Name: Channelrhodopsin2 stimulation médiée potentiels synaptiques au Drosophile Jonctions neuromusculaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Découvrez une méthode de stimulation optogénétique par channelrhodopsine2 pour étudier la physiologie synaptique aux jonctions neuromusculaires de larves de Drosophila. Cette technique offre une alternative simple et économique.

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Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de subventions de la santé RO1GM-33205 et MH-067284 à LC Griffith et par une bourse de Brandeis Université d&#39;été de recherche de premier cycle à NJ Hornstein. Des expériences préliminaires de cette technique ont été réalisées au Laboratoire de biologie marine dans le cadre de l&#39;édition 2008 des systèmes neuronaux et cours d&#39;été de comportement (NIMH subvention: R25 MH059472) à Woods Hole, MA.

Partie 1: soins des animaux et de croisements génétiques <ol><li> Maintenir SAMU-CHR2 et des lignes de vol OK371-GAL4 dans des bouteilles séparées contenant des médias volent standard 8. </li><li> Recueillir des lignes vierges volée OK371-GAL4 et les mâles de la SAMU-CHR2 lignes. </li><li> Placez les deux mâles et les femelles dans un flacon contenant des médias volent standards mélangé avec 1 mM tout-trans rétinal (ATR). ATR alimentaires doit être faite par les médias fondre premier vol régulier dans un micro-ondes pendant environ 1 minute. Une fois fondu, laisser refroidir pendant environ 30 secondes à une minute, puis ajouter 100 ul de 100 mM dans 100 ATR ETOH% pour chaque 10 ml de médias voler. Flacons placer sur la glace, puis stocker dans un endroit sombre à 4 ° C. </li><li> Laissez-mouches s&#39;accouplent et pondent leurs œufs dans une zone sombre à 22-25 ° C. </li><li> Attendre 3-4 jours jusqu&#39;au 3 stades larvaires sont visibles; à ce point, disposer des mouches adultes. </li></ol> Partie 2: configuration Rig <ol><li> Joindre toute pièce de dissection oeil 10x champ (dans notre cas, de Carl Zeiss Inc, www.zeiss.com, Thornwood, NY), à LED bleue source de lumière avec dissipateur thermique (laboratoires Thor, www.thorlabs.com, Newton, NJ ). Joindre à base magnétique avec message et pince. Couverture dissipateur de chaleur avec un bouclier électriquement à la terre pour réduire le bruit électrique généré par la source lumineuse. </li><li> Placer la base magnétique avec source de lumière sur la table de l&#39;air de l&#39;électrophysiologie gréement. </li><li> Connectez la source de lumière au circuit de commande et connectez circuit de contrôle à la source de tension externe (Powerlab 4 / 30, ADInstruments, www.adinstruments.com, Colorado Springs, CO). </li><li> Donner des impulsions 1-5 V au circuit de commande pour activer la lumière bleue. </li><li> Réglez la base magnétique et source de lumière jusqu&#39;à ce faisceau de lumière bleue est axé sur la zone à être occupé par une dissection des larves. </li></ol> Partie 3: Dissection <ol><li> Placez six broches de 0,1 mm d&#39;insectes dans le sol d&#39;un plat Sylgard-alignés. </li><li> Supprimer un 3 ème stade larvaire à partir de supports alimentaires et les placer dans une boîte de Petri en plastique. </li><li> Rincez les larves avec du sérum physiologique pour enlever la nourriture. </li><li> Placer les larves de dissection plat près des broches tiré et ajouter une solution saline au niveau de ½. </li><li> Orienter les larves de telle sorte que vous pouvez voir deux tubes argentés (trachée) qui longe la surface dorsale de l&#39;animal. </li><li> Insérer une grosse épingle directement dans la queue entre les tubes trachéaux. Tenir les larves et placer un second axe important dans sa tête, en étant sûr d&#39;étirer le corps en longueur. </li><li> Faire une petite incision près de la queue, et il continuera jusqu&#39;à la longueur du corps. Assurez-vous que les pointes des ciseaux sont soulevées afin de ne pas accidentellement coupé les nerfs ventraux et / ou muscles de la paroi du corps. </li><li> Placez quatre broches sur les quatre coins de l&#39;animal est maintenant abdomen ouvert. Mettez-les dans le plat de dissection, afin de filet de l&#39;animal. Préparation de Pin des enseignés. </li><li> En utilisant des pinces et ciseaux, retirez tripes de l&#39;animal, la trachée et corps gras. </li><li> Rincer la préparation avec une solution saline. </li><li> Repérez les lobes frontaux (comme on le voit dans la figure A) et le ganglion ventral de la préparation. </li><li> En utilisant des micro-ciseaux, découpez soigneusement travers le ganglion ventral, juste derrière les lobes frontaux. </li></ol> Partie 4: l&#39;enregistrement et la stimulation musculaire lumière bleue <ol><li> Tirez une électrode 10-20 μω utilisant un extracteur d&#39;électrode électronique (Sutter Instruments). </li><li> Remplir l&#39;électrode tiré avec 3 M de KCl. </li><li> Placer l&#39;électrode dans remplis porte-électrode et extrémité de l&#39;électrode de manoeuvrer avec un micromanipulateur proximité de préparation des larves sous loupe binoculaire sur l&#39;électrophysiologie gréement. </li><li> Identifier Muscle 6 (M6) dans tout segment de la paroi du corps (figure A). </li><li> Insérez soigneusement l&#39;électrode dans M6 et regarder pour hyperpolarisation rapide. Muscle potentiels de membrane de repos doit être partout de -30 mV à -70 mV. </li><li> Ajuster la lumière bleue de telle sorte que de préparation disséquée est centré dans faisceau de lumière. </li><li> Donner des impulsions de tension de 20 à 100 ms pour le circuit de contrôle. Accroître progressivement la tension fournie au circuit de commande. Surveillez les potentiels de jonction excitateurs dans la cellule musculaire (figure 1B). </li></ol> Les résultats représentatifs: La figure 1A montre un schéma de la configuration de l&#39;enregistrement et la préparation de filets. Figure 1B montre EJP typiques évoquées par impulsions lumineuses courtes. L&#39;amplitude EJP montré l&#39;amplitude est résumée par deux neurones moteurs connus à la fois innervent M6. Intensités de lumière Basse activé seulement une unité de moteur (données non présentées). <img src="/files/ftp_upload/1133/figure1.png" alt="Figure 1" width="600" height="373" /> Figure 1: Un schéma) d&#39;une plate-forme générale d&#39;enregistrement intracellulaire et avec LED bleue. Cerveau (Br) est supprimée pour inhiber l&#39;activité rythmique dans le ganglion ventral (VG). CHR2 est exprimée dans les neurones moteurs en utilisant le système GAL4-UAS. B) l&#39;enregistrement intracellulaire d&#39;un muscle M6. 40 ms des impulsions de lumière bleue (à 127 uW / mm 2) évoquent de manière fiable grands potentiels synaptiques (astérisques) à M6.

<ol><li>Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35(2007).</li>
<li>Lagow, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+a+hydrophobic+layer+by+a+point+mutation+in+syntaxin+1A+regulates+the+rate+of+synaptic+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion.</a> PLoS Biol. 5 (4), e72(2007).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279(2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940(2003).</li>
<li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 16 (17), 1741(2006).</li>
<li>Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+neuronal+cell+ablation+in+the+Drosophila+embryo%3A+pathfinding+by+follower+growth+cones+in+the+absence+of+pioneers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers.</a> Neuron. 14 (4), 707(1995).</li>
<li>Ralph Greenspan, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRalph+Greenspan%2C++%22Fly+Pushing%3A+The+Theory+and+Practice+of+Drosophila+Genetics%2C+2nd+ed%22">Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons aucun conflit d&#39;intérêt à divulguer.

Les étapes critiques impliquent à la fois la dissection initiale et l&#39;entrée des cellules musculaires. Si les nerfs sont coupés ou muscle est endommagé lors de la dissection initiale, il est difficile de continuer le reste de l&#39;expérience. Pendant la dissection, il faut être très prudent à l&#39;angle de disséquer des ciseaux à la hausse autant que possible lors de l&#39;incision dorsale. Durant la deuxième étape cruciale, entrer dans une cellule musculaire, il faut regarder pour un hyperpolarisation dernières ~...

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td>&lt;a href="http://www.ellsworth.com" target="_blank"&gt;www.ellsworth.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Épingles minuties</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Boîte de dissection</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fishersci.com" target="_blank"&gt;www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Amplificateur intracellulaire Neuroprobe et tête amplificatrice</td><td>A-M Systems</td><td>680100</td><td>&lt;a href="http://www.a-msystems.com" target="_blank"&gt;www.a-msystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;Système d'acquisition de données Powerlab 4/30&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"&gt;www.adinstruments.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Stimulateur Grass</td><td>Grass Technologies</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.grasstechnologies.com" target="_blank"&gt;www.grasstechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ordinateur de bureau</td><td>Dell</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.dell.com" target="_blank"&gt;www.dell.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Loupe binoculaire</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Source lumineuse</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>41446-062</td><td>&lt;a href="http://www.dolan-jenner.com" target="_blank"&gt;www.dolan-jenner.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Milieu pour mouches</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rétinal tout-trans</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>116-31-4</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"&gt;www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Mouches OK-371 Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Centre de ressources Bloomington</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Mouches UAS-ChR2&lt;/em&gt;</td><td>Laboratoire Fiala, laboratoire Griffith</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Circuit de commande de LED</td><td>Construit dans le laboratoire Griffith</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.ledsupply.com" target="_blank"&gt;http://www.ledsupply.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href="http://www.futureelectronics.com" target="_blank"&gt;http://www.futureelectronics.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;Composé de : &lt;br/&gt;1. Buck Puck 200 mA&lt;br/&gt;2. LED bleue&lt;br/&gt;3. Fil isolé&lt;br/&gt;4. Plaque de montage de circuit&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>Dissipateur thermique pour LED</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"&gt;http://www.thorlabs.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Table anti-vibrations</td><td>TMC</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html" target="_blank"&gt;http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Cage de Faraday</td><td>Construite dans le laboratoire Griffith</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-manipulateur Leica Leitz M</td><td>Leica Microsystems</td><td>ACS01</td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Support d'électrode</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.axon.com" target="_blank"&gt;www.axon.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Verre borosilicaté</td><td>FHC, Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fh-co.com/p14-15.pdf" target="_blank"&gt;www.fh-co.com/p14-15.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tireuse d'électrodes</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.sutter.com" target="_blank"&gt;www.sutter.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Solution saline HL 3.1 avec 0,8 mM Ca2+</td><td></td><td></td><td>Composition (mM) :&lt;br/&gt; NaCl : 70 KCl : 5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; : 0,8&lt;br/&gt; MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; : 4 Sucrose : 115&lt;br/&gt; NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; : 10 Tréhalose : 5 HEPES</td></tr><tr><td>Outils de microdissection</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

channelrhodopsin2 stimulation médiée potentiels synaptiques au drosophile jonctions neuromusculaires

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

L&#39;<em&gt; Drosophile</em&gt; Larvaires neuromusculaires préparation s&#39;est avérée être un outil utile pour étudier la physiologie synaptique<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;. Actuellement, le seul moyen disponible pour évoquer les potentiels excitateurs jonctionnelle (EJPs) dans cette préparation implique l&#39;utilisation d&#39;électrodes d&#39;aspiration. Dans les deux laboratoires de recherche et d&#39;enseignement, les étudiants ont souvent des difficultés à manœuvrer et manipuler ce type d&#39;électrode de stimulation. Dans le présent travail, nous montrons comment stimuler la distance potentiels synaptiques à la JNM larvaires sans l&#39;utilisation d&#39;électrodes d&#39;aspiration. En exprimant channelrhodopsin2 (CHR2)<sup&gt; 4,5,6</sup&gt; Dans<em&gt; Drosophile</em&gt; Neurones moteurs en utilisant les<em&gt; GAL4 UAS-</em&gt; Système<sup&gt; 7</sup&gt;, Et en faisant des changements mineurs à une plate-forme de base électrophysiologie, nous avons pu évoquer de manière fiable EJPs avec des impulsions de lumière bleue. Cette technique pourrait être particulièrement utile dans les laboratoires d&#39;enseignement de neurophysiologie, où le temps la pratique des étudiants gréement et les ressources sont limitées.

Cette procédure utilise une lumière bleue-activé le canal d&#39;algues et de cellules d&#39;outils spécifiques d&#39;expression génétique pour évoquer les potentiels synaptiques avec des impulsions de lumière à la jonction neuromusculaire (JNM) dans<em&gt; Drosophile</emLarves&gt;. Cette technique est un moyen peu coûteux et facile à utiliser, alternative à la stimulation d&#39;électrodes d&#39;aspiration pour les études de physiologie synaptique dans la recherche et des laboratoires d&#39;enseignement.

Channelrhodopsin2 stimulation médiée potentiels synaptiques au Drosophile Jonctions neuromusculaires

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