Microinjection d'embryons de poissons zèbres pour analyser la fonction génique
9 mars 2009
Cette vidéo montre comment morpholino ou ARNm peut être injecté dans des embryons de poisson zèbre au stade d'une cellule pour diminuer ou augmenter le niveau des produits de gènes spécifiques au cours du développement ultérieur.
Les poissons-zèbres mâles et femelles sont accouplés dans une cage de reproduction où les œufs fécondés tombent au fond et peuvent être facilement collectés. Les œufs sont ensuite alignés contre une lame de microscope dans une boîte de Pétri. Ensuite, l'aiguille de microinjection chargée est coupée et les paramètres d'injection sont ajustés de manière à ce que le volume injecté ait la taille souhaitée lorsqu'il est mesuré au micromètre.
Enfin, les œufs sont injectés un par un en continu. Bonjour, je suis Jonathan Rosen du laboratoire de John MA, du service de cardiologie de l'hôpital pour enfants de Boston. Et je suis Michael Sweeney, également membre du laboratoire VY.
Aujourd'hui, nous allons démontrer comment l'ARNm ou le morpholino peut être injecté dans des embryons de poisson zèbre. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les effets de l'inhibition ou de la surexpression de produits géniques spécifiques. Commençons donc.
Pour commencer, il faudra préparer les poissons et les aquariums de reproduction en installant des séparateurs la nuit précédant l'injection afin d'augmenter la production totale d'œufs. Si désiré, les poissons peuvent être disposés selon un ratio de deux femelles pour un mâle. Le lendemain matin, après allumage des lumières de la pièce, retirer les séparateurs de plusieurs aquariums et laisser environ 20 minutes de temps d'accouplement sans perturbation. À l’aide d’une passoire, recueillir les œufs provenant des cages de reproduction et les rincer avec de l’eau pour œufs avant de les verser dans une boîte de Pétri.
Avec de l'eau d'œufs, les poissons peuvent être regroupés dans des aquariums plus grands afin de produire des cycles supplémentaires d'œufs destinés à l'injection. Ajustez le moment du prélèvement des œufs afin d'obtenir un nombre maximal d'œufs sans les laisser dépasser le stade de la cellule unique. Enfin, placez une lame de microscope dans le couvercle retourné d'une boîte de Pétri de 100 millimètres.
Utilisez une pipette de transfert pour aligner les œufs contre le bord de la lame en formant une colonne unique, puis retirez l'excès d'eau des œufs en appuyant un essuie-tout Kim contre le côté opposé aux œufs. Ensuite, nous préparerons les micro-aiguilles d'injection à l'aide d'un tireur de micropipettes. Nous allons étirer une capillaire en verre de un millimètre de diamètre extérieur en deux aiguilles et conserver ces aiguilles dans une boîte de Petri de 150 millimètres en les posant sur des rampes en pâte adhésive. Les aiguilles peuvent être tirées à l'avance.
Nous utilisons les paramètres suivants. Chaleur 6, pôle 45, vitesse 60, vitesse 80. Charger l'extrémité large de l'aiguille avec trois microlitres de matériau d'injection à l'aide d'une pipette micro-loader.
Agiter la bolée vers l'extrémité de l'aiguille jusqu'à ce qu'il reste peu ou pas de bulles. Ensuite, nous allons activer la source d'air et le micro-injecteur. Insérer l'aiguille dans le micro-injecteur et s'assurer d'un joint étanche à l'intérieur du logement.
Vérifiez que le micromanipulateur est correctement positionné afin de permettre une large gamme de mouvements et de réglages. Amenez l'extrémité de l'aiguille dans le plan de vue du microscope. Surélevez-la par rapport au plateau et focalisez sur la région la plus fine de l'extrémité.
Utilisez une paire de forceps pointus pour pincer l'aiguille en un point qui la laisse suffisamment étroite pour percer le chorion et le vitellus, tout en étant encore capable de délivrer une goutte de taille constante. Pour calculer le volume de chaque injection, nous utiliserons une goutte d'huile minérale sur un micromètre, insérerons l'aiguille dans l'huile et appuierons sur la pédale au pied pour injecter une goutte de solution dans l'huile. Surveillez la taille de la goutte tout en ajustant la longueur de l'aiguille et en modulant la pression d'injection si nécessaire lors de l'injection dans l'huile.
Une perle d'un diamètre de 0,1 millimètre contient 500 picolitres de matériau d'injection. Des volumes d'injection de 500 picolitres ou d'un nanolitre sont généralement utilisés. Les volumes d'injection idéaux remplissent environ 10 % du volume de l'œuf.
La qualité de l'extrémité de l'aiguille est cruciale pour la facilité de l'injection ainsi que pour la qualité et la reproductibilité des résultats. Il est maintenant temps d'injecter pour commencer la procédure d'injection. Veillez à ce que les embryons n'aient pas dépassé le stade à quatre cellules.
Idéalement, l'embryon doit se trouver au stade uniloculaire. Ensuite, abaissez l'aiguille vers la colonne d'œufs, percez la surface du chorion et pénétrez dans le vitellus d'un seul mouvement fluide tout en observant. En cas de broiement ou de déchirure du sac vitellin, injectez le matériel d'injection dans le vitellus.
Évitez d'injecter des bulles d'air et surveillez les embryons visiblement endommagés lors de l'injection au fur et à mesure de l'avancement. Ajustez la pression si nécessaire pour maintenir une taille de gouttelette constante et, à l'aide d'une pipette, retirez les œufs qui semblent non fécondés ou qui sont détruits pendant le processus d'injection. Après avoir terminé une colonne d'œufs, utilisez un léger courant d'eau pour œufs pour transférer les œufs injectés dans une boîte de Pétri propre et répétez l'opération au besoin.
Conserver plusieurs embryons non injectés comme témoins. Plus tard au cours de la première journée, éliminer les embryons morts et noter le nombre d'embryons injectés. Remplacer périodiquement l'eau des œufs dans la boîte de culture afin de réduire le risque d'infection.
Notez que selon ce qui est injecté, les embryons peuvent survivre à un taux inférieur à celui de leurs frères non injectés. Heureusement, il est facile d'injecter un très grand nombre d'entre eux, ce qui rend ce problème rarement gênant. Nous allons maintenant présenter quelques résultats représentatifs des injections de morpholinos et d'ARNm.
L'embryon témoin non injecté à 48 heures post-fécondation présente un aspect normal, comme attendu. Cependant, les embryons injectés avec le morpholino HG E trois i trois eeg FFR un, qui inhibe les isoformes de HG contenant la première des deux répétitions de type eeg flike, présentent un œdème cérébral et une injection du cœur en verre. L'ARNm a également produit un phénotype évident à 24 heures post-fécondation.
Les têtes des embryons contrôles non injectés avaient un aspect normal. En revanche, certains embryons injectés avec le M NNA présentaient une opie. Nous venons de vous montrer comment l'injection de morpholinos ou d'ARNm au stade une cellule peut augmenter ou diminuer l'expression de gènes spécifiques au cours du développement ultérieur. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de ne pas l'oublier également.
Une concentration élevée d'ARNm ou de morpholino peut entraîner une létalité non spécifique chez les embryons traités au morpholino. Chacun doit être testé empiriquement, mais généralement, des concentrations comprises entre 200 et 500 micromolaires inhibent spécifiquement l'activité du gène sans provoquer de létalité globale. Voilà tout.
Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.
Aperçu
Ce vidéo montre l'injection de morpholino ou d'ARNm dans des embryons de poisson zèbre au stade une cellule afin de moduler l'expression génique pendant le développement.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie du développement
- Manipulation génétique
Contexte
- Le poisson zèbre est couramment utilisé comme organisme modèle en biologie du développement.
- Les techniques d'injection permettent l'étude de la fonction et de la régulation des gènes.
- La manipulation de l'expression génique peut fournir des informations sur les processus de développement.
- Une manipulation soigneuse des embryons est essentielle pour la réussite des expériences.
Objectif de l'étude
- Démontrer la technique d'injection d'ARNm ou de morpholino dans des embryons de poisson zèbre.
- Observer les effets de l'inhibition ou de la surexpression génique sur le développement.
- Fournir un protocole aux chercheurs intéressés par la manipulation génétique.
Méthodes utilisées
- Élever des zebrafishs et collecter des œufs fécondés.
- Préparer des aiguilles de microinjection et les charger avec le matériau d'injection.
- Injecter les embryons au stade une cellule avec précision.
- Surveiller le développement des embryons et enregistrer les résultats.
Résultats principaux
- Les embryons injectés présentaient des phénotypes spécifiques selon le matériau utilisé.
- Les embryons témoins se développaient normalement, tandis que les embryons injectés montraient des résultats variés.
- L'injection de morpholino entraînait un œdème cérébral observable dans certains cas.
- Les injections d'ARNm provoquaient des modifications développementales distinctes.
Conclusions
- La technique modifie efficacement l'expression génique dans les embryons de poisson zèbre.
- Une optimisation minutieuse des paramètres d'injection est essentielle pour réussir.
- Les résultats mettent en évidence le potentiel de cette méthode pour l'étude de la fonction des gènes.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'injection microscopique d'embryons de poisson zèbre permet une modulation rapide et reproductible de l'expression génique pour la validation précoce de cibles en découverte de médicaments. Cette technique permet le criblage phénotypique à haut débit en autorisant une inhibition ou une surexpression précise de gènes spécifiques afin d'évaluer leurs conséquences fonctionnelles dans un système vertébré. Cette approche apporte une valeur déterminante en matière de réduction des risques mécanistiques en reliant la perturbation génétique à des phénotypes développementaux observables, ce qui éclaire la confiance dans la cible et les décisions de tri du portefeuille.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à l'inhibition ciblée ou à la surexpression de gènes afin de clarifier l'implication des voies métaboliques.
- Valeur opérationnelle : Permet la génération rapide de modèles d'extinction et d'acquisition de fonction afin de réduire les risques associés aux cibles avant le développement de tests.
- Valeur prédictive : Facilite la détection biologique des risques en reliant la modulation génétique à des résultats phénotypiques dans un système vertébré pertinent pour la maladie.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Produit des embryons standardisés et modulés génétiquement, adaptés à des analyses phénotypiques en aval dans le cadre de campagnes de criblage.
- Valeur opérationnelle : Permet la préparation de centaines d'embryons injectés par heure, soutenant des formats d'essai évolutifs et reproductibles.
- Valeur translationnelle : Génère des phénotypes quantitatifs et observables (par exemple, des modifications morphologiques) qui servent de points terminaux robustes pour le criblage de composés.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Assure une continuité entre la découverte de la fonction des gènes et la validation préclinique en modélisant des variants génétiques humains dans un contexte vertébré.
- Valeur opérationnelle : Permet de prendre des décisions d'avancement ajustées au risque en identifiant des phénotypes corrélés à l'efficacité ou à la toxicité de la modulation d'une cible.
- Confiance prédictive : Aide à hiérarchiser les cibles en fonction de la gravité et de la spécificité des phénotypes observés après injection, réduisant ainsi les faux positifs lors de l'identification de candidats privilégiés.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, en soutenant la validation de la cible par perturbation génétique et en permettant la transition vers le criblage phénotypique et l'identification de composés d'intérêt lorsque des résultats observables et dépendants de la dose sont disponibles.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses en permettant une modulation précise de l'expression génique afin d'évaluer la nécessité et la suffisance de cibles dans les voies de développement.
- Criblage : Génère des systèmes biologiques prêts à l'essai dotés de fonds génétiques standardisés pour une évaluation cohérente des composés.
- Analytique : Permet un scoring phénotypique quantitatif (par exemple, fréquence de défauts morphologiques) afin de comparer différentes conditions et d'évaluer les effets génétiques ou pharmacologiques.
- Recherche translationnelle : Relie la manipulation génétique à des phénotypes développementaux modélisant les mécanismes des maladies humaines, soutenant ainsi une validation alignée sur les biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour l'interrogation itérative de cibles sur plusieurs gènes et voies dans le cadre de projets de portefeuille.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la validation de la cible en réduisant l'ambiguïté mécanistique grâce à une perturbation génétique directe dans un modèle vertébré.
- Valeur opérationnelle : Offre une forte reproductibilité et une grande évolutivité, avec la capacité d'injecter des centaines d'embryons par heure à l'aide de protocoles standardisés de microinjection.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision « aller/ne pas aller » en fournissant des preuves phénotypiques précoces de la modulation de la cible, réduisant ainsi les investissements dans des cibles non viables.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque en associant des phénotypes spécifiques aux gènes avec des résultats développementaux, orientant ainsi l'allocation des capitaux dans le choix des cibles.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en élevage de zebrafish, manipulation d'embryons et technique de microinjection afin d'assurer la viabilité et la reproductibilité.
- Dépend d'un équipement spécialisé comprenant des microinjecteurs, des sources d'air, des micromètres et des tire-aiguilles pour un contrôle précis du volume.
- Exige une standardisation du volume d'injection, de la qualité des aiguilles et du stade des embryons entre opérateurs et sites afin d'obtenir des résultats reproductibles.
- Implique des ajustements à prévoir lors de l'application de la méthode à différents fonds génétiques ou modèles de maladies afin de maintenir la pertinence phénotypique.
- Comprend des limites pratiques telles que la sensibilité des embryons aux traumatismes liés à l'injection et les effets hors cible dépendants de la concentration, nécessitant une optimisation empirique pour chaque cible.
