Dissection et d'enregistrement de la jonction neuromusculaire C. Elegans

Un lamelle recouvert de soudure, préparé en étalant une goutte de soudure sur le verre et en laissant polymériser toute la nuit, est placé dans la cavité circulaire de la chambre d’enregistrement préfabriquée et recouvert de solution d’enregistrement. Un ver placé au centre est fixé sur la surface du rebord en commençant par la tête ou la queue, en appliquant la colle sur la face dorsale du ver à l’aide d’une pipette à colle. Une fois le collage terminé, une incision adjacente à la vulve, au niveau de l’interface entre la cuticule et la colle, est pratiquée à l’aide d’une aiguille en verre, puis prolongée vers la tête après extraction des viscères et des œufs de la cavité corporelle.

Le bord tranché de l'incision est soudé ponctuellement avec la colle ausofar, exposant le nerf ventral et les muscles de la paroi corporelle. Le muscle médian ventral situé en avant de la vulve est soumis à une électrode de patch-clamp et l'électrode de stimulation est placée en amont sur la corde nerveuse. Bonjour, je suis Janet Richmond, professeure associée au Département des sciences biologiques de l'Université de l'Illinois à Chicago.

Aujourd'hui, je vais vous montrer une technique de dissection qui nous permet d'exposer les jonctions neuromusculaires de l'élégan marin. Pour l'enregistrement électrophysiologique. Nous utilisons ce montage pour étudier la transmission synaptique.

Très bien, commençons. Avant de manipuler les nématodes, certains équipements doivent être préparés au moins un jour avant la procédure. Il s'agit d'une chambre d'enregistrement pour la dissection, de lamelles en verre recouvertes de S-guard, de pipettes usagées, d'un applicateur de colle et d'une pipette d'extraction.

Commencez par construire la chambre. Découpez une feuille de plexiglas d'un seizième de pouce d'épaisseur afin qu'elle corresponde au plateau du microscope. Utilisée pour effectuer les enregistrements au centre du plexiglas.

Percez un trou circulaire suffisamment grand pour accueillir un verre de couverture circulaire de 22 millimètres de diamètre. Fixez un verre de couverture de 48 par 60 millimètres sur la face inférieure de la chambre, en dessous du trou, à l’aide d’un petit morceau de paraffine d’inclusion tissulaire à bas point de fusion placé dans chaque coin du verre de couverture. Faites fondre rapidement la paraffine sur un bloc chauffant, ce qui laisse après refroidissement une fine couche de cire entre le plexiglas et la lame de verre de couverture ; retirez l’excédent de cire à l’aide d’une lame.

Le couvre-objet adapté à la chambre est un verre de couverture de 22 millimètres S guard revêtu. Pour que le sard fonctionne, il doit être préparé frais selon les instructions du fabricant. Une fois préparé, une petite goutte de sard est déposée sur chaque verre de couverture et étalée à l’aide d’une lame afin d’obtenir une surface uniforme.

Les lamelles recouvertes sont ensuite placées dans des récipients fermés et mis dans une étuve à 65 degrés Celsius pendant toute la nuit pour polymériser. Elles seront prêtes demain pour la dissection tout au long du protocole. Des pipettes en verre silicaté d'un diamètre extérieur de 1 mm, étirées jusqu'à une pointe présentant une résistance d'environ 4 mégaohms, sont nécessaires ; il est donc conseillé de garder un flacon disponible.

Voir la publication JoVE sur la fabrication de patchs, de pipettes et d'électrodes pointues à l'aide d'un tireur programmable par Miriam Goodman. Pour les détails techniques de réalisation de l'électrophysiologie, il est nécessaire de coller le nématode en place. À cette fin, un applicateur de colle est requis.

L'appliquateur de colle est simplement un tube en plastique de deux millimètres de diamètre extérieur et d'un millimètre de diamètre intérieur. Une extrémité du tube est tenue dans la bouche. Elle peut être équipée d'une embout buccal, et l'autre extrémité du tube accueille une pipette d'un millimètre remplie de colle.

Une pipette d'extraction spécialisée est également utilisée pendant la dissection. Elle est constituée d'un tube et d'une pipette, tout comme l'appliquateur de colle, sauf que l'extrémité de la pipette est légèrement émoussée afin de pouvoir accueillir les œufs et les viscères. Commencez par tracer une ligne de cire le long du périmètre de la chambre.

Maintenant, appuyez et placez un lamelle recouverte de S guard, Syl guard vers le haut. La ligne de cire immobilise le lamelle et empêche la solution d’enregistrement de s’infiltrer dessous et de déloger le lamelle pendant la dissection et l’enregistrement. La chambre est ensuite remplie de solution extracellulaire d’enregistrement. Lisez le texte accompagnant pour la formulation une fois la chambre préparée.

Utiliser un pique-nématode pour déposer plusieurs nématodes dans la solution. Avec de la pratique, les nématodes nageurs peuvent être collés sans aucune procédure supplémentaire pour empêcher leurs mouvements. Charger un récipient à colle, fabriqué à partir d’un capuchon de PCR maintenu dans de la cire ou de l’argile à modeler, avec un stock de travail de la colle acrylique Sano pour manipuler la colle.

Terminez la construction de l'appliquateur de colle en fixant votre pipette d'enregistrement à l'extrémité de l'appliquateur. Ensuite, sous la loupe de dissection, remplissez l'appliquateur de colle par aspiration buccale. L'application de la colle sur un nématode est délicate et nécessite de la pratique, car la colle polymérise au contact de la solution extracellulaire d'enregistrement.

Pour remédier à cela, maintenez un flux régulier de colle vers l'extérieur, sans quoi elle durcira et obstruera la pipette. Si la pipette devient obstruée, vous pouvez parfois la déboucher en tapotant doucement la pointe sur la lamelle. Entraînez-vous à manipuler la colle.

Et lorsque vous êtes capable d'écrire votre nom avec de la colle sur la surface du garde-sil, vous êtes probablement prêt à coller l'cuticule du nématode afin de fixer un nématode. Premièrement, choisissez un nématode près du centre de la chambre, là où il y a suffisamment d'espace pour manoeuvrer. Deuxièmement, appliquez une petite quantité de colle soit sur la tête soit sur la queue du nématode, puis abaissez rapidement le nématode sur la surface du garde-sil.

Appliquez ensuite un filet de colle le long du bord dorsal de l'cuticule des nématodes. Cela force le nématode en position en C, avec la vulve tournée vers l'intérieur. Tous les espaces présents dans ce trait de colle doivent être comblés afin d'assurer une adhérence maximale entre le nématode et le garde-sil.

Il s'agit d'un processus délicat, qui peut être facilité par la pratique sur des mutants hypo-motiles. Comme sur 31, il y a une ampoule juste à droite. Maintenant, je vais déplacer ce montage, puis introduire l'aiguille de verre et commencer à pratiquer l'incision. Pour inciser la cuticule, passez à une pipette de dissection manuelle.

Cette pipette doit être plus effilée que les pipettes utilisées pour l'enregistrement avec la colle et posséder une tige courte et robuste, en utilisant le grossissement le plus élevé. Sous le microscope stéréoscopique, alignez la pipette parallèlement à l'axe longitudinal du nématode et insérez la pointe près de la vulve, à l'interface entre la cuticule et la colle. Cette incision libère la pression hydrostatique du nématode, ce qui expulse les œufs et les intestins par le point d'incision.

Continuez à couper la cuticule en direction de la tête du nématode avec un mouvement de cisaillement similaire à celui utilisé pour ouvrir une lettre, jusqu’à ce que vous atteigniez le pharynx. Passez ensuite à la pipette d’extraction pour aspirer les organes internes du nématode. Une fois l’incision dégagée, la cuticule ouverte conservera sa forme cylindrique.

Ensuite, prenez une pipette neuve pour la colle. Utilisez-la pour souder ponctuellement la cuticule au niveau du bord de l'incision sur la surface du garde-syl. Il est important d'utiliser un minimum de points de colle à ce stade afin d'éviter d'endommager ou de masquer les njs.

Le cordon nerveux ventral et les muscles de la paroi corporelle sont désormais exposés, mais la membrane basale qui recouvre la jonction neuromusculaire doit encore être éliminée. Pour ce faire, aspirez la solution d’enregistrement extracellulaire de la chambre et appliquez une solution d’enregistrement extracellulaire contenant 0,4 milligramme par millilitre de collagénase. Après 10 à 20 secondes, retirez la collagénase et rincez la préparation plusieurs fois avec une solution d’enregistrement fraîche.

Le nématode est désormais prêt pour les enregistrements électrophysiologiques. À la position de la jonction neuromusculaire, placez la chambre d’enregistrement sur la platine d’un microscope droit muni d’un objectif ×10 afin de centrer le nématode, puis passez à un objectif à immersion dans l’eau ×40 avec optique DIC et vérifiez que les muscles de la paroi corporelle et le cordon nerveux sont intacts. Positionnez le nématode horizontalement afin que les électrodes puissent être introduites des deux côtés, gauche et droit.

Typiquement, nous réalisons le patch sur la face ventrale médiane du corps, au niveau des muscles situés en profondeur par rapport à la vulve, mais il est également possible de réaliser facilement le patch sur les muscles situés à la fois sur les faces dorsale et ventrale du ver, avec quelques neurones présentant l'aspect d'un demi-cercle accolé au muscle. Réalisez maintenant le patch du muscle en utilisant des techniques standards de patch-clamp afin d'obtenir un scellement gigohm. Selon notre expérience, des électrodes d'enregistrement d'une résistance d'environ quatre mégohms donnent de bons résultats en mode d'enregistrement en clampage de voltage en configuration whole-cell.

Appliquez une aspiration plus forte et soumettez la membrane à un choc électrique jusqu'à ce que le scellement giga soit rompu. Nous avons parlé d'une résistance de quatre mégaohms. Donc, si vous regardez cela ici, oui, cela indique 4,9 mégaohms.

C’est plus grand, c’est normal. C’est dans la fourchette que nous utilisons. D’accord. Oui. Maintenant, nous allons essayer d’aller plus grand, donc qu’est-ce que cela donne ?

Quoi ? Nous voulons que cela descende complètement. Oui. Compris. Oui !

Dans un bon enregistrement, les muscles de la paroi corporelle des nématodes adultes de type sauvage présentent généralement une capacité membranaire d'environ 70 picofarads et peuvent être enregistrés de manière stable pendant au moins 10 minutes à un potentiel de maintien de -60 millivolts, avec des courants de maintien minimes, d'environ 50 picoampères. Une fois qu'une cellule musculaire a été patchée, une stimulation provenant d'une deuxième électrode, l'activation lumineuse d'un canal, Rodin ou l'ajout d'une solution hyperosmotique génèrent tous des réponses mesurables. Pour provoquer une réponse électriquement induite, nous plaçons généralement une électrode de stimulation contenant une solution extracellulaire sur le cordon nerveux ventral, en position interne par rapport au muscle patché.

Cette configuration de patch lâche nécessite des impulsions de courant d'une à deux millisecondes, comprises entre 10 et 40 volts. Malheureusement, après quelques réponses évoquées, le cordon nerveux est endommagé de façon irréversible et, pour une raison inconnue, seules des réponses évoquées cholinergiques peuvent être obtenues avec cette configuration. En alternative, des nématodes exprimant un canal activé par la lumière, où le transgène dosin est présent dans différentes populations neuronales, peuvent être utilisés pour provoquer une libération.

En prévision de cette méthode, sachez que les nématodes utilisés pour cette application doivent être élevés sur des bactéries additionnées de rétinol. Dans cette préparation, une LED puissante de 470 nanomètres filtrée par un filtre d'excitation GFP (450 à 490 nanomètres) est utilisée pour activer de manière répétée l'opsine du canal, provoquant la libération induite de différents neurotransmetteurs selon les types cellulaires exprimant le canal. La dernière technique à examiner peut être utilisée pour mesurer la taille du pool de vésicules synaptiques immédiatement libérables provenant de plusieurs neurones sur le muscle enregistré.

Cela est réalisé en appliquant par pulsation de pression une solution extracellulaire hyperosmotique sur le muscle enregistré pendant une à trois secondes. Le résultat sera un déferlement d'événements post-synaptiques asynchrones. Des enregistrements en configuration tout-cellule du muscle de la paroi corporelle, sous clampage de tension, sont présentés pour chacun des trois protocoles de stimulation décrits ci-dessus : réponses évoquées électriquement, évoquées par la lumière et induites par l'hyperosmolarité.

Dans tous les cas, le muscle de la paroi corporelle médiane ventrale est fixé à moins 60 millivolts. Les cellules musculaires de type sauvage présentent généralement des taux élevés de courants synaptiques endogènes entrants de type miniature. Dans nos solutions d'enregistrement standard, une dépolarisation de deux millisecondes du cordon nerveux ventral antérieur provoque une libération synchrone provenant de plusieurs synapses, entraînant une réponse évoquée importante d'environ deux à 2,5 nanoampères.

Dans les vers de type sauvage, les tracés représentatifs à droite des tracés de type sauvage dans A et B montrent la libération synaptique chez un mutant gravement non coordonné. Le panneau C18 présente une réponse induite par la lumière au niveau de la jonction neuromusculaire d'un ver de type sauvage exprimant la channelrhodopsine rouge. Dans les neurones cholinergiques, une impulsion lumineuse de deux millisecondes produit typiquement une réponse de 1,5 à 1,8 nanoampères. L'éjection sous pression de solution saline hyperosmotique à 850 milliosmoles sur le muscle pendant une seconde provoque un barrage asynchrone de courants synaptiques unitaires, représentant le pool de vésicules facilement libérable.

J'ai juste montré la technique de dissection que nous utilisons pour exposer les jonctions neuromusculaires de l'élégance marine et effectuer des enregistrements électrophysiologiques. Il est important de se rappeler que cette technique est difficile et qu'il vous faudra probablement plusieurs mois pour la maîtriser. Toutefois, une fois acquise, c'est comme faire du vélo.

Les techniques resteront gravées en vous, et plus vous les pratiquerez, plus la préparation deviendra rapide et fiable. Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.