Surveillance des hormones végétales Durant les réponses au stress

Cette procédure commence par l'homogénéisation du matériel végétal à l'aide de billes en céramique et une extraction ultérieure au dichlorométhane afin d'obtenir la phase organique. Après centrifugation, les échantillons sont séchés à l'air et préparés pour l'extraction en phase vapeur. Après élution à partir des filtres d'extraction en phase vapeur, on peut procéder à l'analyse des hormones végétales par spectrométrie de masse et chromatographie en phase gazeuse.

Bonjour, je suis Marie Engelberg du laboratoire JU Engelberg du département de biologie de l'Université du Texas à San Antonio, et je suis Ju Engelberg. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure simple permettant la quantification simultanée d'hormones végétales importantes. Nous utilisons couramment cette méthode pour surveiller les variations de ces hormones chez les plantes soumises à la technique de récompense par insectes.

Nous pouvons également surveiller les modifications de la composition en acides gras. Commençons donc. Pour l'extraction, vous devez d'abord préparer des vials de deux millilitres avec bouchon vissable.

Pour ce faire, ajouter 400 microlitres de solution d'extraction et 10 microlitres de l'étalon interne respectif à 10 nanogrammes par microlitre dans un flacon. Ensuite, congeler les flacons dans de l'azote liquide. Après congélation, ajouter les billes en céramique dans les flacons.

Tandis que les vials sont encore placés dans l'azote liquide, ajoutez du matériel végétal compris entre 50 et 200 milligrammes. Gardez à l'esprit que la masse du matériel végétal ajouté doit être estimée avant tout traitement ultérieur afin de permettre une quantification exacte ultérieure, basée sur la masse fraîche. Assurez-vous que tout l'azote liquide s'est évaporé avant de fermer hermétiquement le vial avec un bouchon.

Veillez à ce que le bouchon possède un joint en caoutchouc afin d'éviter les déversements de solvants et de composés extraits pendant l'homogénéisation. Homogénéisez le tissu dans un broyeur à billes de type Fast Prep ou PSU. Utilisez l'homogénéisateur à une vitesse de 6 000 pour les PSU pendant 30 secondes.

Une fois homogénéisé, retirez les vials un par un du homogénéisateur et ouvrez soigneusement le bouchon pour ajouter un millilitre de dichlorométhane à chaque échantillon, refermez hermétiquement les vials et homogénéisez pendant 10 à 15 secondes à 6 000. Après l'homogénéisation, transférez les vials dans une centrifugeuse de table et séparez la phase organique de la phase aqueuse à 10 000 × g pendant 60 secondes. Après la séparation des phases, transférez la couche inférieure verte des vials individuels dans un nouveau vial en verre propre de quatre millilitres.

Ceci est la phase organique contenant les hormones et les étalons internes. Évitez le transfert d'eau ou de la phase supérieure ; évaporez le solvant à l'air à l'aide d'un collecteur pendant environ 10 à 25 minutes. La durée dépendra de l'échantillon.

Vérifiez à l’aide d’un embout à flux d’air unique pour observer attentivement si les échantillons sont secs. Veillez à ne pas trop sécher les échantillons, car cela pourrait entraîner une perte de composés. Une fois les échantillons séchés, nous pouvons commencer la méthylation des composés contenant des acides carboxyliques présents dans nos échantillons.

Tout d'abord, ajoutez 100 microlitres d'un mélange de diéthyléther et de méthanol dans un rapport de neuf à un en volume à chaque vial. Ensuite, ajoutez quatre microlitres d'une solution de diazométhane triméthylsilylé à deux molaire dans l'hexane. Fermez immédiatement les vials avec un bouchon à vis ouvert équipé d'un septum en silicone doublé de téflon, secouez délicatement les vials et incubez-les à température ambiante pendant 25 à 30 minutes.

Activez un bloc chauffant et réglez-le à la température de collecte souhaitée. La volatilité des composés méthylés variera en fonction de leur taille et du nombre de groupes polaires. Les températures peuvent varier entre 80 et 200 degrés. Après une incubation de 30 minutes, arrêtez la réaction de méthylation en ajoutant quatre microlitres d'une solution d'acide acétique deux molaire dans l'hexane à chaque vial.

Cela permet d'éviter une réaction secondaire indésirable. Les filtres utilisés pour l'extraction en phase vapeur sont fabriqués à la main. Ils sont constitués de tubes en téflon.

Depuis un côté, un tube en verre bien ajusté d'environ quatre centimètres de longueur est inséré. Vous pouvez voir les deux disques en maille d'acier inoxydable, qui contiennent environ 20 à 30 milligrammes d'absorbant. Rincez les filtres qui seront utilisés pour la collecte des hormones végétales volatiles et méthylées en utilisant 200 microlitres de méthanol.

Ensuite, lavez les filtres deux fois avec 200 microlitres de dichlorométhane. Laissez sécher à l'air pour éliminer le solvant restant sur les filtres. Les filtres peuvent maintenant être utilisés pour le piégeage des hormones volatiles par extraction en phase vapeur.

Après 30 minutes d'incubation des échantillons, les septums en caoutchouc des bouchons de flacons de quatre millilitres sont découpés au scalpel. Le matériau extrait est désormais prêt à être récupéré afin de collecter les hormones végétales par extraction en phase vapeur. Les filtres nettoyés sont reliés à des lignes sous vide individuelles avec un débit d'environ 800 millilitres par minute.

Les filtres sont ensuite insérés dans le flacon à travers les septums découpés. Une petite pointe de pipette est également insérée pour servir d'entrée d'air. Pendant cette première partie de la procédure, les flacons contenant les filtres doivent être maintenus en position verticale afin d'éviter que tout liquide présent à l'intérieur du flacon n'entre en contact avec l'extrémité du filtre, ce qui contaminerait le filtre.

Ensuite, le GCMS maintient les vials manuellement jusqu'à ce que tout le liquide soit évaporé à travers le filtre. Puis, les vials munis des filtres sont placés sur le bloc chauffant et les composés évaporés par la chaleur sont collectés pendant trois minutes. Après cette étape finale d'extraction en phase vapeur, placez les vials avec les filtres toujours fixés sur un support et laissez-les refroidir.

Préparez des vials GC de 1,5 millilitre équipés d'inserts lorsque les filtres ont atteint la température ambiante. Introduisez à nouveau une boucle de 150 microlitres de dichlorométhane dans les vials. Après avoir expulsé le solvant restant du filtre, les vials sont fermés et peuvent désormais être analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse.

Pour l'analyse, utilisez un chromatographe en phase gazeuse équipé d'un injecteur à division/sans division relié à un spectromètre de masse fonctionnant en mode d'ionisation chimique. Après injection, les composés sont séparés sur une colonne HP-1 MS maintenue à 40 degrés Celsius pendant une minute. La température est programmée à une augmentation de 15 degrés Celsius par minute jusqu'à 250 degrés Celsius, puis maintenue à cette température pendant 10 minutes, l'hélium étant utilisé comme gaz vecteur à un débit constant de 0,7 millilitre par minute. Pour l'analyse par spectrométrie de masse, un spectromètre de masse à quadrupôle aussi bien qu'un spectromètre de masse à piège à ions peut être utilisé avec un gaz CI.

On peut utiliser soit l'isobutane soit le méthanol. Toutefois, dans chaque cas, les fragments issus de la réaction d'ionisation doivent être vérifiés avant de créer les programmes de comptage des ions sélectionnés. Nous utilisons un système de chromatographie en phase gazeuse GC 3,900 couplé à un spectromètre de masse Saturn MS 2200, avec du méthanol comme réactif d'ionisation chimique.

Veuillez consulter notre protocole écrit pour une description de notre programme. Assurez-vous que tous les composés sont identifiés par comparaison avec des étalons authentiques disponibles commercialement. La quantification de JA, SA et ABA s'effectue en corrélant la surface du pic des ions extraits avec la surface du pic des ions extraits de l'étalon interne correspondant, et elle est également basée sur la masse fraîche du matériel végétal utilisé.

Après avoir extrait les données des fichiers GCM S et effectué quelques calculs, nous avons constaté que l'ethin induisait des accumulations considérables d'acide salicylique, d'acide monique et également d'acide abscissique par rapport aux témoins non traités. Les données pour chaque hormone individuelle ont été obtenues à partir d'une seule analyse et démontrent la capacité de cette méthode à réaliser une analyse multiplexe des hormones. Nous venons de vous présenter une procédure simple mais néanmoins efficace pour extraire et quantifier des hormones végétales importantes ainsi que d'autres composés de signalisation.

Il est facile à réaliser et la plupart des outils que vous avez vus peuvent être facilement fabriqués à partir de matériel de laboratoire standard. Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.