Name: Cartographie optique des coeurs de rats perfusés de Langendorff (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-11T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Découvrez la cartographie optique des cœurs de rats perfusés de Langendorff avec le colorant di-8-ANEPPS. Cette technique haute résolution permet d'étudier l'activité électrique cardiaque et la propagation des potentiels d'action en temps réel.

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Ce travail est soutenu par des subventions de recherche du National Institutes of Health (HL068915; HL088206) et les contributions au Fonds de la conduction cardiaque au Centre hospitalier pour enfants de Boston.

Partie 1: Préparer les solutions et le système coeur isolé perfusé <ol><li> Le matin de l'expérience, L 4,0 de Krebs-Henseleit solution est préparée comme décrit précédemment [5, 6]. </li><li> 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime (BDM) est dissous dans 1,0 L de Krebs-Henseleit solution décantée du perfusat préparé à l'étape 1.1. </li><li> Un montant supplémentaire de 150 ml de Krebs-Henseleit est retiré de la perfusat préparé à l'étape 1.1 et mélangé avec 5 mol / L di-8-ANEPPS (dilué à partir d'un 10 mmol / L des stocks dissous dans le diméthylsulfoxyde (DMSO)). </li><li> Ces trois solutions sont transférés à chemise d'eau en verre réservoirs (Radnoti) où ils sont pré-chauffé à 41,0 ° C et oxygéné avec un bulleur submergé (Radnoti) à l'aide de 0,2 um-filtrée à 95% d'O 2; 5% de CO 2 gazeux. Solutions à partir des 3 réservoirs de stock sont pompés vers le système mural de Langendorff avec Masterflex ™ L / S pompes péristaltiques et de faible absorption de tube en silicone (Cole-Parmer). </li><li> Avant le montage, le système de Langendorff verrerie (Radnoti) est méticuleusement lavées avec E-TOXA-CLEAN réactif (Sigma-Aldrich) et rincés à fond avec 0,1 M / L HCl, 100% d'éthanol et d'eau distillée. </li><li> L'appareil de Langendorff sans recirculation a été construit pour fournir 70 mm Hg à pression constante de 3 réservoirs séparés oxygénée, qui sont séparés du cœur avec les serpentins de chauffage à chemise d'eau et les pièges à bulles (Radnoti) [7]. Les trois lignes de perfusion indépendantes convergent au-dessus du coeur à deux robinets à 3 voies, nous permettant de contrôler précisément la livraison des solutions préparées dans les étapes 1.1 à 1.3. Chemise d'eau verrerie est connecté en série avec tube MASTERFLEX BPT PharMed (Cole-Parmer) et chauffé à 39 ° C avec de l'eau distillée en utilisant deux circulateurs E100 (Lauda). La perte de chaleur par le tube de silicone traité au platine (Cole-Parmer) qui relie les réservoirs à pression tête pour les serpentins de chauffage et de pièges à bulles abouti à un 37 ° C perfusat d'atteindre le coeur. </li></ol> Partie 2: Récolte du coeur de rat et de mettre en place une perfusion de Langendorff <ol><li> Pour provoquer une profonde anesthésie générale dans 200 à 250 g chez le rat Lewis, 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine est injecté dans la cavité péritonéale. A ce mélange, on ajoute 500 U / kg d'héparine pour éviter la coagulation du sang et l'ischémie myocardique durant la procédure d'explantation. </li><li> Pour un accès facile vers le cœur et gros vaisseaux, la paroi thoracique antérieure est retirée. Après cela, les tissus environnants est soigneusement disséquée et le sac péricardique ouvert. </li><li> Après identification de la veine cave inférieure, ce navire est ligaturé avec de la soie 5-0 (Ethicon) et de l'ensemble cœur-poumon bloc est explanté. Tissulaire est immédiatement placé dans glacée de Krebs-Henseleit solution contenue dans un bécher de 50 ml sur la glace. </li><li> L'aorte ascendante est rapidement identifié et disséqué par les tissus environnants. Une taille appropriée canule (Harvard Apparatus) est inséré dans l'aorte, en prenant soin d'éviter d'interrompre la perfusion obligatoire des artères coronaires en insérant la canule trop loin dans la racine aortique. La canule est fixée au aorte ascendante avec de la soie 5-0 (Ethicon). </li><li> Le coeur de rat est alors placé sur l'appareil de Langendorff sans introduire de bulles d'air dans la canule. Rétrograde perfusion coronaire vasculaire est désormais établi avec la chaleur, oxygénée de Krebs-Henseleit solution à partir de la pression de tête décrite à l'étape 1.6. </li><li> Tissulaire supplémentaire, y compris les poumons, est désormais supprimé et le coeur est perfusé pendant 20 minutes afin de permettre la récupération de la fonction et à stabiliser le rythme. Pendant ce temps, une sonde de température très mince thermocouple (Cole-Parmer) est introduit dans la cavité ventriculaire gauche et suturé en place avec 5-0 Prolène suture (Ethicon). La sonde est reliée à un thermo-régulateur (Digi-Sense) pour s'assurer que la température du cœur est maintenue à 37 ° C en ajustant les paramètres de la pompe de circulation d'eau. Motion à partir perfusat dégoulinant de l'apex cardiaque est minimisé en plaçant un morceau de gaze dans le récipient d'effluents. </li></ol> Partie 3: coeur de charge avec un colorant potentiométrique et d'acquérir des signaux électroencéphalographiques et optiques <ol><li> Di-8-ANEPPS (Invitrogen) est chargé dans le cœur par le passage à la ligne de perfusion contenant le mélange de Krebs-Henseleit avec le colorant fluorescent à l'aide d'un robinet. De plus, une canule 18G est placé dans l'oreillette gauche et / ou à droite et 50 ml supplémentaires de solution de colorant est lentement administré dans chacune de ces chambres, car ils ne sont pas suffisamment perfusé avec un colorant introduit dans les artères coronaires. </li><li> Pendant la procédure de chargement, 3 dérivations (Harvard Apparatus) sont délicatement placés sur la surface du cœur qui n'est pas face à l'optique utilisée pour la cartographie. Electrode n o 1 est positionné sur la partie postérieure apicale du ventricule gauche, n o 2 sur l'oreillette gauche, et N <su> p&gt; o 3 comme une électrode de référence sur la racine aortique (figure 1). Les signaux auriculaires et ventriculaires électrographique sont ensuite amplifiés, numérisés et affichés à côté des signaux optiques en utilisant le logiciel (redshirt Imaging) (figure 2). Un oscilloscope (Tektronix TDS modèle 1002) est également utilisée pour visualiser l'ECG de surface s en temps réel et d'assurer une stimulation adéquate. </su></li><li> ECG amplificateur (Hugo Sachs Elektronik) paramètres: Filtre passe-haut: 0,1 Hz Filtre passe-bas: 150 Hz </li><li> La caméra CMOS (redshirt Imaging) et macroscope est positionné en utilisant les réglages XYZ afin que la surface du cœur est au point et centré dans le cadre d'acquisition. La caméra et l'optique sont montés sur une table anti-vibrations (Minus K Technology) afin de minimiser les fréquences de résonance. Dans le même temps, la stimulation d'une électrode coaxiale (Harvard Apparatus) contrôlé par un cas isolé, S48-stimulation électrique unitaire (herbe), est placé sur l'oreillette droite et le cœur est au rythme de 300 battements par minute (figure 1). </li><li> Stimulation électrique (Grass) paramètres: Tarif: 5 impulsions par seconde Délai: 0,2 ms Durée: 2 ms Volts: 6-12 V Mode: Répéter Pulse: Simple </li><li> Pour les enregistrements optiques qui manquent les artefacts de mouvement de la contraction, le cœur doit être découplée électromécanique. Nous faisons cela en commutation à nouveau les lignes de perfusion de Krebs-Henseleit solution qui contient 11 mmol / L BDM. Entre les acquisitions, le coeur est perfusé avec inaltérée de Krebs-Henseleit pour aider à préserver la viabilité de la préparation. </li><li> Les paramètres d'enregistrement sont fixés à l'aide du logiciel (imagerie redshirt) avec les paramètres d'acquisition suivants: Configuration: 2000 Hz; 128x128 matrice de pixels Intervalle de trame: 0,5 ms Gain Amplificateur Appareil photo: 5x On-Chip Gain: 8x-12m ² bien- Obturateur: 500 ms de retard Nombre de cadres: 4000 Durée: 2000 ms </li><li> Toutes les lumières de la pièce et les équipements sont hors tension ou blindés pour éliminer le bruit de fond pendant l'enregistrement. La lumière s'allume au coeur uniquement pendant l'enregistrement optique de réduire la photo-blanchiment et la toxicité de teinture. L'obturateur source de lumière est contrôlée avec une impulsion de 5 V livré via le panneau de contrôle au moyen d'un D-à-Un conseil à l'ordinateur (imagerie redshirt). </li></ol> Partie 4: Analyser les informations d'acquisition à l'aide du logiciel d'imagerie redshirt <ol><li> Suite à l'acquisition, les données sont traitées en utilisant différents paramètres de filtre. Nous utilisons généralement les paramètres par défaut sauf si l'ajustement de la bande d'arrêt / filtre passe, qui est fixé avec la limite à gauche à 44,0 et la limite à droite à 98,0. Plus tard, les informations enregistrées sont traitées et un film est généré (imagerie redshirt). </li><li> Les données provenant d'une acquisition correspond à l'activation locale électrique à 16 384 sites sur la surface du coeur sur une période de 2 secondes. Le logiciel permet à ces signaux locaux d'être directement comparés entre eux et avec les enregistrements électroencéphalographiques auriculaire et ventriculaire. Les données sont ensuite visualisées par une cartographie locale activation électrique de la couleur et le rendu cette information comme une animation montrant l'activation spatio-temporelle électrique sur la surface cardiaque. Pour créer une telle animation, nous utilisons le logiciel pour: <ul><li> temporellement et / ou filtrer les données spatialement </li><li> Sélectionnez une heure de début et de fin pour l'animation </li><li> signaux optiques carte de la couleur selon l'intensité lumineuse de chaque pixel de repos </li><li> superposer les données couleur résultante avec une image du cœur </li><li> générer l'animation </li></ul></li></ol> Partie 5: Les résultats représentatifs Si la préparation du cœur perfusé était immobile pendant l'enregistrement, les signaux optiques montrent un pic distinct pour chaque pixel impliqués dans un changement de l'intensité des émissions de di-8-ANEPPS. Les films correspondants (Figures 3 et 4) montrent un front d'onde d'excitation se propager sur toute la surface épicardique du cœur ainsi que les enregistrements électroencéphalographiques acquises simultanément (Figure 2). <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure3.jpg" alt="Schéma de configuration cardiaque de Langendorff pour l’étude de la stimulation cardiaque, mettant en évidence les composants numérotés." data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Une photographie d'une préparation de Langendorff perfusé coeur illustrant les positions de l'électrode de stimulation sur l'oreillette droite et l'ECG conduit comme décrit dans l'étape 3.2. <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure4thumb.jpg" alt="Schéma de processus biologique avec signaux ; Analyse des données des résultats de la microscopie à fluorescence." border="0" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Représentant des signaux optiques et des enregistrements électroencéphalographiques d'un coeur de rat perfusé Lewis. Le panneau A montre une image de la surface épicardique utilisés pour l'imagerie optique. La position des pixels choisis pour démontrer les changements dans l'émission de fluorescence au cours du temps dans le groupe B sont indiquées par des flèches colorées. Signaux électroencéphalographiques sont présentés dans le Panneau de C avec la ligne rouge indiquant l'activation auriculaire et la ligne de lumière bleue qui correspond au signal ventriculaire. S'il vous plaîtve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "&gt; cliquez ici pour voir une version agrandie de cette figure.

<ol><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li>
<li>Hucker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+in+cardiovascular+medicine.+Optical+mapping+of+the+human+atrioventricular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction.</a> Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).</li>
<li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).</li>
<li>Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+electrical+activity+in+cardiac+cells+using+an+all-solid-state+system%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).</li>
<li>Stamm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+endotoxin-induced+alterations+in+myocardial+calcium+handling%3A+obligatory+role+of+cardiac+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha.</a> Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).</li>
<li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+conduction+through+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li>
<li>Skrzypiec-Spring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li>
<li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li>
</ol>

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation à l&#39;Hôpital pour enfants de Boston.

L&#39;ablation du cœur de rats anesthésiés doivent être effectués rapidement pour éviter une ischémie myocardique. Si la perfusion d&#39;ischémie coronarienne ou insuffisance se produit, le coeur se développeront probablement des arythmies et peut devenir un infarctus. En outre, ces coeurs montrera insuffisante émission de fluorescence pour les enregistrements informatifs et des analyses ultérieures. Avant de charger le colorant, les cellules du myocarde doivent être adéquatement perfusés avec une solution de Krebs-Hens...

<table><tbody><tr><td>CardioCMOS-SM128f</td><td>Équipement</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel CardioPlex</td><td>Équipement</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Source lumineuse LED LUXEON 460-490 nm </td><td>Équipement</td><td>Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA</td><td>LXHL-PB02</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur ECG Type 689 Hugo Sachs Elektronik</td><td>Équipement</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730149</td><td></td></tr><tr><td>Miroir dichroïque 505 nm</td><td>Équipement</td><td>Semrock</td><td>FF505-SDi01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtre d'émission passe-haut 605 nm</td><td>Équipement</td><td>SciMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THT Sideways</td><td>Équipement</td><td>SciMedia</td><td>25 BM-8</td><td></td></tr><tr><td>Support à rotule miniature</td><td>Équipement</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0177</td><td></td></tr><tr><td>Jeu d'électrodes de stimulation petites</td><td>Équipement</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0160</td><td></td></tr><tr><td>Plateforme d'isolation des vibrations BM-6 sur table</td><td>Équipement</td><td>Technology Inc., Inglewood, CA 90301</td><td>25 BM-6</td><td></td></tr><tr><td>Électrode ECG monopolaire</td><td>Équipement</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0200</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique SCI 400</td><td>Équipement</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>401U/D1</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique MasterFlex Easy Load II</td><td>Équipement</td><td>Cole-Parmer</td><td>Modèle 77201-60</td><td></td></tr><tr><td>Tuyau Marprene n°14</td><td>Équipement</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>902.0016.016</td><td></td></tr><tr><td>Tuyau MasterFlex</td><td>Équipement</td><td>PharMed, Westlake, OH 44145 USA</td><td>06485-25</td><td></td></tr><tr><td>Stimulateur à impulsions carrées S48</td><td>Équipement</td><td>Grass Technologies</td><td>Modèle S48</td><td></td></tr><tr><td>Unité d'isolation transformateur RF SIU5</td><td>Équipement</td><td>Grass Technologies</td><td>Modèle SIU5</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir à double enceinte de 5 litres</td><td>Équipement</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-5</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir à double enceinte de 2 litres</td><td>Équipement</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-2</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir à double enceinte de 0,5 litre</td><td>Équipement</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-0</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir à double enceinte de 0,25 litre</td><td>Équipement</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-025</td><td></td></tr><tr><td>Bobine de chauffage de 10 ml</td><td>Équipement</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>158822</td><td></td></tr><tr><td>Trappe à bulles de compliance</td><td>Équipement</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>Cannule à déconnexion Luer</td><td>Équipement</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-1444</td><td></td></tr><tr><td>Robinet trois voies, FLL vers MLT, sans capuchons de port</td><td>Équipement</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 72-2630</td><td></td></tr><tr><td>Thermomètre à thermocouple</td><td>Équipement</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-91100-40</td><td></td></tr><tr><td>Microsonde flexible Ultra Fine série IT </td><td>Équipement</td><td>PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA</td><td>IT-24P</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope Tektronix TDS 1002</td><td>Équipement</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TDS 1002B</td><td></td></tr><tr><td>Monooxime de 2,3-butanédione </td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de kétamine</td><td>Réactif</td><td>Hospira Inc.</td><td>RL-0065</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Réactif</td><td>Lloyd, Inc.</td><td>LB15705A</td><td></td></tr><tr><td>E-TOXA-CLEAN&amp;#174;</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9029</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>D-3167</td><td></td></tr></tbody></table>

cartographie optique des coeurs de rats perfusés de langendorff

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Cartographie optique de la surface cardiaque avec sensibles au voltage colorants fluorescents est devenu un outil important pour étudier l&#39;excitation électrique dans des modèles expérimentaux qui vont à l&#39;échelle de cultures de cellules d&#39;organes entiers<sup&gt; [1, 2]</sup&gt;. Utiliser l&#39;état de l&#39;art des systèmes d&#39;imagerie optique, la génération et la propagation des potentiels d&#39;action au cours du rythme cardiaque normal ou long initiation et le maintien des arythmies peuvent être visualisées presque instantanément<sup&gt; [1]</sup&gt;. Le dernier disponible dans le commerce de systèmes peuvent fournir des informations à très haute résolution spatio-temporelle et étaient basées sur matériel conçu initialement développé pour surmonter les obstacles imposés par plus conventionnelles des méthodes électrophysiologiques<sup&gt; [1]</sup&gt;. Les progrès de la haute résolution et haute vitesse Complementary metal-oxyde-semiconducteur (CMOS) caméras et intensément-lumineux, les diodes électroluminescentes (LED) ainsi que la tension des colorants sensibles, l&#39;optique, et les filtres ont commencé à faire l&#39;acquisition de signaux électriques pratique pour les biologistes cellulaires cardiovasculaires qui sont plus habitués à travailler avec des microscopes. Bien que la nouvelle génération de caméras CMOS peut acquérir 10 000 images par seconde sur une matrice de pixels 16 384, selon le type de préparation des échantillons, établi de longue date des technologies d&#39;acquisition de fluorescence tels que des barrettes de photodiodes, systèmes laser à balayage, et refroidi à couplage de charge (CCD caméras) ont encore des avantages distincts par rapport à la gamme dynamique, rapport signal-bruit, et l&#39;efficacité quantique<sup&gt; [1, 3]</sup&gt;. Dans la présente étude, des coeurs de rats ont été perfusés Lewis<em&gt; Ex vivo</em&gt; Avec un perfusat cristalloïdes (Krebs-Henseleit solution) à 37 ° C sur un appareil de Langendorff modifié. Après une période de stabilisation de 20 minutes, les cœurs étaient par intermittence perfusés avec 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime pour éliminer la contraction associée mouvement pendant l&#39;acquisition des images. Pour la cartographie optique, nous avons chargé les cœurs avec la sonde à réponse rapide potentiométrique di-8-ANEPPS<sup&gt; [4]</sup&gt; (5 mmol / L) et brièvement illuminé la préparation avec 475 ± 15 nm lumière d&#39;excitation. Lors d&#39;une deuxième période typique 2 de l&#39;éclairage, la lumière&gt; 605 nm émise par la préparation cardiaque a été imagé avec un appareil photo CMOS haute vitesse connecté à un macroscope horizontale. Pour cette démonstration, les cœurs étaient rythme à 300 battements par minute avec une électrode coaxial connecté à une unité de stimulation électrique isolé. Simultanée des enregistrements électroencéphalographiques bipolaires ont été acquises et analysées avec les signaux de tension en utilisant un logiciel facilement disponible. De cette manière, les potentiels d&#39;action sur la surface de coeurs de rats perfusés de Langendorff peut être visualisé et enregistré avec des signaux électroencéphalographiques.

Cet article décrit une technique de haute résolution spatiale et temporelle optiquement l&#39;image mouvement d&#39;action potentielle sur la surface de coeurs de rats perfusés de Langendorff en utilisant un colorant potentiométrique (di-8-ANEPPS).

Cartographie optique des coeurs de rats perfusés de Langendorff

La cartographie optique de la surface cardiaque à l'aide de colorants fluorescents sensibles au voltage est devenue un outil important pour étudier l'excitation électrique dans ...

Bonjour, je suis Yon Ziv du laboratoire du Dr Cohen, du département d'anesthésiologie de l'hôpital pour enfants et de l'école de médecine Howard. Aujourd'hui, nous allons présenter une procédure de cartographie optique sur des cœurs rouges perfusés selon la méthode de Langendorff. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la propagation de l'activité électrique à la surface cardiaque.Commençons donc. Le matin de l'expérience, préparez quatre litres de solution de Krebs Henselight. Après avoir préparé la solution, éliminez les particules non dissoutes à l'aide d'un filtre de 200 microns par filtration sous vide.Commencez par utiliser un litre de la solution Krebs Henzel lite préparée pour dissoudre 11 millimoles de BDM. Ensuite, prenez 100 millilitres supplémentaires de Krebs Henzel lite et mélangez-y 10 millimolaire de D huit NFS dans du DMSO afin d'obtenir une concentration finale de cinq micromoles par litre de D huit annex en solution. Les réservoirs en verre munis d'une double enveloppe d'eau, le barboteur et la verrerie utilisés ici proviennent tous de red.Naughty.Transférez les deux solutions dans les réservoirs préchauffés à 41 degrés Celsius. Oxygenez les solutions avec un gaz filtré de 0,2 micron à l’aide d’un pompe à bulles immergée, puis faites circuler les solutions depuis les trois réservoirs de stock à travers le système mural Ling Endorf à l’aide de pompes péristaltiques et de tubulures en silicone à faible absorption, afin de prélever le cœur de rat. Effectuez d’abord une injection intrapéritonéale chez un rat Lewis de 200 à 250 grammes de kétamine et de xylazine pour induire une anesthésie générale profonde, ainsi qu’une injection d’héparine pour prévenir la coagulation sanguine et l’ischémie myocardique pendant l’ablation.Une fois que le rat est complètement anesthésié et ne réagit plus à une pression sur l'orteil, procédez à l'ablation du cœur. Commencez la chirurgie par l'ablation de la paroi thoracique antérieure afin d'accéder facilement au cœur et aux gros vaisseaux. Ensuite, disséquez soigneusement les tissus environnants et ouvrez la gaine péricardique.Après avoir identifié la veine cave inférieure, ligaturez ce vaisseau avec cinq sutures en proline 0 et éxérèzez l'ensemble bloc cœur-poumon. Placez immédiatement le tissu dans une solution froide de Krebs-Henseleit dans un bécher de 50 millilitres sur de la glace, identifiez rapidement l'aorte ascendante et disséquez-la du tissu environnant. Insérez une canule de taille appropriée dans l'aorte.Veiller à ne pas insérer la canule trop profondément dans la racine aortique afin d'éviter d'interrompre la perfusion obligatoire des artères coronaires. Fixer la canule à l'aorte ascendante. Ensuite, placer le cœur de rat sur l'appareil Ling Endorf sans introduire de bulles d'air dans la canule.La perfusion vasculaire coronaire rétrograde est désormais établie avec la solution chaude et oxygénée de Krebs-Henseleit. À partir du réservoir de pression de l'appareil Ling Endorf, retirez maintenant les tissus supplémentaires, notamment les poumons, après nettoyage, puis perfusez le cœur pendant 20 minutes afin de permettre la récupération de la fonction et la stabilisation du rythme pendant la perfusion cardiaque. Introduisez une sonde de température thermocouple très fine dans la cavité du ventricule gauche.Fixer la sonde en place à l’aide de cinq points de suture en prolène 5-0 et régler les paramètres des pompes de circulation d’eau afin de maintenir la température du cœur à 37 degrés Celsius. Minimiser les mouvements provoqués par la perfusion goutte à goutte provenant de l’apex cardiaque. En plaçant un morceau de gaze dans le récipient de recueil du liquide de sortie, le cœur est désormais prêt à être chargé avec le colorant potentiel métrique afin d’acquérir des signaux électrographiques et optiques, puis d’introduire le colorant potentiel métrique Dye 8 NEPs dans le cœur.Passer à la ligne de perfusion contenant le Krebs, donc un mélange lumineux avec le colorant fluorescent. Étant donné que les oreillettes ne sont pas suffisamment perfusées par le colorant introduit par les artères coronaires, une canule de 18 g est placée dans l’oreillette gauche et/ou droite. Ensuite, une solution de colorant supplémentaire de 50 millilitres est administrée lentement dans chacune de ces chambres.Pendant la procédure de chargement, placez délicatement trois dérivations ECG sur la surface du cœur, celle qui n'est pas orientée vers les optiques utilisées pour la cartographie. La première électrode est positionnée sur la portion postérieure apicale du ventricule gauche.Le second est placé sur l'oreillette gauche et le troisième sert d'électrode de référence sur la racine aortique. Les signaux électrographiques auriculaires et ventriculaires sont ensuite amplifiés, numérisés et affichés sous forme de signaux optiques à l'aide du logiciel. Un oscilloscope est également utilisé pour visualiser en temps réel les ECG de surface et assurer un bon rythme cardiaque.Régler l'amplificateur d'ECG à 0,1 hertz pour le filtre passe-haut et à 150 hertz pour le filtre passe-bas. Positionner la caméra CMOs à l'aide des réglages X, Y, Z. Un morceau de verre placé dans le plan focal de la caméra est disposé à la surface du cœur afin que la zone d'intérêt soit nette et centrée dans le cadre d'acquisition. La caméra et les optiques sont montées sur une table d'isolation vibratoire afin de minimiser les fréquences de résonance.En même temps, placez sur l'oreillette droite une électrode de stimulation coaxiale commandée par un stimulateur électrique isolé S 48. Celle-ci stimulera le cœur à 300 battements par minute ; réglez la stimulation électrique comme suit.La fréquence doit être de cinq impulsions par seconde, avec un délai de 0,2 milliseconde, une durée de stimulation de deux millisecondes, une intensité de six à 12 volts et le mode réglé sur répétition et impulsion unique. Pour les enregistrements optiques ne présentant pas d'artéfacts de mouvement dus à la contraction, il est nécessaire de dissocier électromécaniquement le cœur. Pour ce faire, changez à nouveau les lignes de perfusion vers une solution de Krebs Hensel contenant 11 millimolaire de BDM.Entre les acquisitions, perfuser le cœur avec du milieu de Krebs-Henseleit non modifié afin de préserver la viabilité du prélèvement. Configurer les paramètres d'enregistrement du logiciel à 2000 hertz avec une matrice de 128 × 128 pixels.L'intervalle de trame doit être réglé à 0,5 milliseconde et les gains doivent être fixés à cinq x pour l'amplificateur de la caméra et à huit x pour le gain intégré. Le gain intégré doit également être réglé à 12. Réglez dans le logiciel le contrôle de la caméra sur un délai d'obturation de 500 millisecondes et enregistrez 4 000 trames pendant une durée de 2000 millisecondes.Éteignez ou masquez toutes les lumières de la pièce et de l'équipement afin d'éliminer le bruit de fond pendant l'enregistrement ; la lumière LED illumine le cœur uniquement pendant l'enregistrement optique. Pour réduire le photoblanchiment et la toxicité du colorant, contrôlez l'obturateur de la source lumineuse à l'aide d'une impulsion de cinq volts délivrée via le panneau de commande par l'intermédiaire d'une carte D deux A dans l'ordinateur après l'acquisition. Traitez les données en utilisant différents paramètres de filtre.Les paramètres par défaut sont généralement utilisés, sauf lors du réglage du filtre coupe-bande, qui est configuré avec une limite gauche à 44,0 et une limite droite à 98,0. Ensuite, les informations enregistrées sont traitées afin de générer un film. Les données provenant d'une acquisition correspondent à l'activation électrique locale en 16 384 sites à la surface du cœur sur une période de deux secondes.Le logiciel permet de comparer directement ces signaux locaux entre eux et avec les données d'enregistrement électrographique atrial et ventriculaire en associant l'activation électrique locale à une couleur, puis en affichant cette information sous forme d'une animation montrant l'activation électrique spatiotemporelle à la surface cardiaque. Pour créer une telle animation, commencez par utiliser le logiciel afin de filtrer temporellement ou spatialement les données. Ensuite, sélectionnez un instant de début et un instant de fin pour l'animation.Troisièmement, associer les signaux optiques à des couleurs en fonction de l'intensité lumineuse au repos de chaque pixel. Quatrièmement, superposer les données colorimétriques obtenues à une image du cœur, puis, enfin, générer l'animation si le cœur perfusé était immobile pendant l'enregistrement. Les signaux optiques montrent, en temps réel, un pic distinct pour chaque pixel impliqué dans un changement de l'intensité d'émission de la D huit anep. Ces vidéos d'imagerie en temps réel illustrent un front d'excitation se propageant à la surface de l'épicarde cardiaque, ainsi que les enregistrements électrographiques simultanément acquis.Nous venons de démontrer une technique haute résolution permettant d'obtenir par imagerie optique la propagation du potentiel d'action à la surface du cœur rouge Alanor Perfuse. Lors de cette procédure, il est essentiel de retirer rapidement le cœur du rouge anesthésié. Afin d'éviter l'ischémie myocardique, les cellules myocardiques doivent être correctement perfusées et le cœur doit être entièrement chargé avec un colorant sensible à l'eau.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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