Visualiser le Live Drosophile Gliales-jonction neuromusculaire avec des colorants fluorescents

Cette procédure commence par la préparation d'une larve de drosophile de manière à ce qu'elle soit retournée afin d'exposer la surface des cellules musculaires de la paroi corporelle, associant les motoneurones et les cellules ggl. Elle combine une coloration fluorescente des terminaisons neuronales présynaptiques, l'expression endogène de GFP et de DS rouge, ciblant les membranes gliales et musculaires postsynaptiques, ainsi que la visualisation de l'espace parasynaptique à l'aide de colorants fluorescents. Grâce à ces méthodes, une image claire des changements structuraux survenant au niveau de la jonction neuromusculaire gliale peut être observée sur un prélèvement vivant. Bonjour, je suis D Brink du laboratoire d'ALS de Vanessa au département de zoologie de l'Université de la Colombie-Britannique. Aujourd'hui, je vais vous montrer une préparation tissulaire et deux techniques de marquage cellulaire permettant l'imagerie de tissus larvaires vivants par microscopie confocale.

Nous utilisons cette procédure en laboratoire pour étudier les cellules gliales au niveau de la synapse neuromusculaire. Passons maintenant à quelque chose de complètement différent : la préparation tissulaire « à l'envers » commence par le classement des larves. Cette procédure sera démontrée sur des larves de troisième stade errantes, car elles sont grandes et faciles à disséquer ; utilisez uniquement des larves W3 qui se déplacent activement.

Ensuite, nettoyez la surface des larves à l’aide d’un pinceau très doux dans une boîte de Pétri contenant de l’eau doublement distillée. Le nettoyage des larves est important car il améliore la qualité optique et réduit également la présence de bactéries. Une fois les larves nettoyées, transférez-les dans une petite boîte de Pétri contenant trois millilitres de HL6 glacé avec cinq millimolaires de glutamate.

Placer la boîte sur de la glace jusqu'à ce que l'animal cesse de bouger et se détende, ce qui prend généralement environ deux minutes. Une fois que la larve a cessé de bouger, commencer la dissection du tissu à l'aide d'un microscope stéréoscopique, en tenant les ciseaux à ressort de la main dominante et une pince à pointe très fine. De l'autre main, faire un petit trou dans la paroi corporelle avec les ciseaux afin d'équilibrer la pression à travers la paroi corporelle, tout en maintenant délicatement l'animal au fond de la boîte.

Avec la pince, couper les deux segments postérieurs et disséquer les viscères. Un peu de tissu adipeux sortira probablement de la cavité corporelle par l'incision. Retirer également ce tissu.

Continuez à maintenir délicatement les larves contre le fond de la boîte avec la pince fine. De l'autre main, tenez une épingle à insecte n°0 à extrémité émoussée et appuyez-la contre les pièces buccales des larves. Poussez les pièces buccales à travers la cavité corporelle, comme si vous retourniez une chaussette sur votre poing.

Le tissu, retourné, doit présenter cet aspect. À l’aide de ciseaux à ressort ultrafins pour dissection, disséquez le corps adipeux et les trachées depuis la paroi corporelle. Retirez autant de corps adipeux que possible.

Efforcez-vous fortement de ne pas tirer les trachées ni de déconnecter le système nerveux. Déchirer les trachées endommagera les muscles de la paroi corporelle. Une fois la dissection terminée, le muscle doit être translucide et détendu, ni opaque ni contracté.

Si vous placez le muscle dans du HL6 sans glutamate à température ambiante, il se contractera probablement de manière rythmique. Étant donné que les générateurs de motifs moteurs dans le SNC sont actifs, la paroi corporelle intacte, retournée, a tendance à se plier en deux selon les lignes médianes dorsale et ventrale. Ainsi, la préparation fournit un hémianimal gauche ou droit à visualiser.

Enfin, montez le tissu sur une lame de microscope à l’aide d’un dispositif de couvre-objet surélevé. Les procédures de montage du tissu seront présentées ultérieurement. Pour commencer l’étiquetage des batonnets neuronaux, pipetez 30 microlitres de solution d’anticorps primaire anti-HRP marqué au fluorochrome dans HL6 et déposez une goutte dans une boîte de Pétri.

Ensuite, immergez la préparation de la paroi corporelle retournée dans le bain de coloration. Vous pouvez observer une marquage des terminaisons neuronales après environ cinq minutes, mais effectuez une incubation de 10 à 20 minutes pour obtenir une étiquette complète et intense.

Pour éliminer l'excès de marqueur HRP, placez le tissu dans 0,5 mL de HL6 pendant 10 à 30 secondes à température ambiante. Le colorant non lié se dissocie rapidement, de sorte que le cycle de rinçage n'a pas besoin d'être long ni vigoureux. Le tissu marqué est désormais prêt à être monté et visualisé par microscopie.

Une variante du protocole de marquage par anticorps vivant précédemment décrit consiste à utiliser une dextrine marquée par un fluorochrome pour mettre en évidence les espaces extracellulaires remplis de liquide. Pour commencer cette procédure, diluez le colorant de dextrine marqué par un fluorochrome dans du HL6 à 0,001 milligramme par millilitre. Vous devrez peut-être modifier la concentration de dextrine si vous n'êtes pas soucieux du moment exact d'entrée dans l'espace extracellulaire.

Prélèvez une goutte de 20 microlitres de colorant sur un lamelle posée en pont et transférez la préparation tissulaire dans le bain de colorant. Si le tissu en position inversée n’a pas besoin d’être perfusé ou si le volume de HL six doit rester faible, il peut être monté sur une lame à double pont. Commencez par coller avec de la colle cyanoacrylate deux lamelles carrées de 18 millimètres sur une lame de microscope très propre.

Laissez un espace de deux millimètres entre les bords des lamelles et centrez cet espace, approximativement au milieu de la lame. Laissez sécher complètement la colle, sinon elle formera une pellicule sur le milieu aqueux entourant votre préparation tissulaire.

Ensuite, déposez une goutte de 30 microlitres de HL six dans l'espace entre les lamelles. Placez le tissu retourné dans la goutte de HL six. Vous devrez peut-être positionner le tissu en diagonale si la larve est grande et que votre système d'acquisition d'images dispose d'un réseau de pixels limité.

Appliquez une petite quantité de vaseline sur les bords d'un troisième coverslip de 18 millimètres et placez-le, côté graisse vers le bas, sur les deux coverslips collés au-dessus du tissu, puis appuyez doucement. Voici les résultats obtenus par nos deux méthodes de marquage fluorescent aigu de la préparation de larve « à l'envers » obtenus à l'aide d'un microscope confocal à disque tournant. La première image est une pile optique d'une synapse nerf-glace-muscle avec des terminaisons en bouton marquées par un anticorps anti-HRP vivant.

À la surface de la cellule musculaire, on observe des terminaisons de type bouton neuronal fortement marquées, colorées artificiellement en bleu. Au milieu de la pile d'images, on trouve des prolongements gliaux marqués au GFP, montrés en vert, ainsi que des boutons marqués au HRP en bleu. En contournant les boutons, on peut voir des coupes transversales du SSR en forme de poche, les réticules subsynaptiques, colorés en rouge, également au milieu de la pile, et en profondeur dans la pile, les SSR marqués en rouge DS.

Les SSR sont les régions synaptiques spécialisées de la cellule musculaire. Les bns se nichent dans les invaginations des cellules musculaires, tout comme certaines parties des prolongements gliaux verts. Les prolongements des cellules gliales s'intercalent autour des bns et des SSR, mais ne recouvrent pas la surface de la synapse comme une couverture dans les couches les plus profondes de l'empilement.

Nous observons des prolongements gliaux verts et le SSR rouge, mais pas autant de terminaisons en bouton. Nous pouvons également trouver des sections transversales du nerf moteur qui innerve le muscle. Les cellules gliales entourent le nerf moteur, il est donc également vert.

Le deuxième résultat du marquage fluorescent aigu de la préparation larvaire « à l'envers » est la synapse marquée par la dextrine fluorescente. Ici, le liquide présent dans l'espace parasynaptique ou fente synaptique est marqué en rouge. Dans les couches superficielles de l'image en coupe optique, on observe une couche de liquide coloré en rouge par le colorant à la dextrine, et l'on peut voir où il s'accumule dans les dépressions ondulées de la membrane plasmique musculaire.

Dans les couches plus profondes de la pile d'images, le colorant fluorescent de dextrine a pénétré dans les fentes synaptiques ; de petits anneaux en forme de beignet de colorant apparaissent entre les terminaisons neuronales et les poches SSR marquées en bleu. Il s'agit de la fente synaptique mise en évidence par le colorant. La lamelle gliale verte n'empêche pas la pénétration du colorant dans la fente au niveau des couches plus profondes de la pile d'images.

Les caractéristiques les plus marquantes sont la SSR ou région synaptique du muscle marquée en bleu, ainsi que les prolongements gliaux plats qui sont verts. De même, la gaine gliale entourant les axones innervés observée dans les couches profondes est verte. La gaine gliale semble exclure le colorant au dextrin.

J'ai juste montré une méthode novatrice pour visualiser la synapse neuro-musculaire gliale dans une préparation de tissu inversée de larves de drosophile. Lors de la préparation du tissu, il est important de veiller à manipuler délicatement le tissu et à s'assurer que le muscle est détendu et que les nerfs périphériques ne sont pas endommagés. Je voudrais conclure par une citation de Marx.

Le temps file comme une flèche. La peur vole comme une banane.