Imagerie en temps réel du noyau dense de vésicules cultures primaires neurones de l'hippocampe

L'imagerie de cellules vivantes est particulièrement utile lors de l'étude de la dynamique du trafic organellaire. Cette vidéo mettra en évidence une procédure utilisée pour imager les vésicules à noyau dense dans des neurones hippocampiques en culture. Des complexes de transfection sont d'abord obtenus en mélangeant le milieu D-N-A-M-E-M et le réactif de transfection lipectomie.

Étant donné que les neurones hippocampiques sont cultivés sur des lamelles inversées face à une monocouche gliale, ces lamelles doivent être retournées afin d'exposer les cellules au réactif de transfection. Après avoir laissé un temps suffisant pour l'expression des protéines des vésicules à noyau dense marquées par la GFP, une chambre d'imagerie est montée. L'observation des ICAL à noyau dense dans des neurones en culture peut être réalisée par microscopie à fluorescence en champ large.

Ce protocole est souple et peut être adapté pour visualiser d'autres organites tels que les mitochondries, les endosomes et les peroxysomes. Bonjour, je suis Michael Silverman et bienvenue dans mon laboratoire de neurosciences cellulaires à l'Université Simon Fraser. Nous nous intéressons à la manière dont les organites se déplacent dans les cellules nerveuses.

Pour aborder cette question, nous marquons les organites membranaires, en particulier les vésicules à noyau dense dans des neurones hippocampiques en culture. Et pour vous montrer comment nous procédons, je vais laisser la parole à David. Bonjour, je suis David du laboratoire Silverman.

Aujourd'hui, je vais vous montrer une procédure d'imagerie de cellules vivantes des vésicules à noyau dense et des neurones en culture en utilisant la microscopie épifluorescence. Commençons. Pour la plupart des expériences, nous utilisons des boîtes de neurones hippocampiques de rat qui ont été cultivées à une densité cellulaire de 250 000 cellules par boîte de six centimètres, pour chaque transfection, étiquetant deux tubes de 1,5 millilitre, un pour l'ADN plasmidique et l'autre pour le réactif de transfection.

Dans une hotte à flux laminaire, pour combiner un microgramme d'ADN plasmidique avec cent microlitres de MEM dans un seul tube à température ambiante, veillez à utiliser un MEM ne contenant aucun supplément. Combinez six microlitres de lip avec cent microlitres de MEM dans l'autre tube. La même quantité peut être utilisée pour une double transfection, même si le rapport lip/ADN sera divisé par deux dans de tels cas.

Pour préserver la durée de conservation du réactif lipidique, gardez-le toujours réfrigéré ou dans un réfrigérateur de paillasse, et incubez les tubes pendant cinq minutes à température ambiante. Transférez le mélange d'ADN dans le milieu MEM dans le tube lipidique et mélangez délicatement avec APE Next, puis incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Après 25 minutes, ajoutez 60 microlitres d'acide K-néuronique 50 millimolaire pour minimiser les dommages cytotoxiques aux neurones en culture.

Étant donné que nous cultivons des neurones sur la face inférieure de lamelles suspendues au-dessus d'une monocouche de GL, il est nécessaire de retourner les lamelles et d'exposer les neurones à la solution de transfection. Retournez soigneusement la lamelle, la face inférieure vers le haut, à l'aide de pinces stériles. Disposez-les de manière à ce qu'elles ne se chevauchent pas.

Veillez à ne pas racler la surface du coverslip recouverte de neurones ou la surface du plat recouverte de ggl. À la fin de l'incubation de 30 minutes, prélevez environ N 0,5 millilitre de milieu à partir du plat de six centimètres et mélangez délicatement avec l'ADN dans le tube. Transférez la solution d'ADN dans le plat en la laissant tomber uniformément sur la surface du milieu.

Faites glisser doucement la boîte de Petri d'avant en arrière dans une direction, mais veillez à ne pas agiter le milieu. Après avoir mélangé dans une direction, arrêtez-vous et répétez l'opération dans la direction perpendiculaire afin de répartir uniformément les complexes d'adn au cours de la boîte. Incubez pendant 90 minutes dans l'incubateur de culture tissulaire à 37 degrés C et 5 % de dioxyde de carbone.

Après l'incubation, retournez les lamelles côté pied vers le bas et disposez-les de manière à ce qu'elles ne se chevauchent pas. Enfin, laissez l'expression de l'ADN se poursuivre pendant la durée souhaitée, généralement toute la nuit ou jusqu'à 48 heures dans l'incubateur. L'imagerie en direct des vésicules denses marquées par la GFP dans des neurones hippocampiques en culture nécessite un microscope à fluorescence équipé d'une caméra CCD.

Une chambre d'imagerie équipée d'un contrôleur de température et d'un chauffage d'objectif sera nécessaire. La chambre ne doit pas comporter de ports ouverts, une modification qui peut être incluse lors de la commande de la chambre. Ensuite, démarrez la caméra du microscope, la lampe à fluorescence et le logiciel d'acquisition d'images.

Activez l'alimentation électrique de la plateforme de la chambre et des réchauffeurs d'objectif. C'est également le moment opportun d'appliquer une goutte d'huile sur les objectifs. Préparez maintenant la plateforme chauffante et la chambre d'observation.

Pour faciliter la manipulation, étiquetez un côté du couvercle de la chambre à l’aide d’un marqueur indélébile. Placez le couvercle, côté ouvert vers le haut, sur le bouchon d’un tube de 50 millilitres, qui constitue un support idéal pour la chambre.

Appliquez un anneau de graisse dans la rainure entourant le trou sur le côté de la chambre marquée « top ». Évitez d'utiliser trop de graisse, car elle pénétrerait dans la chambre et réduirait la zone observable. Utilisez des pinces.

Fixez une lame de couverture propre et non utilisée de 18 centimètres sur le côté supérieur de la chambre. Exercez une pression douce sur les bords de la lame de couverture afin de créer un joint étanche dans la rainure en creux de la chambre. Retournez la chambre et appliquez un anneau similaire de graisse sur la rainure du côté opposé ou inférieur de la chambre.

Transférez 750 microlitres de milieu d’imagerie dans la chambre. Cette quantité est excessive, mais la graisse doit empêcher le milieu de déborder, et l’excès permettra d’éviter l’emprisonnement de bulles d’air lorsque la lamelle recouverte de cellules sera mise en place. Conservez la chambre préparée dans l’incubateur de culture tissulaire jusqu’à son utilisation.

Il faut éviter les incubations prolongées, comme une heure ou plus, car le milieu d'imagerie s'évaporera et changera de composition. Pour le montage final de la chambre destinée à l'imagerie en conditions de vie, déplacez la chambre préparée et une boîte contenant des lamelles transfectées de l'incubateur vers la hotte de culture tissulaire. À l’aide de pinces stériles, retirez soigneusement une lamelle de la boîte de transfection.

Ensuite, touchez le bord de la lame avec un essuie-tout pour absorber le milieu de croissance. Puis, placez la lame côté neurones vers le bas dans la chambre préparée. Touchez d'abord un côté de la lame à la graisse, puis appliquez une pression sur les bords pour aplatir la lame sans piéger de bulles d'air.

Il est normal que l'excès de milieu d'imagerie déborde ; essuyez l'excès de milieu d'imagerie, mais faites attention à ne pas déplacer la lame de couverture de sa position. Déplacez la chambre vers le réchauffeur de plateau préchauffé et fixez la chambre en place. Ensuite, transférez la chambre sur la platine afin de réduire le photoblanchiment et la phototoxicité.

Réglez la lampe à l'intensité minimale nécessaire pour localiser les cellules transfectées. Recherchez ensuite une cellule d'intérêt. En utilisant un objectif à immersion huile de faible grossissement, comme 40 x, il est conseillé de suivre un motif de recherche planifié afin d'assurer une couverture maximale de la lame et d'éviter des acquisitions d'images redondantes.

Une fois le champ souhaité localisé, basculez sur le canal d'une protéine marquée par fluorescence d'intérêt. Passez à un objectif à immersion huile de fort grossissement, par exemple entre 60 et 100×, puis rétablissez l'intensité de la lampe à un niveau élevé. Utilisez l'acquisition en continu ou une fonction équivalente de votre logiciel d'imagerie pour enregistrer la dynamique de la protéine marquée par fluorescence dans le cas d'organites en déplacement rapide. Le temps d'exposition et le délai entre les expositions doivent être minimisés afin d'obtenir des enregistrements à fréquence élevée d'images.

La dérive de focalisation observée dans l'aperçu à l'écran peut être corrigée en temps réel par un ajustement manuel de la mise au point. Veillez à acquérir une image en contraste de phase ainsi que toutes les autres images complémentaires nécessaires pour les analyses et présentations ultérieures. Enregistrez toutes les images avant d'explorer davantage la lame et de procéder à l'enregistrement suivant.

Typiquement, trois à cinq enregistrements provenant d'une lame sont considérés comme un succès, et les lames sont observées pendant 30 à 60 minutes ; la phototoxicité, ainsi que son impact sur la santé générale des cellules, doit être prise en compte, car les transporteurs peuvent être réduits dans les cellules endommagées. Les observations en imagerie de cellules vivantes consistent généralement en des enregistrements, également appelés séries d'images, qui montrent le déplacement d'organites marqués par fluorescence au sein du champ de vision. Voici un film représentatif du transport de iCal à noyau dense.

La couleur a été inversée pour faciliter l'observation. Remarquez les particules en mouvement. Les graphiques CH sont des images illustrant le déplacement des particules en juxtaposant des analyses linéaires où chaque point temporel est représenté par une colonne du graphique.

Cette figure illustre la manière dont deux particules se déplaçant en sens opposé sont représentées sur un graphique CH. Une analyse plus poussée des chronographies peut fournir des informations sur la vitesse du flux de particules, les inversions de longueur de parcours et les particules stationnaires. Bonjour, nous venons de vous montrer comment acquérir des enregistrements à haute vitesse du transport des vésicules Dsco et des neurones hippocampiques en culture.

Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de préchauffer tous les composants de la chambre d'imagerie et de la plateforme afin de réduire le stress subi par les cellules lors de leur transfert de l'incubateur vers la platine. Vous devez travailler rapidement mais avec précaution. Voilà, c'est tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.