Name: Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie I: La digestion et la perception des tissus pancréatiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Découvrez l'isolation d'îlots pancréatiques humains par digestion automatisée du tissu pancréatique au collagénase. Cette méthode optimise la qualité et la quantité des îlots pour la transplantation clinique.

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Soutenu par un financement de l&#39;Université de l&#39;Illinois à Chicago ainsi que des cellules des îlots Resource Center NIH (RFA-05-003 RR), la Fondation Christopher, la Fondation Efroymson, et la Fondation Tellabs.

1. Facilité de configuration <ol><li> L&#39;isolement des îlots humains est une procédure qui implique le temps sensible équipe, et donc, quatre personnes sont nécessaires pour mener à bien cette procédure. L&#39;équipe est dirigée par le chirurgien, qui dissèque et cannulates le pancréas. </li><li> L&#39;isolement des îlots commence à la minute de l&#39;équipe entre dans l&#39;installation des îlots UIC isolement. Membres de l&#39;équipe d&#39;assurer que tous les instruments nécessaires, comme la centrifugeuse, est vérifié et mis sous tension. Ils s&#39;assurent aussi de désinfecter toutes les hottes et les surfaces. </li><li> Deux personnes seront mis en place la table de canulation, machine à neige fondante, circuit de la digestion, l&#39;unité de perfusion, la machine de purification COBE, et les tables chirurgicales. </li><li> Simultanément, deux autres membres d&#39;équipe va préparer le support qui est nécessaire lors de l&#39;isolement. </li><li> Ensuite, les tubes de bactériologie (bouteilles, tubes, la forme et le sac), des tubes de prélèvement (pré-rempli avec de lavage), et les tubes et les plaques d&#39;évaluation sont préparés. </li><li> Préparer le tube de purification fixés comme suit: Le 1er tube vide et marqué à 150 ml, tubes remplis 2-12 avec 200 ml d&#39;M199 milieux supplémentés avec de l&#39;albumine humaine (solution de lavage) et marqué à 230 ml, et enfin un tube conique de 50 ml remplie avec 50 ml de solution de lavage. Une fois ces étapes de préparation sont complets, nous sommes prêts à commencer la préparation et la perfusion du pancréas. </li></ol> 2. La préparation du pancréas et de la perfusion <ol><li> Pour commencer la préparation et la perfusion du pancréas, un opérateur enlève l&#39;organe de l&#39;emballage en utilisant une technique stérile. Le chirurgien va transférer le pancréas à la table de décontamination. </li><li> Le chirurgien va remplir une seringue de 60 ml avec la solution de préservation du pancréas d&#39;origine et le remettre à un opérateur qui va l&#39;utiliser pour remplir des bouteilles préparées &quot;achats&quot; bactériologie. </li><li> Après une inspection visuelle pour déterminer si l&#39;organe est approprié pour l&#39;isolement des îlots (Si le pancréas est endommagé au cours d&#39;achat ou anatomique anormale, il ne peut être utilisé pour l&#39;isolement des îlots), le chirurgien va demander à un opérateur pour préparer la collagénase. Rappelez-vous que ce temps de remise en suspension varie entre marques différentes enzymes et des lots. </li><li> Lorsque le chirurgien est prêt, apporter les solutions de décontamination (Betadine, Fungizone / céfazoline et HBSS) à la table de décontamination et les verser dans les contenants appropriés. Chirurgien effectue la décontamination du pancréas à laver pendant une minute le pancréas dans chacune des solutions de décontamination. Le pancréas est ensuite placé dans un petit bocal stérile dans lequel il sera pesé. Après le poids est entré dans le dossier de lot, le pancréas est placé dans la poêle avec quelques canulation solution de conservation. </li><li> Le chirurgien va exposer et partiellement inciser le conduit principal et cathétériser chaque moitié du pancréas avec une canule. La canule sera garanti par une suture. Pour perfuser le pancréas, d&#39;abord de le déplacer à l&#39;unité de la perfusion et versez la solution enzymatique dans le bassin. Temps de perfusion totale est d&#39;environ 10 minutes, à 80 mmHg pendant 5 minutes, puis à 180 mm Hg pendant 5 minutes. Pancréas distendus après la perfusion. </li><li> Déplacer le pancréas perfusé à la casserole canulation, où le tissu adipeux est coupé par le pancréas attentivement. Ensuite, couper le pancréas en 10-12 morceaux et transfert à Ricordi Chambre pour la digestion. </li></ol> 3. La digestion du pancréas <ol><li> Pour commencer étape de digestion, le transfert du pancréas à la chambre vide Ricordi, ajouter un flacon de 2,5 ml de Pulmozyme, mis à l&#39;écran (éviter les gros morceau de bloc de tissu dans la chambre), à ​​proximité de la chambre, et remplissez le système. </li><li> Commencer à pomper la solution pendant 5 minutes. Secouez doucement la chambre pour mieux répartir la solution chaude partout. Après cinq minutes, secouez doucement la chambre pour la phase de digestion ensemble. Maintenir la température à 37 ˚ C. </li><li> Rocher de la chambre doucement jusqu&#39;à ce que la température atteint 37 °, puis secouez la chambre. Prendre un échantillon toutes les deux minutes et de détecter si îlots libres se trouvent sous la portée. Enregistrer les informations d&#39;évaluation des îlots dans le tableau de digestion du dossier de lot. Continuer à surveiller le pourcentage d&#39;îlots jusqu&#39;à il ya 50% d&#39;entre eux flottent librement et isolées dans la solution. </li></ol> 4. Collection de tissus <ol><li> Une fois que 50% des îlots se trouvent libres dans les échantillons, la digestion est arrêtée en ajoutant une solution froide de dilution RPMI dans le circuit. Tissulaire est recueilli dans 500 ml tubes coniques pré-rempli avec 30 ml d&#39;albumine humaine. Une fois les tubes sont filées, aspiration le surnageant et laver le culot avec la solution de lavage à froid. Faites tourner les tubes coniques à 1100 RPM (tours par minute) pendant 1 minute, 4 ˚ C. </li><li> Combiner tous les tubes de prélèvement suspendu avec du tissu pancréatique digère en une seule conique de 500 ml. Lorsqu&#39;un tube est plein de tissus lavés, spin et répétez le processus de lavage jusqu&#39;à ce que tous les tissus ont été lavés plusieurs fois. Spin ce tube et le transfert des tissus dans un seul tube conique de 250 ml. Porter le volume à 250 ml avecM199 solution de lavage complété avec HA et se préparer pour l&#39;échantillonnage. </li><li> Prenez un échantillon de 1 ml avec une pipette et ajouter à un tube de 15 ml conique pré-rempli avec 9 ml de solution de lavage. Puis mélanger doucement en inversant le tube de 15 ml conique et de cela, l&#39;échantillon à 1 ml directement dans un plat grille de comptage. Compter les cellules, et calculer le nombre de cellules en utilisant un facteur de dilution de 2500 (10x250). </li><li> Spin le tube conique de 250 ml et ajouter 150 ml d&#39;UW (Université du Wisconsin) Solution qui sert d&#39;ordinaire pour la préservation des organes. Lorsque l&#39;UW est ajouté, mélanger la suspension cellulaire à fond à l&#39;aide de la pipette. Enregistrer et communiquer à l&#39;opérateur de purification de l&#39;heure de début dans l&#39;UW. Laisser le tube (s) sur la glace et agiter de temps en temps. Maintenant, les îlots peuvent être purifié davantage. </li></ol>

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).</li>
<li>Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+and+isolation+variables+predicting+human+islet+isolation+success%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Donor and isolation variables predicting human islet isolation success.</a> Transplantation. 85, 950-955 (2008).</li>
<li>Toso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+human+islet+of+Langerhans+isolation+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields.</a> Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).</li>
</ol>

Il existe une variété de facteurs influant sur le résultat 9,10 isolement. Parmi eux, la digestion du tissu pancréatique joue un rôle de premier plan. Basé sur notre propre expérience d&#39;isolement d&#39;îlots humains, nous avons résumé ci-après les points critiques, qui pourraient potentiellement influencer le rendement de l&#39;îlot et de qualité. <ol><li> Le temps de digestion est différente lorsque les différents types d&#39;enzymes sont utilisés. </li><li> Dès que 40-50% des îlots complètement séparé du tissu...

<table><tbody><tr><td>Machine à slush glacé</td><td>équipement</td><td>Taylor Company</td><td>K4036546</td><td>produire de la glace stérile</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>équipement</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé MZ6 TLBD4.1</td><td>équipement</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire avec grille de 2 mm</td><td>équipement</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>comptage des îlots</td></tr><tr><td>Bain-marie numérique EX7</td><td>équipement</td><td>NesLab</td><td>105361058</td><td></td></tr><tr><td>Thermomètre</td><td>équipement</td><td>IBI:IR</td><td>60444</td><td></td></tr><tr><td>Balance MonoBloc AB 104-S</td><td>équipement</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119430864</td><td>mesurer la masse du pancréas</td></tr><tr><td>Contrôleur de vitesse MasterFlex II</td><td>équipement</td><td>Cole-Parmer</td><td>J00006445</td><td>régler la vitesse d'écoulement pendant la digestion</td></tr><tr><td>Appareil photo numérique DS L1</td><td>équipement</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>Unité de perfusion</td><td>équipement</td><td>Sur mesure</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Congélateur pour unité de perfusion</td><td>équipement</td><td>Fisher Scientific</td><td>3013P</td><td></td></tr><tr><td>Chambre Ricordi</td><td>équipement</td><td>Université de Miami</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Solution de dilution RPMI</td><td>réactif</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99783024</td><td></td></tr><tr><td>Solution de l'Université du Wisconsin (UW)</td><td>réactif</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée de Hank&amp;rsquo;s (HBSS)</td><td>réactif</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>Albumine humaine à 25 %</td><td>réactif</td><td>GRIFOLS</td><td>NDC 61953-0002-2</td><td></td></tr><tr><td>Milieu M199 (solution de lavage)</td><td>réactif</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase NB1, grade GMP</td><td>réactif</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002937</td><td></td></tr><tr><td>Protéase neutre NB1, grade GMP</td><td>réactif</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002936</td><td></td></tr><tr><td>Bétadine</td><td>réactif</td><td>Cardinal Health</td><td>29906-004</td><td></td></tr><tr><td>Céfazoline</td><td>réactif</td><td>West-Ward Pharmaceutical</td><td>NDC 0143-9924-90</td><td></td></tr><tr><td>Dithizone</td><td>réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement îlots pancréatiques humaines: partie i: la digestion et la perception des tissus pancréatiques

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Gestion diabète de type 1 est lourde, tant pour l&#39;individu et la société, ce qui coûte plus de 100 milliards de dollars annuellement. Malgré l&#39;utilisation répandue de la surveillance du glucose et des préparations d&#39;insuline nouvelles, de nombreuses personnes encore développer des complications secondaires dévastateurs. Transplantation d&#39;îlots pancréatiques peut restaurer à proximité de contrôle de la glycémie normale chez les patients diabétiques<sup&gt; 1</sup&gt;, Sans courir le risque d&#39;épisodes hypoglycémiques graves qui sont associées à une insulinothérapie intensive. Fournir la masse des îlots suffisant est important pour la transplantation d&#39;îlots de succès. Toutefois, caractéristique des donateurs, le prélèvement d&#39;organes et de la préservation affecter le résultat d&#39;isolement<sup&gt; 2</sup&gt;. À l&#39;Université de l&#39;Illinois à Chicago (UIC), nous avons développé un protocole d&#39;isolement de succès avec un gradient de purification améliorée<sup&gt; 3</sup&gt;. Le programme a démarré en Janvier 2004, et plus de 300 isolements ont été effectuées jusqu&#39;à Novembre 2008. Le pancréas ont été envoyés dans les solutions de conservation par le froid (UW, Université du Wisconsin ou de HTK, histidine-tryptophane cétoglutarate)<sup&gt; 4-7</sup&gt; À l&#39;isolement des cellules en laboratoire à l&#39;UIC pour l&#39;isolement des îlots. Les îlots pancréatiques ont été isolés en utilisant la méthode de l&#39;UIC qui est une version modifiée de la méthode initialement décrite par Ricordi<em&gt; Et al</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. Brièvement, après le nettoyage du pancréas du tissu environnant, il a été perfusé avec une solution enzymatique (collagénase Serva + Neutre protéase ou Sigma enzymes V). Le pancréas distendu a ensuite été transféré à la chambre de digestion Ricordi, connecté à une modification, le système de circulation tube fermé et chauffé à 37 ° C. Pendant la digestion, la chambre a été secoué doucement. Les échantillons ont été prises en permanence pour surveiller la progression de digestion. Une fois les îlots libres ont été détectées sous le microscope, la digestion a été arrêtée par rinçage à froid (4 ° C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) dans le système de circulation afin de diluer l&#39;enzyme. Après avoir été recueilli et lavé au M199 milieux supplémentés avec l&#39;albumine humaine, le tissu a été échantillonnée pour une pré-purification compter et incubées avec la solution UW avant purification. Processus de purification seront décrites dans la Partie II: Purification et culture d&#39;îlots humains.

Atteindre de haute qualité et la quantité appropriée d&#39;îlots humains est l&#39;une des conditions préalables importantes pour la transplantation d&#39;îlots de succès. Dans cette vidéo, nous décrire étape par étape les procédures pour l&#39;isolement des îlots pancréatiques humains (partie I: la digestion et la collecte des tissus pancréatiques) en utilisant une méthode modifiée automatisés.

Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie I: La digestion et la perception des tissus pancréatiques

La prise en charge du diabète de type 1 est pesante, tant pour l'individu que pour la société, avec un coût annuel dépassant les 100 milliards de dollars. Malgré l'utilisation généralisée de...

Cette procédure commence par l'obtention d'un tissu pancréatique provenant d'un donneur sain. Après une brève étape de taille, le pancréas distendu est découpé en morceaux réguliers et transféré dans la chambre de digestion. Le pancréas est canulé et une solution de collagénase est perfusée à travers la canule à l'aide d'une machine de perfusion automatisée.Enfin, le tissu pancréatique est recueilli dans des tubes coniques de grand volume, puis purifié davantage pour la transplantation d'îlots, ce qui sera montré dans une vidéo ultérieure. Bonjour, je suis American Chief du Laboratoire du Programme des Îlots Humains du Département de Surveillance à l'Université de l'Illinois à Chicago. Bonjour, je m'appelle Barbara Barbero et je fais également partie du Programme des Îlots Humains.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'isolement d'îlots pancréatiques humains. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire afin de récolter des îlots humains de haute qualité destinés à un usage clinique. Commençons.L'isolement des ilots humains est une procédure sensible au temps qui nécessite une collaboration d'équipe, et quatre personnes sont donc nécessaires pour réaliser cette procédure. L'équipe est dirigée par le chirurgien qui dissèque et canule le pancréas. L'isolement des ilots commence dès que l'équipe pénètre dans l'installation d'isolement des ilots de l'UIC.Les membres de l'équipe s'assurent que tous les instruments nécessaires, comme la centrifugeuse, sont vérifiés et mis en marche. Ils veillent également à désinfecter toutes les hottes et surfaces. Deux personnes installent la table de canulation, la machine de digestion par bain glacé, le circuit de perfusion, la machine de purification du unité cope, ainsi que les tables chirurgicales.Simultanément, deux autres membres de l'équipe prépareront le milieu nécessaire pendant l'isolement. Ensuite, les tubes de bactériologie, les tubes d'échantillonnage ainsi que les tubes et plaques d'évaluation sont préparés. Préparez le jeu de tubes de purification comme suit : le premier tube vide et marqué à 150 millilitres.Les tubes deux à douze remplis avec 200 millilitres de milieu M1 99, supplémenté avec de l'albumine humaine ou de la solution de lavage et marqués à 230 millilitres. Et enfin, un tube conique de 50 millilitres rempli avec 50 millilitres de solution de lavage.Une fois ces étapes de préparation terminées, nous sommes prêts à commencer la préparation et la perfusion du pancréas. Pour entamer la préparation et la perfusion du pancréas, un opérateur retire l'organe de son emballage. En utilisant une technique stérile, le chirurgien transfère le pancréas sur la table de décontamination.Le chirurgien remplira une seringue de 60 cc avec la solution de préservation initiale du pancréas et la remettra à un opérateur qui l'utilisera pour remplir des flacons bactériologiques de prélèvement préparés. Après un examen visuel permettant de déterminer si l'organe est adapté à l'isolement des ilots, le chirurgien demandera à un opérateur de préparer du collagénase aujourd'hui. Préparer est un acte accompli.Si le pancréas est endommagé pendant la collecte ou présente une anatomie anormale, il ne peut pas être utilisé pour l'isolement des ilots. Gardez à l'esprit que la durée de resuspension varie selon les marques et lots d'enzymes. Lorsque le chirurgien est prêt, apportez les solutions de décontamination à la table de décontamination et versez-les dans les récipients appropriés.Le chirurgien décontaminera le pancréas en rinçant l'organe pendant une minute. Le pancréas est ensuite placé dans chacune des solutions de décontamination, puis dans un petit flacon stérile afin d'être pesé. Une fois le poids saisi dans le registre de lot, le pancréas est placé dans le bac de cannulation.Avec une certaine solution de préservation, le chirurgien expose et incise partiellement le canal principal, puis canule chaque moitié du pancréas à l’aide d’une canule fixée par un point de suture afin de perfuser l’organe. Ensuite, déplacez-le vers l’unité de perfusion et versez la solution enzymatique dans le bac. La durée totale de perfusion est d’environ 10 minutes à 80 millimètres de mercure pendant cinq minutes.Ensuite, à 180 millimètres de mercure pendant cinq minutes, le pancréas apparaîtra distendu. Après la perfusion, transférez le pancréas perfusé dans le bac de canulation, où le tissu adipeux est soigneusement éliminé. Coupez ensuite le pancréas en 10 à 12 morceaux et transférez-le dans la chambre d’enregistrement pour la digestion.Pour commencer l'étape de digestion, transférez le pancréas dans la chambre d'enregistrement vide. Ajoutez un flacon de un millilitre et demi de pulmozyme sur l'écran en prenant soin d'éviter de bloquer la chambre, fermez la chambre et remplissez le système. Commencez à pomper la solution pendant cinq minutes.Balancer doucement la chambre pour répartir uniformément la solution tiède. Après cinq minutes, agiter délicatement la chambre pendant toute la phase de digestion. Maintenir la température à 37 degrés Celsius.Prélève un échantillon toutes les deux minutes et vérifie s'il y a des œillets libres sous le microscope ; enregistre les informations d'évaluation des œillets dans le tableau de digestion du registre de lot. Continue à surveiller le pourcentage d'œillets jusqu'à ce que 50 % d'entre eux flottent librement et isolément en solution. Une fois que 50 % des œillets sont observés libres dans les échantillons, arrête la digestion en ajoutant une solution de dilution RPMI froide.Le tissu circulaire est recueilli dans des tubes coniques de 500 millilitres préremplis avec 30 millilitres d'albumine humaine. Faire centrifuger les tubes coniques à 1100 tr/min pendant une minute à quatre degrés Celsius.Une fois les tubes centrifugés, aspirez le surnageant et lavez le culot. À l’aide de la solution de lavage froide, regroupez tous les tubes de collecte contenant le tissu pancréatique digéré dans un seul tube conique de 500 millilitres. Lorsqu’un tube est rempli de tissu lavé, effectuez une centrifugation, puis répétez le processus de lavage jusqu’à ce que tout le tissu ait été lavé plusieurs fois.Faire tourner ce tube et transférer le tissu dans un seul tube conique de 250 millilitres. Amener le volume à 250 millilitres avec la solution de lavage M1 99, supplémentée en albumine humaine, et préparer pour l'échantillonnage. Prélever un échantillon d'un millilitre à l’aide d’une pipette et l’ajouter à un tube conique de 15 millilitres prérempli avec neuf millilitres de solution de lavage.Ensuite, mélanger en retournant doucement le tube conique de 15 millilitres. Prélever directement un millilitre de cet échantillon dans une chambre de comptage. Compter les cellules et calculer le nombre de cellules.À l’aide d’un facteur de dilution de 2, centrifuger le tube conique de 250 millilitres et ajouter 150 millilitres de uw. Solution de l’Université du Wisconsin. Une fois le UW ajouté, homogénéiser soigneusement la suspension cellulaire à l’aide de la pipette, puis enregistrer et informer l’opérateur de purification.Le temps de départ en uw. Laisser les tubes sur de la glace et les agiter occasionnellement. À présent, les œillets peuvent être purifiés davantage à cette étape ; un échantillon de tissu pancréatique non purifié est prélevé pour le comptage.Lorsque la solution de dione est ajoutée à l'échantillon, seule la population de cellules des îlots pancréatiques sera colorée en rouge. Ensuite, leur qualité et leur quantité peuvent être évaluées. Nous venons de démontrer une procédure permettant d'isoler un grand nombre d'îlots pancréatiques humains de qualité, ce qui est essentiel pour une transplantation d'îlots réussie.Sur la base de notre expérience, dès que 40 à 50 % des îlots humains sont libérés des tissus environnants, il est nécessaire d'interrompre rapidement la digestion en diluant et en refroidissant le mélange de digestion. Il est également important de manipuler délicatement le tissu lors du prélèvement, du lavage et du mélange. Nous recommandons d'utiliser la méthode de purification U University really nice Chicago, qui permet une récupération supérieure d'îlots humains hautement purs.Cette méthode a également considérablement réduit le temps d'isolement, ce qui minimisera les lésions associées à l'ischémie du bouton oculaire. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Atteindre de haute qualité et la quantité appropriée d'îlots humains est l'une des conditions préalables importantes pour la transplantation d'îlots de succès. Dans cette vidéo, nous décrire étape par étape les procédures pour l'isolement des îlots pancréatiques humains (partie II: la purification et la culture d'îlots humains) en utilisant une méthode modifiée automatisés.

Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie II: Purification et culture d&#39;îlots humains

L'alimentation de type 2 diabétiques îlots pour la recherche est insuffisant. Ici, nous partageons notre protocole pour isoler les îlots de patients subissant une pancréatectomie partielle. Cette approche représente un lieu unique pour obtenir des îlots de diabétiques de type 2 et cliniquement correspondance des sujets non diabétiques, en nombre suffisant pour les études fondamentales et cliniques.

L&#39;isolement des îlots humains à partir des patients partiellement pancréatectomisés

Les îlots pancréatiques, également appelés îlots de Langerhans, sont un amas de cellules endocrines qui produisent des hormones pour la régulation du glucose et d’autres fonctions biologiques importantes. Ce protocole explique une méthode pour isoler les îlots pancréatiques en perfusant d’abord la collagénase via l’ampoule de Vater pour digérer le tissu pancréatique exocrine et une centrifugation simplifiée par gradient de densité pour purifier les îlots des souris.

Isolement des îlots pancréatiques par perfusion de collagénase : une méthode enzymatique pour isoler les cellules des îlots pancréatiques

défis critiques pour le domaine de la recherche sur le diabète sont de comprendre les mécanismes moléculaires qui régulent la réplication β-cellules d'îlots et de développer des méthodes pour stimuler la régénération β-cellulaire. Ici une méthode de criblage à haut contenu pour identifier et évaluer l'activité de réplication favorisant β-cellulaire de petites molécules est présenté.

Un haut contenu<em&gt; In vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-cellulaire Plateforme de découverte de la réplication

Nous décrivons ici un protocole pour isoler les îlots intacts de souris néonatales. Pancreata ont été partiellement digéré avec de la collagénase, suivi d'un lavage et cueillette à la main. 20 - 80 amas d'îlots peuvent être obtenus par le pancréas de souris nouveau-nés, qui sont appropriés pour de nombreuses études d'îlots.

Isolation efficace des îlots fonctionnels de néonatales Pancréas souris

Ce protocole d'isolement d'îlots a décrit une nouvelle voie d'injection de collagène pour digérer le tissu d'exocrine et une procédure simplifiée de gradient pour purifier les îlots des souris. Il s'agit de la digestion enzymatique, de la séparation/purification des gradients et de la cueillette manuelle des islets. L'isolement réussi peut donner 250-350 îlots de haute qualité et entièrement fonctionnels par souris.

Un protocole simple à haut rendement pour l'isolement des îlettes pancréatiques des souris

Ici, nous présentons un protocole pour produire des données de transcriptome de haute qualité et à grande échelle des cellules simples des îlots pancréatiques humains isolés utilisant une technologie microfluidique de séquençage d'ARN à base de gouttelettes.

Séquençage et analyse de l'ARN unicellulaire des îlots pancréatiques humains

Les cellules métaplasiques pancréatiques sont des précurseurs de cellules malignes à l’origine des tumeurs pancréatiques. Cependant, il est difficile d’isoler des cellules pancréatiques viables intactes. Nous présentons ici une méthode efficace de dissociation du tissu pancréatique. Les cellules peuvent ensuite être utilisées pour le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) ou pour la co-culture bidimensionnelle ou tridimensionnelle.

Dissection de tissu pancréatique pour isoler des cellules uniques viables

Cette étude a développé une méthode simplifiée pour extraire efficacement les îlots primaires fonctionnels et les cellules acinaires du pancréas de la souris, offrant un outil précieux pour étudier la communication intercellulaire dans la pathogenèse du diabète induit par la pancréatite aiguë.

Une méthode simple et rapide pour l’isolement simultané des îlots primaires et des cellules acinares pancréatiques primaires à partir de souris

Ce protocole décrit une méthode standardisée pour la prélèvement chirurgical, la digestion enzymatique et la purification par gradient de densité des îlots pancréatiques de rat Lewis, permettant des préparations à haut rendement et à haute pureté pour une utilisation directe dans des études de transplantation ou in vitro .

Isolement et purification des îlots pancréatiques à partir de rats de Lewis grâce à la digestion enzymatique et à la séparation par gradient de densité

Découvrez l'isolation d'îlots pancréatiques humains par digestion automatisée du tissu pancréatique au collagénase. Cette méthode optimise la qualité et la quantité des îlots pour la transplantation clinique.

Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie I: La digestion et la perception des tissus pancréatiques

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