Name: Channelrhodopsin2 stimulation médiée potentiels synaptiques au Drosophile Jonctions neuromusculaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Découvrez une méthode de stimulation optogénétique par channelrhodopsine2 pour étudier la physiologie synaptique aux jonctions neuromusculaires de larves de Drosophila. Cette technique offre une alternative simple et économique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de subventions de la santé RO1GM-33205 et MH-067284 à LC Griffith et par une bourse de Brandeis Université d&#39;été de recherche de premier cycle à NJ Hornstein. Des expériences préliminaires de cette technique ont été réalisées au Laboratoire de biologie marine dans le cadre de l&#39;édition 2008 des systèmes neuronaux et cours d&#39;été de comportement (NIMH subvention: R25 MH059472) à Woods Hole, MA.

Partie 1: soins des animaux et de croisements génétiques <ol><li> Maintenir SAMU-CHR2 et des lignes de vol OK371-GAL4 dans des bouteilles séparées contenant des médias volent standard 8. </li><li> Recueillir des lignes vierges volée OK371-GAL4 et les mâles de la SAMU-CHR2 lignes. </li><li> Placez les deux mâles et les femelles dans un flacon contenant des médias volent standards mélangé avec 1 mM tout-trans rétinal (ATR). ATR alimentaires doit être faite par les médias fondre premier vol régulier dans un micro-ondes pendant environ 1 minute. Une fois fondu, laisser refroidir pendant environ 30 secondes à une minute, puis ajouter 100 ul de 100 mM dans 100 ATR ETOH% pour chaque 10 ml de médias voler. Flacons placer sur la glace, puis stocker dans un endroit sombre à 4 ° C. </li><li> Laissez-mouches s&#39;accouplent et pondent leurs œufs dans une zone sombre à 22-25 ° C. </li><li> Attendre 3-4 jours jusqu&#39;au 3 stades larvaires sont visibles; à ce point, disposer des mouches adultes. </li></ol> Partie 2: configuration Rig <ol><li> Joindre toute pièce de dissection oeil 10x champ (dans notre cas, de Carl Zeiss Inc, www.zeiss.com, Thornwood, NY), à LED bleue source de lumière avec dissipateur thermique (laboratoires Thor, www.thorlabs.com, Newton, NJ ). Joindre à base magnétique avec message et pince. Couverture dissipateur de chaleur avec un bouclier électriquement à la terre pour réduire le bruit électrique généré par la source lumineuse. </li><li> Placer la base magnétique avec source de lumière sur la table de l&#39;air de l&#39;électrophysiologie gréement. </li><li> Connectez la source de lumière au circuit de commande et connectez circuit de contrôle à la source de tension externe (Powerlab 4 / 30, ADInstruments, www.adinstruments.com, Colorado Springs, CO). </li><li> Donner des impulsions 1-5 V au circuit de commande pour activer la lumière bleue. </li><li> Réglez la base magnétique et source de lumière jusqu&#39;à ce faisceau de lumière bleue est axé sur la zone à être occupé par une dissection des larves. </li></ol> Partie 3: Dissection <ol><li> Placez six broches de 0,1 mm d&#39;insectes dans le sol d&#39;un plat Sylgard-alignés. </li><li> Supprimer un 3 ème stade larvaire à partir de supports alimentaires et les placer dans une boîte de Petri en plastique. </li><li> Rincez les larves avec du sérum physiologique pour enlever la nourriture. </li><li> Placer les larves de dissection plat près des broches tiré et ajouter une solution saline au niveau de ½. </li><li> Orienter les larves de telle sorte que vous pouvez voir deux tubes argentés (trachée) qui longe la surface dorsale de l&#39;animal. </li><li> Insérer une grosse épingle directement dans la queue entre les tubes trachéaux. Tenir les larves et placer un second axe important dans sa tête, en étant sûr d&#39;étirer le corps en longueur. </li><li> Faire une petite incision près de la queue, et il continuera jusqu&#39;à la longueur du corps. Assurez-vous que les pointes des ciseaux sont soulevées afin de ne pas accidentellement coupé les nerfs ventraux et / ou muscles de la paroi du corps. </li><li> Placez quatre broches sur les quatre coins de l&#39;animal est maintenant abdomen ouvert. Mettez-les dans le plat de dissection, afin de filet de l&#39;animal. Préparation de Pin des enseignés. </li><li> En utilisant des pinces et ciseaux, retirez tripes de l&#39;animal, la trachée et corps gras. </li><li> Rincer la préparation avec une solution saline. </li><li> Repérez les lobes frontaux (comme on le voit dans la figure A) et le ganglion ventral de la préparation. </li><li> En utilisant des micro-ciseaux, découpez soigneusement travers le ganglion ventral, juste derrière les lobes frontaux. </li></ol> Partie 4: l&#39;enregistrement et la stimulation musculaire lumière bleue <ol><li> Tirez une électrode 10-20 μω utilisant un extracteur d&#39;électrode électronique (Sutter Instruments). </li><li> Remplir l&#39;électrode tiré avec 3 M de KCl. </li><li> Placer l&#39;électrode dans remplis porte-électrode et extrémité de l&#39;électrode de manoeuvrer avec un micromanipulateur proximité de préparation des larves sous loupe binoculaire sur l&#39;électrophysiologie gréement. </li><li> Identifier Muscle 6 (M6) dans tout segment de la paroi du corps (figure A). </li><li> Insérez soigneusement l&#39;électrode dans M6 et regarder pour hyperpolarisation rapide. Muscle potentiels de membrane de repos doit être partout de -30 mV à -70 mV. </li><li> Ajuster la lumière bleue de telle sorte que de préparation disséquée est centré dans faisceau de lumière. </li><li> Donner des impulsions de tension de 20 à 100 ms pour le circuit de contrôle. Accroître progressivement la tension fournie au circuit de commande. Surveillez les potentiels de jonction excitateurs dans la cellule musculaire (figure 1B). </li></ol> Les résultats représentatifs: La figure 1A montre un schéma de la configuration de l&#39;enregistrement et la préparation de filets. Figure 1B montre EJP typiques évoquées par impulsions lumineuses courtes. L&#39;amplitude EJP montré l&#39;amplitude est résumée par deux neurones moteurs connus à la fois innervent M6. Intensités de lumière Basse activé seulement une unité de moteur (données non présentées). <img src="/files/ftp_upload/1133/figure1.png" alt="Figure 1" width="600" height="373" /> Figure 1: Un schéma) d&#39;une plate-forme générale d&#39;enregistrement intracellulaire et avec LED bleue. Cerveau (Br) est supprimée pour inhiber l&#39;activité rythmique dans le ganglion ventral (VG). CHR2 est exprimée dans les neurones moteurs en utilisant le système GAL4-UAS. B) l&#39;enregistrement intracellulaire d&#39;un muscle M6. 40 ms des impulsions de lumière bleue (à 127 uW / mm 2) évoquent de manière fiable grands potentiels synaptiques (astérisques) à M6.

<ol><li>Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35(2007).</li>
<li>Lagow, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+a+hydrophobic+layer+by+a+point+mutation+in+syntaxin+1A+regulates+the+rate+of+synaptic+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion.</a> PLoS Biol. 5 (4), e72(2007).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279(2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940(2003).</li>
<li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 16 (17), 1741(2006).</li>
<li>Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+neuronal+cell+ablation+in+the+Drosophila+embryo%3A+pathfinding+by+follower+growth+cones+in+the+absence+of+pioneers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers.</a> Neuron. 14 (4), 707(1995).</li>
<li>Ralph Greenspan, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRalph+Greenspan%2C++%22Fly+Pushing%3A+The+Theory+and+Practice+of+Drosophila+Genetics%2C+2nd+ed%22">Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons aucun conflit d&#39;intérêt à divulguer.

Les étapes critiques impliquent à la fois la dissection initiale et l&#39;entrée des cellules musculaires. Si les nerfs sont coupés ou muscle est endommagé lors de la dissection initiale, il est difficile de continuer le reste de l&#39;expérience. Pendant la dissection, il faut être très prudent à l&#39;angle de disséquer des ciseaux à la hausse autant que possible lors de l&#39;incision dorsale. Durant la deuxième étape cruciale, entrer dans une cellule musculaire, il faut regarder pour un hyperpolarisation dernières ~...

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td>&lt;a href="http://www.ellsworth.com" target="_blank"&gt;www.ellsworth.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Épingles minuties</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Boîte de dissection</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fishersci.com" target="_blank"&gt;www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Amplificateur intracellulaire Neuroprobe et tête amplificatrice</td><td>A-M Systems</td><td>680100</td><td>&lt;a href="http://www.a-msystems.com" target="_blank"&gt;www.a-msystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;Système d'acquisition de données Powerlab 4/30&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"&gt;www.adinstruments.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Stimulateur Grass</td><td>Grass Technologies</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.grasstechnologies.com" target="_blank"&gt;www.grasstechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Ordinateur de bureau</td><td>Dell</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.dell.com" target="_blank"&gt;www.dell.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Loupe binoculaire</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Source lumineuse</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>41446-062</td><td>&lt;a href="http://www.dolan-jenner.com" target="_blank"&gt;www.dolan-jenner.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Milieu pour mouches</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rétinal tout-trans</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>116-31-4</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"&gt;www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Mouches OK-371 Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Centre de ressources Bloomington</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Mouches UAS-ChR2&lt;/em&gt;</td><td>Laboratoire Fiala, laboratoire Griffith</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Circuit de commande de LED</td><td>Construit dans le laboratoire Griffith</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.ledsupply.com" target="_blank"&gt;http://www.ledsupply.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href="http://www.futureelectronics.com" target="_blank"&gt;http://www.futureelectronics.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;Composé de : &lt;br/&gt;1. Buck Puck 200 mA&lt;br/&gt;2. LED bleue&lt;br/&gt;3. Fil isolé&lt;br/&gt;4. Plaque de montage de circuit&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>Dissipateur thermique pour LED</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"&gt;http://www.thorlabs.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Table anti-vibrations</td><td>TMC</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html" target="_blank"&gt;http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Cage de Faraday</td><td>Construite dans le laboratoire Griffith</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-manipulateur Leica Leitz M</td><td>Leica Microsystems</td><td>ACS01</td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Support d'électrode</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.axon.com" target="_blank"&gt;www.axon.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Verre borosilicaté</td><td>FHC, Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fh-co.com/p14-15.pdf" target="_blank"&gt;www.fh-co.com/p14-15.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tireuse d'électrodes</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.sutter.com" target="_blank"&gt;www.sutter.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Solution saline HL 3.1 avec 0,8 mM Ca2+</td><td></td><td></td><td>Composition (mM) :&lt;br/&gt; NaCl : 70 KCl : 5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; : 0,8&lt;br/&gt; MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; : 4 Sucrose : 115&lt;br/&gt; NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; : 10 Tréhalose : 5 HEPES</td></tr><tr><td>Outils de microdissection</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

channelrhodopsin2 stimulation médiée potentiels synaptiques au drosophile jonctions neuromusculaires

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

L&#39;<em&gt; Drosophile</em&gt; Larvaires neuromusculaires préparation s&#39;est avérée être un outil utile pour étudier la physiologie synaptique<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;. Actuellement, le seul moyen disponible pour évoquer les potentiels excitateurs jonctionnelle (EJPs) dans cette préparation implique l&#39;utilisation d&#39;électrodes d&#39;aspiration. Dans les deux laboratoires de recherche et d&#39;enseignement, les étudiants ont souvent des difficultés à manœuvrer et manipuler ce type d&#39;électrode de stimulation. Dans le présent travail, nous montrons comment stimuler la distance potentiels synaptiques à la JNM larvaires sans l&#39;utilisation d&#39;électrodes d&#39;aspiration. En exprimant channelrhodopsin2 (CHR2)<sup&gt; 4,5,6</sup&gt; Dans<em&gt; Drosophile</em&gt; Neurones moteurs en utilisant les<em&gt; GAL4 UAS-</em&gt; Système<sup&gt; 7</sup&gt;, Et en faisant des changements mineurs à une plate-forme de base électrophysiologie, nous avons pu évoquer de manière fiable EJPs avec des impulsions de lumière bleue. Cette technique pourrait être particulièrement utile dans les laboratoires d&#39;enseignement de neurophysiologie, où le temps la pratique des étudiants gréement et les ressources sont limitées.

Cette procédure utilise une lumière bleue-activé le canal d&#39;algues et de cellules d&#39;outils spécifiques d&#39;expression génétique pour évoquer les potentiels synaptiques avec des impulsions de lumière à la jonction neuromusculaire (JNM) dans<em&gt; Drosophile</emLarves&gt;. Cette technique est un moyen peu coûteux et facile à utiliser, alternative à la stimulation d&#39;électrodes d&#39;aspiration pour les études de physiologie synaptique dans la recherche et des laboratoires d&#39;enseignement.

Channelrhodopsin2 stimulation médiée potentiels synaptiques au Drosophile Jonctions neuromusculaires

La préparation neuromusculaire larvaire de Drosophila s'est avérée être un outil utile pour l'étude de la physiologie synaptique1,2,3. Actuellement, le seul moyen disponible...

Cette procédure commence par l'élevage de drosophiles. Des larves de troisième stade portant le génotype approprié sont élevées sur un milieu contenant du rétinol tout-trans. Chaque larve est épinglée par la tête et la queue.Ensuite, aplatir la préparation FLA. Le cerveau et les nerfs postérieurs sont alors sectionnés pour interrompre l'activité motrice rythmique. Ensuite, la source de lumière LED bleue avec son boîtier de commande est ajustée et focalisée sur la préparation.Enfin, utilisez une électrode fine pour piquer le muscle numéro six. Ensuite, appliquez des impulsions lumineuses à l’aide d’une source de tension. Bonjour, je suis Nicholas Marstein du laboratoire de la Dre Leslie Griffith, du Département de biologie de l’Université Brandeis.Bonjour, je suis Stefan Pulver, également du laboratoire Griffith. Aujourd'hui, nous allons vous montrer la procédure permettant d'induire des potentiels synaptiques à l'aide du mutant channelrhodopsin absent deux à la jonction neuromusculaire de la larve de drosophile. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la physiologie synaptique et la drosophile.Nous l'utilisons également pour enseigner la physiologie synaptique et les travaux pratiques aux étudiants. Commençons donc. Pour commencer ce protocole, maintenez les lignées de drosophiles UAS channel redsin two et okay, 3 7, 1 gal four dans des bouteilles séparées contenant un milieu standard pour drosophiles.Collectez des mouches vierges issues des lignées 3 7, 1 gal, quatre lignées de mouches, et des mâles issus des lignées UAS channel redsin. Deux lignées. Ensuite, préparez un milieu pour mouches mélangé à un millimolaire d'all-trans-rétinol ou de TR. Pour ce faire, faites fondre le milieu standard pour mouches au micro-ondes pendant environ une minute.Une fois fondu, laissez refroidir le milieu pendant environ 30 à 60 secondes, puis ajoutez 100 microlitres de TR à 100 millimolaire dans de l'éthanol à 100 % pour chaque 10 millilitres de milieu pour mouches. Lorsque les flacons contenant le milieu à TR sont prêts, placez les mâles et femelles collectés dans chaque flacon. Placez les flacons dans un endroit sombre à une température de 22 à 25 degrés Celsius pour permettre aux mouches de s'accoupler et de pondre des œufs ; attendez quatre à cinq jours jusqu'à ce que des larves de troisième stade soient visibles.À ce stade, vous pouvez éliminer les mouches adultes. Nous sommes maintenant prêts à procéder à la mise en place du dispositif d'électrophysiologie. Fixez un oculaire de loupe binoculaire à une source de lumière bleue LED équipée d'un dissipateur thermique.Utilisez un support et une pince pour fixer une base magnétique à l'oculaire et à la source lumineuse LED. Placez la base magnétique sur la table anti-vibrations du dispositif d'électrophysiologie. Ensuite, reliez la source lumineuse à un circuit de commande, puis connectez le circuit de commande à une source de tension externe.Nous utilisons la sortie de tension du système d'acquisition de données en électrophysiologie PowerLab fabriqué par AD Instruments. Une fois connecté à la source de tension, appliquez des impulsions d'un à cinq volts au circuit de commande afin d'activer la lumière bleue, puis ajustez la base magnétique et la source lumineuse jusqu'à ce que le faisceau de lumière bleue soit focalisé sur la zone qui accueillera la dissection larvaire. Après avoir effectué les réglages appropriés, nous sommes prêts à passer à la dissection larvaire.Pour commencer la dissection, insérez six épingles de 0,1 millimètre dans le fond d'une boîte de Sögarh. Retirez des larves de troisième stade du milieu nutritif et placez-les dans une boîte de Petri en plastique. Rincez les larves avec du sérum physiologique afin d'éliminer tout résidu de nourriture adhérent aux larves.Placez ensuite les larves dans la boîte de dissection près des épingles étirées et remplissez la boîte à moitié avec du sérum physiologique. Orientez maintenant les larves de manière à voir deux tubes argentés qui parcourent la surface dorsale de l'animal. Ces tubes argentés sont les trachées.Insérez une grande épingle directement dans la queue, entre les tubes trachéens. Maintenez les larves vers le bas et placez une deuxième grande épingle dans leur tête. Veillez à étirer le corps dans le sens de la longueur lors de l'insertion de l'épingle.Utilisez des ciseaux pour pratiquer une petite incision près de la queue. Poursuivez l'incision sur toute la longueur du corps. Veillez à garder les pointes des ciseaux relevées afin d'éviter de couper les nerfs ventraux et/ou les muscles de la paroi corporelle.Placer quatre épingles aux quatre coins de l'animal. Ouvrir maintenant la région médiane. Insérer les épingles dans la boîte de dissection afin de désosser l'animal.Épingler également la préparation afin de la maintenir tendue à l’aide de pinces et de ciseaux. Retirer les organes digestifs, la trachée et les corps gras de l’animal. Rincer la préparation avec du sérum physiologique.Après le rinçage, repérez les lobes frontaux et le ganglion ventral de la préparation à l’aide de ciseaux microchirurgicaux. Coupez délicatement à travers le ganglion ventral juste derrière les lobes frontaux. Une fois la dissection terminée, procédez à la stimulation par lumière bleue et à l’enregistrement de l’activité musculaire.Pour effectuer l'enregistrement musculaire, tirez une électrode ayant une résistance de 10 à 20 mégaohms. À l’aide d’un tireur d’électrodes électronique, remplissez l’électrode tirée avec du KCl 3 M. Placez l’électrode remplie dans le porte-électrode.Placez maintenant la préparation larvaire sous un microscope stéréoscopique sur le dispositif. Ajustez la lumière bleue de manière à centrer la préparation disséquée dans le faisceau lumineux. Identifiez le muscle six ou M six dans n'importe quel segment de la paroi corporelle de la larve à l’aide d’un micromanipulateur, insérez délicatement l’électrode dans le muscle M six et observez une éventuelle hyperpolarisation rapide du muscle.Les potentiels membranaires au repos doivent se situer entre moins 30 millivolts et moins 70 millivolts. Une fois que l'électrode est correctement insérée, appliquez des impulsions de tension de 20 à 100 millisecondes au circuit de commande. Augmentez progressivement la tension fournie au circuit de commande.Surveillez la présence de potentiels de jonction excitateurs dans la cellule musculaire. Voici un résultat représentatif montrant un potentiel de jonction excitateur provoqué par de brèves impulsions lumineuses. L'amplitude du potentiel de jonction excitateur illustrée ici correspond à l'amplitude sommée de deux motoneurones, tous deux connus pour atter. M six. Des intensités plus faibles ou des durées d'éclairement plus courtes peuvent révéler le potentiel jonctionnel excitateur de moindre amplitude provenant d'un seul motoneurone. Nous venons de vous montrer comment réaliser une stimulation, en l'absence de canal sodique, de potentiels synaptiques au niveau de la jonction neuromusculaire de l'oph.Lors de cette procédure, il est important de ne pas endommager la paroi corporelle de la préparation pendant la dissection. Il est également essentiel de garder à l'esprit que, bien qu'une préparation puisse être trop excitée juste après la dissection, elle se calmera avec le temps et permettra d'obtenir de bons enregistrements. Lors de l'impalation des muscles, faites attention à ne pas pénétrer au-delà de la première couche musculaire et dans la paroi corporelle.Lorsque votre électrode est insérée dans la paroi corporelle, vous pouvez parfois obtenir des potentiels hyperpolarisés sans toutefois être à l'intérieur d'une cellule musculaire. Voilà tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

channelrhodopsin2-mediated-stimulation-synaptic-potentials-at

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nous décrivons ici les méthodes électrophysiologiques pour mesurer la transmission synaptique à la jonction neuromusculaire de larve de drosophile. Libération évoquée est initiée artificiellement par la stimulation des axones des neurones moteurs et la transmission à travers la JNM peut être mesurée par la réponse postsynaptique évoquée dans le muscle.

Méthodes électrophysiologiques pour l&#39;enregistrement du potentiel synaptique de la JNM des larves de drosophile

Cette vidéo montre la technique d'enregistrement des courants synaptiques à partir d'un bouton synaptique à la jonction neuromusculaire de la larve de drosophile. Cette technique permet de surveiller l’activité d’un seul bouton synaptique, ce qui est important pour l’étude des lignées de mouches mutantes avec une activité synaptique spontanée ou asynchrone accrue.

Enregistrement des courants synaptiques à la jonction neuromusculaire larvaire de la drosophile

Nous décrivons ici un protocole de manipulation optogenetic d'activité des motoneurones, tout en surveillant les changements dans la production automobile (contraction musculaire) en...

Optogenetic Perturbation de l&#39;activité neuronale avec illumination laser à semi-intactes<em&gt; Drosophila</em&gt; Les larves in Motion

Des microélectrodes tranchantes permettent une caractérisation électrophysiologique précise des photorécepteurs et de la sortie d’interneurones visuels chez la drosophile vivante. Nous montrons ici comment utiliser cette méthode pour enregistrer les réponses en tension de haute qualité de cellules individuelles à une stimulation lumineuse contrôlée. Cette méthode est idéale pour étudier le traitement de l’information neuronale dans les yeux composés d’insectes.

Méthode électrophysiologique de réponses d&#39;enregistrement intracellulaire tension de<em&gt; Drosophila</em&gt; Photorécepteurs et Interneurones à Light Stimuli<em&gt; In Vivo</em

Les enregistrements de cellules entières des photorécepteurs de Drosophila melanogaster permettent de mesurer des bosses sombres spontanées, des bosses quantiques, des réponses macroscopiques à la lumière et des relations courant-tension dans diverses conditions. En combinaison avec des outils de manipulation génétique de D. melanogaster, cette méthode permet d’étudier la voie de signalisation inositol-lipidique ubiquitaire et sa cible, le canal TRP.

Méthode électrophysiologique pour les enregistrements de la pince à tension intégrale à partir de<em&gt; Drosophila</em&gt; Photorécepteurs

Courants synaptiques sont enregistrables circonscrits de visualisé boutons synaptiques à la jonction neuromusculaire Drosophila troisième stade larvaire des larves. Cette technique permet la surveillance de l’activité d’un seul bouton synaptique.

Focal Macropatch enregistrements de courants synaptiques de la jonction neuromusculaire larves de drosophile

Cet article propose une méthode pour tester les connexions monosynaptiques entre neurones en employant la tétrodotoxine et canal sodique résistant à la tétrodotoxine, NaChBac.

Examinant les connexions monosynaptiques chez la drosophile en utilisant des canaux sodiques tétrodotoxine résistant

Les vésicules synaptiques (SV) le vélo est le mécanisme central de la communication intercellulaire au niveau des synapses neuronales. Libération et l’absorption de teinture de FM sont les principaux moyens de dosage quantitatif SV endo - et l’exocytose. Nous comparons ici, toutes les méthodes de stimulation pour conduire FM1-43 cyclisme synaptique jonction neuromusculaire (NMJ) modèle drosophile .

FM colorant cyclisme au niveau de la Synapse : en comparant la dépolarisation élevés de Potassium, électrique et Stimulation de la Channelrhodopsin

La cartographie de circuit assistée par la chaînerhodopsine (CRACM) est une technique de précision pour la cartographie fonctionnelle des projections neuronales à longue portée entre les groupes anatomiques et/ou génétiquement identifiés des neurones. Ici, nous décrivons comment utiliser CRACM pour cartographier les connexions auditives du tronc cérébral, y compris l’utilisation d’une opsine rouge décalée, ChrimsonR.

Cartographie à long terme de circuit assisté e de Channelrhodopsine des neurones colliculus inférieurs avec des Channelrhodopsins bleus et rouges

Nous présentons un protocole pour caractériser électrophysiologiquement les photopigments bi-stables : (i) exploiter les déplacements de charge au sein des molécules de photopigment suite à l’absorption des photons et leur énorme quantité dans les photorécepteurs, et (ii) exploiter les différences de spectres d’absorption des états photopigment rhodopsine et métarhodopsine. Ces protocoles sont utiles pour dépister les mutations affectant les systèmes de photopigments stables.

Méthodes électrophysiologiques pour mesurer les niveaux de photopigment dans les photorécepteurs de la drosophile

Ce protocole évalue l’activité synaptique fonctionnelle entre partenaires neuronaux définis in vivo dans le système nerveux central des larves de Drosophila melanogaster à l’aide d’outils génétiquement codés. La stimulation optogénétique médiée par CsChrimson des neurones sensoriels présynaptiques cIVda induit la photoconversion dépendante du calcium de CaMPARI dans les interneurones postsynaptiques du Bassin-4.

Caractérisation fonctionnelle des partenaires pré- et postsynaptiques individuels dans le système nerveux central larvaire de Drosophila à l’aide de CaMPARI

Découvrez une méthode de stimulation optogénétique par channelrhodopsine2 pour étudier la physiologie synaptique aux jonctions neuromusculaires de larves de Drosophila. Cette technique offre une alternative simple et économique.

Channelrhodopsin2 stimulation médiée potentiels synaptiques au Drosophile Jonctions neuromusculaires

Explorer plus de vidéos