Antigène spécifique de CD4 + Visualisation cellules T à l'aide du CMH de classe II tétramères

Ce qui est vraiment unique avec le test Teer, c’est qu’il permet de visualiser directement les lymphocytes T spécifiques à l’antigène. Le te, le teer est l’aspect unique principal de notre analyse. Cela est associé à une étape d’amplification que nous faisons.

Vous savez, nous isolons les lymphocytes T puis nous les faisons croître dans un environnement qui enrichit l’échantillon pour les lymphocytes T qui nous intéressent. Ensuite, nous pouvons spécifiquement étiqueter uniquement ces cellules et les visualiser sur un cytomètre en flux. Et donc, avec les tests précédents, comme le CSFE ou les tests de prolifération qui existent depuis des décennies, ce que vous obtenez, c’est une sorte de mesure globale globale de ce qui se passe avec l’ensemble de la population de cellules T.

Mais il y a des millions de lymphocytes T dans le corps qui voient tout un ensemble diversifié de schémas. Si vous avez de la chance, peut-être qu’une cellule sur deux à 300 000 des cellules de l’échantillon sera celle que vous examinez. Et c’est pourquoi cet essai effectue ces étapes d’enrichissement.

Et puis, avec un nombre de test, et parce que vous colorez directement, vous pouvez visualiser en dehors du fond une population qui représente moins de 1 % du nombre total de cellules. Et donc on peut voir de très petites différences et obtenir un décompte assez précis du nombre de lymphocytes T présents dans cet échantillon sanguin, vous savez, qui sont dans cet individu et qui reconnaissent votre schéma d’intérêt. Mais cela ne s’arrête pas là, car les teters permettent aussi non seulement d’étiqueter ces lymphocytes T, mais aussi de les isoler pour une analyse plus approfondie.

Et les teters que vous utilisez sont en fait fabriqués ici chez BRI, c’est bien ça ? Oui. Nous faisons partie des très rares laboratoires dans le pays à avoir réussi à atteindre la classe deux de relève. Notre intention est de distribuer ces réactifs à un coût à tout laboratoire intéressé par l’importation de cette technologie.

Quels sont, selon vous, les aspects les plus difficiles ou les plus difficiles de ce test lorsqu’il s’agit de le reproduire dans d’autres laboratoires ? Eh bien, en y réfléchissant, il y en a en réalité deux : la croissance des lymphocytes T. C’est vraiment un peu un art.

Vous avez presque chaque jour des décisions concernant le besoin de nutriments supplémentaires ou d’espace supplémentaire pour les cellules. Et puis la deuxième partie, que je pense être la plus difficile à exploiter pour un inexpérimenté, est en fait l’analyse des données. C’est un peu comme déterminer quelle partie du signal est vraiment une réponse positive et laquelle est simplement inhérente à la physique et à l’attraction.

Et le fait que tout ait un certain degré de colle demande encore une fois beaucoup d’expérience, surtout dans un contexte où la réponse globale sera un peu faible. Comment les informations que vous générerez avec ce test ont-elles potentiellement bénéficié aux patients à ce stade ? L’un des premiers traits de fabrique qui apparaît chez tout patient auto-immun est une sorte de constellation d’anticorps spécifiques à cette maladie.

Nous savons, grâce aux fondamentaux fondamentaux de l’immunologie, que partout où il y a une réponse d’anticorps, il y a toujours d’abord une réponse des lymphocytes T. Donc, si nous pouvions observer chez les individus à risque et voir ce saut de l’activité des lymphocytes T qui précéderait la formation des anticorps, cela nous aiderait alors à définir un nouveau niveau de risque ou que les individus se dirigent vers des autoanticorps, ce qui, espérons-le, ouvrirait une fenêtre pour des thérapies interventionnelles. Cette procédure purifiera et étendra les cellules T CD quatre positives spécifiques à l’antigène et les visualisera à l’aide de réactifs teters et d’équipements de classe deux de biosécurité à flux laminaire.

Ce sera l’espace de travail principal pour la procédure. Tubes coniques de 50 millilitres, tube primaire pour isolation PBMC, un XPBS. Il faut être un paquet de foli sans calcium et magnésium enveloppé de feuille aluminium pour protéger contre les cartouches aérosols CoStar 10 mil avec inserts de 50 mil, utilisées pour éviter la contamination du sang de la centrifugeuse.

GS six pipettes centrifugeuses R, pipettes Pasteur tampon hémolytique contenant 8,3 grammes par litre. Chlorure d’ammonium 1,0 gramme par litre. Bicarbonate de sodium 0,04 gramme par litre DI sodium EDTA (trian bleu) solution 0,2 % dans PBS hémocytomètre CYTOMÈTRE 15 millilitres tube conique fonctionnant contenant PBS complété avec deux millimolaires EDTA plus cinq grammes par litre.

Kit d’isolation BSA max CD quatre deux acheté auprès du bloc magnétique EP Milin biotech acheté auprès de stem cell technologies. D’autres plateformes d’enrichissement des cellules magnétiques pourraient être utilisées avec une efficacité égale. Tube polypropylène de cinq millilitres RPMI 1640 complété par 25 millimolaires hippies utilisés pour fabriquer un sérum humain en pool de médium T, utilisé pour compléter la bande de stylo du milieu T-lymphocyte utilisée pour compléter le milieu T-cellulaire 500 millilitres filtre à bout de bouteille stérile à 48 puits utilisé pour la culture d’expansion in vitro, incubateur CO2 étape 37 degrés, solution de peptide synthétique contenant l’épitope d’intérêt.

Tube de fax de cinq millilitres chargé en polystyrène de classe deux (TEER) utilisé pour visualiser les lymphocytes T spécifiques à l’antigène, anti-CD trois, anti-CD quatre et anti-CD 25 utilisés pour revêtir les lymphocytes T spécifiques à l’antigène. Faxez un cytomètre à débit calibre ou équivalent avant de commencer la procédure. Rassemblez tous les matériaux et équipements de votre espace de travail.

La démonstration suivante couvrira les étapes suivantes. Isolation PBMC, séparation positive des lymphocytes T CD quatre en culture d’expansion vitro visualisant les lymphocytes T par teem ou coloration. Étape un isolement PBMC.

Prélève un échantillon de sang. Le sang doit être collecté dans des seringues ou des tubes sanguins et anticoagulé avec de l’héparine à un ratio de 1 pour 50 afin d’éviter la coagulation, attendez-vous à un rendement d’environ 1 million de PBMC par millilitre de sang. Environ 40 % d’entre eux seront des lymphocytes T CD 4 positifs.

Aliquote le sang dans des tubes coniques de 50 millilitres. 25 millilitres de sang par tube. Mélangez doucement le sang avant la coagulation de l’AL pour répartir le plasma.

Ajoutez du PBS en portant le volume total à 40 millilitres et en séchant 11 millilitres de fial en les insérant dans un tube sanguin et en retirant soigneusement l’aide à la pipette de la pipette. Le fial s’écoulera lentement vers le fond du tube. Une fois le niveau égalisé, retirez lentement la pipette du tube sanguin et jetez le bouchon des tubes et passez à l’aérosol des bonbons.

Fermez fermement les bonbonnes et centrifugez à 900 fois G pendant 20 minutes sans pause. Il est crucial qu’aucune rupture ne soit appliquée à la fin de cette rotation car la force de rupture perturberait la couche de cellules après la rotation. Le PBMC doit former une couche blanche distincte entre le plasma jaune au-dessus et le fial transparent en dessous.

Écumez doucement la couche de globules blancs à l’aide d’une pipette de transfert et transférez dans un nouveau tube. Un peu de plasma et de fial peuvent être extraits avec le PBMC, mais évitez de relever une partie de la couche de globules rouges. Typiquement, deux tubes sanguins peuvent être combinés en un seul tube cellulaire à cette étape.

Pour augmenter la taille des pastilles, ajoutez du PBS portant le volume total à 15 millilitres et centrifugez à 500 fois G pendant 15 minutes à basse pause, puis aspirez le liquide en aérosol des bonbonnes à l’aide d’une pipette à pâte, en veillant à ne pas déranger la pellete. Traitez avec un tampon hémolytique en ajoutant cinq à six millilitres à chaque tube et en mélangeant doucement pour éliminer les grumeaux. Incubez pas plus de cinq minutes.

Ajoutez du PBS pour porter le volume total à 50 millilitres et centrifugez à 230 fois G pendant 10 minutes. Sur les ralentissements, les bonbonnes aérosols ne sont plus nécessaires pour ces rotations plus lentes. Laver deux fois le liquide à l’aspiration à l’aide d’un tube rempli d’une pipette de pâturage avec du PBS et centrifuger à 230 fois G pendant 10 minutes avant la dernière étape de lavage, retirer une aliquote de cellules en suspension réintégrée, diluer avec du trian blue et compter à l’aide d’un hémocytomètre.

Ce nombre de cellules déterminera les volumes de réactifs utilisés dans la séparation des cellules T. Étape deux, séparation positive des cellules T de CD quatre, aspirer le liquide et ajouter un tampon courant pour porter le volume total à 40 microlitres pour 10 millions de cellules. En général, cela nécessite 30 microlitres de tampon plus le volume résiduel de pellets.

Transférez ce volume dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez un cocktail d’anticorps issu des kits d’isolation CD quatre, 10 microlitres par tube de 10 millions de cellules et laissez poser sur la glace pendant 10 minutes. Retirez le tube de la glace, retirez le bouchon et ajoutez 30 microlitres de tampon en fonctionnement par 10 millions de cellules.

Ajoutez des billes magnétiques du kit d’isolation CD quatre. 20 microlitres par 10 millions de cellules bouchons à tube et placez sur la glace pendant 15 minutes. Ajoutez 10 volumes de tampon en cours pour laver et centrifugez à 230 fois G pendant 10 minutes.

Pendant le tournage, installez l’aimant et un tube en polypropylène de cinq millilitres dans votre espace de travail. Aspirez du liquide à partir de granulés cellulaires. Ajoutez deux millilitres de tampon courant et enlevez les grumeaux à l’aide d’une pipette de transfert.

En utilisant la même pipette de transfert, transférez les cellules dans le tube de cinq millilitres et les incubez dans l’aimant pendant 15 minutes. Décantez soigneusement la fraction de cellules T positive de CD quatre dans un tube marqué de 15 mil en inversant l’aimant et en vidant toutes les gouttes sauf la dernière. Ajoutez encore deux millilitres de tampon courant au tube de cinq millilitres et retirez de l’aimant.

Rincez doucement les quatre cellules négatives CD sur les parois du tube et transférez-les dans un tube marqué de 15 mil. Ajoutez deux millilitres de milieu à cellules T à chaque tube. Retirez les aliquotes pour le comptage des cellules et centrifugez à 230 fois G pendant 10 minutes.

Diluez les aliquotes cellulaires avec du bleu de trian et comptez à l’aide d’un hémocytomètre. Ces décomptes cellulaires détermineront le nombre de puits utilisés pour la culture d’expansion. Étape trois.

La culture d’expansion in vitro aspire le liquide des granulés cellulaires CD quatre positifs et CD quatre négatifs en fonction du nombre de cellules. Ajoutez un milieu aux quatre cellules positives CD pour ajuster le volume à 3 millions de cellules par mil. Ajoutez un média aux quatre cellules négatives de CD pour ajuster le volume à 10 millions de cellules par mil.

La culture d’expansion nécessite 3 millions de cellules CD quatre négatives par puits et de deux à 3 millions de cellules CD quatre positives par puits. Typiquement, les cellules CD quatre positives constituent la population limitante. Une CD de quatre cellules négatives dans le nombre approprié de puits sur une plaque de 48 puits.

En ajoutant 300 microlitres à chacun, placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés pendant une heure. Retirez la plaque, l’incubateur, lavez les puits en ajoutant 500 microlitres de milieux frais et pipotez doucement 12 à 20 fois avec une pipette de transfert et retirez tout le liquide. Ce lavage laissera derrière elle une couche de cellules présentatrices d’antigènes adhésives.

Une fois le lavage terminé, ajoutez juste assez de substrat pour humidifier le fond de chaque, environ 100 microlitres. Sinon, les cellules adhérentes à A vont se dessécher. Ajoutez deux à trois millions de cellules de CD et quatre cellules positives dans chaque puits si nécessaire.

Ajoutez des médias supplémentaires pour porter le volume total dans chaque puits à un millilitre. Ajoutez le peptide désiré à chacune. Puits. La concentration typique pour la stimulation est de 10 microgrammes par millilitre.

Placez finalement dans un incubateur à 37 degrés pendant sept jours. Après sept jours. Ajoutez 50 microlitres d’hémo IL, deux dans chaque puits chaque jour suivant.

Surveillez la croissance des cellules à l’aide d’un microscope pour alimenter les puits d’alimentation qui ne sont pas encore confluents en retirant la moitié du milieu, en ajoutant un nouveau milieu et 50 microlitres de deux puits confluents divisés en IL, en suspendant les cellules et en déplaçant la moitié des cellules vers un puits vide. Ajout de milieux frais et 50 microlitres de cellules de retour IL deux à l’incubateur. Les cellules en expansion seront prêtes pour la coloration par le teer après 13 à 15 jours de culture.

Quatrième étape : visualiser les lymphocytes T par coloration de teer, acheter ou assembler des teters pour correspondre au peptide. Des combinaisons MHC utilisées pour stimuler les cellules T CD quatre positives. Retirez la plaque de l’incubateur.

Retirez soigneusement la moitié des médias de chacun. Transférer une aliquote de cellules de chaque puits, généralement 75 microlitres ou environ 50 000 cellules, dans un tube de cinq millilitres en polystyrène, ajouter un microlitre typiquement un microlitre pour 50 microlitres de volume total et placer dans un incubateur à 37 degrés pendant une heure. Il est également conseillé de colorer une seconde aliquote de chaque puits avec un teer désapparié comme étiquette témoin négative avec des anticorps anti-CD 3, anti CD quatre et anti-CD 25.

Des marqueurs anticorps supplémentaires ou alternatifs peuvent être utilisés. Cependant, n’utilisez pas d’anticorps marqués par PE car ce canal doit être réservé aux teems à ce moment-là. De plus, étiquetez chaque contrôle de couleur ou d’isotype avec des cellules supplémentaires.

Incubez les cellules marquées par anticorps pendant 15 à 30 minutes à quatre degrés. Lavez chaque tube avec 0,5 à un millilitre de tampon en fonctionnement et centrifugez à 230 fois G pendant 10 minutes. Décantez soigneusement le liquide des tubes de fax, calibrez le cytomètre de débit à l’aide de billes de référence, des tubes de contrôle couleur unique, des contrôles isotypes, etc.

Analysez chaque tube à l’aide du cytomètre en flux. Les cellules tétra-positives devraient constituer une population distincte parmi les lymphocytes T CD étendus de quatre cellules. Les cellules tétra-positives sont généralement positives au niveau 25 du cycle et souvent au niveau 4 élevé.