNm a également produit un phénotype évident à 24 heures post-fécondation.

Les têtes des embryons contrôles non injectés avaient un aspect normal. En revanche, certains embryons injectés avec le M NNA présentaient une opie. Nous venons de vous montrer comment l'injection de morpholinos ou d'ARNm au stade une cellule peut augmenter ou diminuer l'expression de gènes spécifiques au cours du développement ultérieur. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder cela à l'esprit également.

Une concentration élevée d'ARNm ou de morpholino peut entraîner une létalité non spécifique chez les embryons traités au morpholino. Chacun doit être testé empiriquement, mais généralement, des concentrations comprises entre 200 et 500 micromolaires inhibent spécifiquement l'activité du gène sans provoquer de létalité globale. Voilà tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.