Channelrhodopsin2 stimulation médiée potentiels synaptiques au Drosophile Jonctions neuromusculaires

Cette procédure commence par la croissance de la drosophile. Troisièmement, des asticots du stade avec le génotype approprié sur les aliments contenant tout le transrétinol. Chaque asticot est épinglé tête et queue.

Puis FLA plat. Le cerveau et les nerfs postérieurs sont ensuite coupés pour arrêter l’activité motrice rythmique. Ensuite, la source lumineuse LED bleue avec boîtier de commande est ajustée et concentrée sur la préparation.

Enfin, utilisez une électrode pointue pour empaler le muscle six. Délivrez ensuite des impulsions lumineuses avec une source de tension. Bonjour, je m’appelle Nicholas Marstein et je travaille dans le laboratoire de Leslie Griffith, au Département de biologie de l’Université Brandeis.

Bonjour, je m’appelle Stefan Pulver et je travaille également au Griffith Lab. Aujourd’hui, nous allons vous montrer la procédure d’évocation des potentiels synaptiques avec racine de canal absente deux à la jonction neuromusculaire de la larve de drosophile. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la physiologie synaptique et la drosophile.

Nous l’utilisons également pour enseigner aux étudiants la physiologie synaptique et les laboratoires d’enseignement. Alors commençons. Pour commencer avec ce protocole, maintenez le canal UAS rouges en deux et d’accord, 3 7, 1 gal quatre lignes de mouche dans des bouteilles séparées contenant des supports anti-mouches standard.

Collectez des vierges parmi les, d’accord, 3 7, 1 gal, quatre lignes de mouche et des mâles du canal UAS redsin. Deux lignes. Ensuite, préparez un média anti-mouches mélangé avec un millimolaire, tout le trans rétinol ou un TR.To faites fondre un média anti-mouches ordinaire au micro-ondes pendant environ une minute.

Une fois fondu, laissez le média refroidir pendant environ 30 à 60 secondes, puis ajoutez 100 microlitres de 100 millimolaires de TR dans 100 % d’éthanol pour 10 millilitres de média anti-mouches. Lorsque les flacons contenant un milieu TR sont prêts, placez les mâles et les femelles collectés dans chaque flacon. Placez les flacons dans un endroit sombre à 22 à 25 degrés Celsius pour permettre aux mouches de s’accoupler et de pondre des œufs, attendez quatre à cinq jours jusqu’à ce que la troisième larve étoilée soit visible.

À ce stade, vous pouvez vous débarrasser des mouches adultes. Nous sommes maintenant prêts à procéder à la mise en place du banc d’électrophysiologie. Fixez n’importe quel oculaire de lunette de dissection à une source de lumière LED bleue avec un dissipateur thermique.

À l’aide d’un poteau et d’une pince, fixez une base magnétique à l’oculaire et à la source lumineuse LED. Placez la base magnétique sur la table d’air du dispositif d’électrophysiologie. Ensuite, connectez la source lumineuse à un circuit de commande, puis connectez le circuit de commande à une source de tension externe.

Nous utilisons la tension de sortie du système d’acquisition de données d’électrophysiologie du laboratoire de puissance réalisé par ad instruments. Une fois connecté à la source de tension, donnez une à cinq impulsions volts au circuit de commande afin d’activer la lumière bleue, ajustez la base magnétique et la source lumineuse jusqu’à ce que le faisceau de lumière bleue soit focalisé sur la zone à occuper par la dissection larvaire. Après avoir effectué les ajustements appropriés, nous sommes prêts à passer à la dissection larvaire.

Pour commencer la dissection, placez six broches de 0,1 millimètre dans le sol d’une parabole tapissée de sogar. Retirez un tiers de larves étoilées du milieu alimentaire et placez-le dans une boîte de Pétri en plastique. Rincez les larves avec une solution saline pour enlever toute nourriture qui est attachée aux larves.

Ensuite, placez les larves dans le plat de dissection près des broches tirées et remplissez le plat à moitié de solution saline. Orientez maintenant les larves de manière à ce que vous puissiez voir deux tubes argentés qui courent le long de la surface dorsale de l’animal. Ces tubes argentés sont la trachée.

Insérez une grande goupille directement dans la queue entre les tubes trachéaux. Maintenez les larves vers le bas et placez une deuxième grande épingle dans leur tête. Assurez-vous d’étirer le corps dans le sens de la longueur lorsque la goupille est insérée.

Utilisez des ciseaux pour faire une petite incision près de la queue. Continuez l’incision sur toute la longueur du corps. Assurez-vous que les pointes des ciseaux sont levées pour éviter de couper les nerfs ventraux et/ou les muscles de la paroi corporelle.

Placez quatre épingles aux quatre coins des animaux. Ouvrez maintenant la section médiane. Placez les épingles dans le plat de dissection de manière à fileter l’animal.

Épinglez également la préparation de manière à ce qu’elle soit enseignée à l’aide de pinces et de ciseaux. Retirez l’animal, les organes digestifs, la trachée et les corps adipeux. Rincez le préparation avec une solution saline.

Après le rinçage, localisez les lobes frontaux et le ganglion ventral de la préparation à l’aide de micro-ciseaux. Coupez soigneusement le ganglion ventral juste derrière les lobes frontaux. Une fois la dissection terminée, procédez à la stimulation par la lumière bleue et à l’enregistrement musculaire.

Pour effectuer l’enregistrement musculaire, tirez une électrode de résistance de 10 à 20 méga ohms. À l’aide d’un extracteur d’électrode électronique, remplissez l’électrode tirée avec trois molaires de KCL. Placez l’électrode remplie dans le porte-électrode.

Placez maintenant la préparation larvaire sous un microscope de dissection sur la plate-forme. Ajustez la lumière bleue de sorte que la préparation disséquée soit centrée dans le faisceau lumineux. Identifiez le muscle six ou M six dans n’importe quel segment de la paroi corporelle de la larve à l’aide d’un micromanipulateur, insérez soigneusement l’électrode dans M six et surveillez l’hyperpolarisation musculaire rapide.

Les potentiels de membrane au repos doivent être compris entre moins 30 millivolts et moins 70 millivolts. Une fois l’électrode correctement insérée, donnez des impulsions de tension de 20 à 100 millisecondes au circuit de commande. Augmentez progressivement la tension fournie au circuit de commande.

Surveillez les potentiels de jonction exci dans la cellule musculaire. Voici un résultat représentatif qui montre un potentiel de jonction exci évoqué par de courtes impulsions lumineuses. L’amplitude potentielle de jonction exci montrée ici est l’amplitude additionnée de deux motoneurones qui sont tous deux connus pour manger.

M six. Des intensités plus faibles ou des durées de lumière plus courtes peuvent exposer le potentiel de jonction excitatrice de plus petite amplitude d’un seul motoneurone. Nous venons de vous montrer comment effectuer une stimulation médiée des potentiels synaptiques à la jonction neuromusculaire oph.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de ne pas endommager la paroi corporelle de la préparation lors de la dissection. Il est également important de se rappeler que même si une préparation peut être surexcitée juste après une dissection, elle se calmera avec le temps et permettra de bons enregistrements. Lorsque vous empalez des muscles, veillez à ne pas descendre sous la première couche de muscles dans la paroi corporelle.

Lorsque votre électrode est coincée dans la paroi du corps. Vous pouvez parfois obtenir des potentiels hyperpolarisés mais ne pas être réellement dans une cellule musculaire. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.