Fabrication de constructions myogéniques de l'ingénierie tissulaire

Cette procédure commence par la récolte de tissu musculaire squelettique à partir de rats Lewis néonatals. À partir de ce tissu, nous isolons des cellules myoblastes. Ces myoblastes sont cultivés dans des boîtes de culture tissulaire pendant deux jours, puis récoltés et mélangés à un mélange de matrice tissulaire à base de collagène.

Ce mélange est soigneusement pipeté dans un moule immergé dans un milieu de culture et incubé à 37 degrés Celsius. Bonjour, je suis Christina Pesach du laboratoire de Douglas Cowan, du département d'anesthésiologie de l'hôpital pour enfants de Boston et de la faculté de médecine de Harvard. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de créer un tissu ingénierisé myogénique.

Nous utilisons cette procédure pour fabriquer un tissu ingénierisé destiné à être inséré dans le cœur. Notre objectif est d'établir une connexion électrique entre les chambres supérieure et inférieure du cœur, en tant que thérapie alternative à l'implantation d'un stimulateur cardiaque chez les enfants souffrant d'un bloc auriculo-ventriculaire complet. Commençons donc.

Dans le montage, un moule de coulage est utilisé pour donner une forme au dispositif tissulaire à base de collagène destiné à être implanté chirurgicalement. Dans cette vidéo, le processus de création de dispositifs tissulaires conçus contenant des myoblastes squelettiques est décrit dans une vidéo accompagnante. L'implantation cardiaque du tissu cellulaire fabriqué selon ce protocole est démontrée.

Un moule à tissu peut être conçu sous presque n'importe quelle forme ou taille afin de répondre aux exigences physiologiques de tout cœur pour lequel le tissu est destiné. Dans cette démonstration, le moule formera un fragment de tissu qui pourra être découpé de manière à s'insérer dans le sillon auriculo-ventriculaire d'un cœur de rat adulte. Commencez la fabrication du moule en utilisant une lame de rasoir pour couper le tube en silicone en morceaux de trois centimètres de longueur, puis divisez chaque morceau en deux dans le sens de la longueur.

Coupez un petit morceau de treillis en polyester. Ensuite, déposez une goutte d'adhésif en silicone RTV de qualité implantable à l'intérieur de l'extrémité du tube. Essayez de minimiser la quantité d'adhésif déposée, car elle est quelque peu toxique pour les cellules cultivées.

Placez rapidement un petit morceau de treillis en polyester sur la goutte d'adhésif au silicone et alignez-le avec l'extrémité du tube. Cela fournira une surface légèrement surélevée et plane pour la fixation du montage. Répétez le processus pour l'autre extrémité du tube.

Laisser le moule sécher à température ambiante pendant trois jours. Il est utile de fabriquer 20 à 30 moules à la fois, car ceux-ci sont essentiellement jetables. Une fois que l'adhésif est complètement sec, afin d'aider à stériliser les moules, les conserver dans un récipient rempli d'éthanol à 70 % jusqu'à ce qu'ils soient nécessaires, après avoir préparé les moules.

Ensuite, déterminez si toutes les solutions requises sont également prêtes à l'emploi pour la préparation de l'isolement cellulaire. Préparez une solution de laminine diluée composée d'un milligramme de laminine dans 250 millilitres de PBS filtré stérile de 0,2 micron contenant des antibiotiques et un fongicide.

Ensuite, recouvrir des plaques de culture de tissus de 150 millimètres avec quatre millilitres de la solution de laminine diluée et les incuber à 37 degrés Celsius pendant au moins quatre heures avant utilisation. Deux autres solutions doivent également être préparées : le milieu pour myoblastes et la solution de digestion du muscle squelettique.

Se référer à la partie textuelle du protocole pour leurs formulations. Filtrer. Stériliser le tampon de digestion en utilisant un disque filtrant de 0,2 micron fixé sur une seringue de 10 millilitres. Des aliquotes du tampon de digestion peuvent être conservées à moins 20 degrés Celsius.

Estimez que vous aurez besoin de cinq millilitres de tampon de digestion par portée de rat Lewis. Incubez la quantité requise de tampon de digestion des tissus, ainsi que 10 millilitres de milieu pour myoblastes, à 37 degrés Celsius. Puis procédez à la dissection des rats nouveau-nés.

Tout d'abord, obtenir au moins une portée de rats Lewis néonatals sacrifiés à l'aide de pinces et de petites ciseaux. Retirer les muscles paravertébraux des rats Lewis néonatals décédés en incisant le dos le long de la moelle épinière, en écartant les couches cutanée et fasciale, puis en excisant les muscles. Placer les muscles excisés dans un tube conique de 50 millilitres rempli de 40 millilitres de H-B-S-S 1 X sur de la glace.

Laisser les bandes musculaires se déposer au fond du tube et retirer soigneusement la majeure partie du liquide et des résidus sanguins par aspiration sous vide à l’aide d’une pipette Pasteur stérile dans une culture. Ensuite, verser les fragments musculaires récoltés dans une boîte de culture de 150 millimètres et aspirer autant que possible le liquide restant. À l’aide de deux lames de rasoir à bord unique, hacher le tissu jusqu’à obtenir une pâte épaisse.

La pâte musculaire sera digérée dans une solution de digestion préalablement réchauffée. Versez une partie de la solution de digestion sur la pâte musculaire et transférez le mélange de solution et de pâte musculaire dans un nouveau tube de 50 millilitres. À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, généralement adaptée à une digestion efficace des muscles provenant de trois litres de rats Lewis, nous utilisons entre 10 et 15 millilitres de solution.

Placer le tube sur une plateforme agitée et digérer à 37 degrés Celsius pendant environ 30 minutes. Pendant la digestion enzymatique, le tissu est agité occasionnellement sans formation de bulles. À l’aide d’une pipette de 10 millilitres fixée à une pipette sans fil.

Une fois le muscle liquéfié, faire passer la solution à travers un tamis cellulaire de 70 microns. Ensuite, centrifuger les cellules filtrées à température ambiante pendant 10 minutes à 600 G, puis à l’aide d’une pipette Pasteur et d’une aspiration, éliminer autant que possible le liquide et resuspendre le culot dans 10 millilitres de milieu chaud pour myoblastes. Pré-ensemencer les cellules dans une plaque de culture tissulaire non revêtue de 150 millimètres pendant 15 minutes afin d’éliminer d’éventuels fibroblastes, car ceux-ci adhèrent plus rapidement que les myoblastes.

Placer la plaque dans un incubateur humidifié réglé à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Retirer la plaque de l'incubateur et transférer les cellules qui ne se sont pas encore fixées vers la culture recouverte de laminine. Les prélever et les diluer dans un milieu pour myoblastes afin d'obtenir une plaque pour chaque raton, ou deux.

Si les cellules sont ensemencées trop denses, elles se différencieront en tubes myo. Enfin, laissez les cellules croître dans un environnement humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Après un à deux jours d'incubation, les cellules seront prêtes à être moulées en constructions tissulaires.

Après un à deux jours d'incubation, retirez quatre des plaques de culture tissulaire de myoblastes de 150 millimètres de l'incubateur. N'attendez pas plus de 48 heures, sinon les fibroblastes submergeront la population de myoblastes. Aspirez le milieu des cellules.

Ensuite, rincer les cellules deux fois avec un XPBS préchauffé à 37 degrés Celsius pour détacher les myoblastes de la plaque, puis ajouter quatre millilitres de solution d’EDTA 0,05 % préchauffée par plaque et replacer les plaques dans l’incubateur pendant cinq minutes. Récolter les myoblastes sous hotte de culture et recueillir le liquide dans un tube de 50 millilitres. Utiliser 10 millilitres de milieu pour myoblastes pour rincer toutes les plaques et combiner ce liquide avec les cellules dans le tube de centrifugation.

Centrifuger les cellules à température ambiante pendant 10 minutes à 600 ×g et aspirer autant que possible l'excès de liquide. Resuspendre ensuite les myoblastes dans 1,4 millilitre de milieu pour myoblastes et les placer sur de la glace. À l’aide de pinces, retirer délicatement un moule de construction du bain d’éthanol et le rincer deux fois par immersion dans du PBS 1X. Aspirer toutes les traces de PBS à l’aide d’une pipette Pasteur avant de placer le moule dans un puits vide d’une plaque de culture tissulaire à six puits.

À ce stade, une solution doit être préparée. Prélevez les réactifs suivants sur de la glace : 10 x hams F 10 zones de champignons pénicilline streptomycine.

Des cellules de collagène de type I remises en suspension dans du milieu pour myoblastes, du bicarbonate de sodium et du gel. Associez les réactifs selon le protocole écrit. Vortexez une vingtaine de secondes jusqu'à ce que le mélange devienne rose.

Remarquez que les différentes variétés de collagène de type I disponibles commercialement ont un effet variable sur le mélange, la solidification et la consistance. Dans le produit final, remettez le tube dans le seau à glace pendant quelques minutes afin d'éliminer les bulles de la solution.

Le collagène de type I ne doit pas être irradié, sinon il ne gélifiera pas. Ici, nous utilisons un produit dérivé de la peau de poisson. Avant que le mélange ne durcisse, versez soigneusement le mélange dans le moule placé dans la plaque de culture.

Chaque moule contiendra environ un millilitre du liquide visqueux. Essayez d'éviter d'introduire des bulles d'air pendant cette procédure. Transférez soigneusement la plaque contenant les moules de construction dans l'incubateur à 37 degrés Celsius.

À mesure que le mélange se solidifie, sa couleur passe d'un rose foncé à un rose clair, tandis que le moule durcit. Réchauffez un peu de milieu pour myoblastes à 37 degrés Celsius. Après environ une demi-heure d'incubation, immergez délicatement chaque construct tissulaire dans le milieu pour myoblastes préchauffé et remettez la plaque dans l'incubateur. Lorsque ce protocole est correctement exécuté, le construct tissulaire contenant des myoblastes est prêt à être implanté in vivo ou à subir des analyses supplémentaires.

Après deux jours d'incubation, nous venons de vous montrer comment fabriquer un construct tissulaire ingénierisé myogénique. Lors de cette procédure, il est important de garder tous les réactifs nécessaires à la solution du construct au frais sur de la glace afin d'éviter une solidification prématurée. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.