Name: Infection virus de la vaccine et lanalyse temporelle de lexpression des gènes de virus: Partie 1 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Apprenez à infecter des cellules HeLa avec le virus vaccinia et à extraire l'ARN à différents points temporels pour analyser l'expression génique virale et de l'hôte.

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Partie 1: Mise en place de l&#39;infection <ol><li> Cultiver des cellules HeLa dans des flacons et attendre que les cellules sont d&#39;environ 80% de confluence. </li><li> Préparez assez moyennes croissance virale de l&#39;expérience: régulière DMEM avec 2% de FBS et sans antibiotiques ajoutés. </li><li> L&#39;infection peut être réalisée soit avec un stock brut de virus de la vaccine avec un titre connu, ou saccharose virus purifié avec un titre connu, si vous êtes préoccupé par l&#39;expression du gène hôte. </li><li> Si vous utilisez le virus du saccharose purifié, passez directement à la partie 2. </li><li> Si vous utilisez un stock de virus vaccine brut, juste avant l&#39;infection, soniquer une aliquote du virus dans un sonicateur tasse avec un bain de glace et la plupart du temps un peu d&#39;eau. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Soniquer à environ 30W pendant 20 secondes. </li><li> Vortexer le tube et répétez la sonication trois fois, en ajoutant plus de glace si nécessaire pour garder la tasse remplie de glace et de froid. </li><li> Vortex entre chaque étape de sonication. </li><li> Passez à la partie 2. </li></ul></li><li> Alternativement, si vous ne possédez pas un sonicateur tasse, mélangez un volume égal du stock de virus brut et la trypsine 0.25mg/mL. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Vortex vigoureusement. </li><li> Incuber le stock de virus / trypsine mélanger dans un bain-marie à 37 ° C pendant 30 minutes. </li><li> Vortex à intervalles de 5-10 minutes. </li><li> Passez à la partie 2. </li></ul></li></ol> Partie 2: infecter les cellules <ol><li> Calculer la quantité de particules virales nécessaires pour infecter la monocouche à la multiplicité désirée d&#39;infection (MOI). Typiquement, un MOI élevé (entre 5 et 10) est utilisé pour timecourses infection. </li><li> Ajouter la quantité voulue de virus de saccharose purifié ou trypsinisées virus de brut à 37 ° C les milieux de croissance virale et bien mélanger. Vous devez utiliser les médias suffit pas de couvrir le fond de la fiole. Par exemple, 10 ml de médias pour un flacon T-175. </li><li> Retirez le support à partir des cellules et rincer à température ambiante PBS. </li><li> Ajouter le virus / media croissance virale dans chaque flacon. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Agiter doucement, assiettes d&#39;inclinaison et incuber à 37 ° C dans un incubateur à 5% de CO2 pendant 1 heure. </li><li> Plaques Tilt et agiter toutes les 15 minutes pour la propagation du virus de façon uniforme et garder les cellules humides. </li><li> Pour un point de temps 0hr/Mock, ajouter le support de croissance virale uniquement, sans virus ajouté. </li></ul></li><li> Après l&#39;incubation de 1 heure, retirer le support contenant le virus, et rincer trois fois avec la température ambiante du PBS. </li><li> Ajouter le montant maximum du milieu de croissance virale dans chaque flacon. Par exemple, 30 ml de médias pour un flacon T-175. Commencez à compter ce que votre point 0 h de temps. </li></ol> Partie 3: Récolte des cellules <ol><li> Vérifiez les cellules sous un microscope et de noter tout effet cytopathogène (ECP). </li><li> Retirez le support et rincer les cellules avec 30 ml de la température ambiante du PBS. </li><li> Ajouter 15 ml de trypsine dans les cellules et incuber pendant 2-5min à 37 ° C. </li><li> Vérifiez sous le microscope pour le détachement des cellules et appuyez délicatement flacon pour déloger les cellules. </li><li> Transfert cellules avec une pipette stérile sérologique dans un tube conique de 50 ml. </li><li> Laver le ballon avec un volume égal de milieu de croissance cellulaire, et d&#39;ajouter le support pour les cellules traitées à la trypsine dans le tube conique. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Retirez la trypsine / media à partir du culot cellulaire. </li><li> Reprendre le culot cellulaire soit réactif Trizol ou le tampon de lyse à partir de votre kit d&#39;isolement désiré ARN. </li><li> Si vous utilisez TRIzol, diviser l&#39;échantillon en aliquotes de 1 mL dans des tubes Eppendorf 1,5 ml étiquetés et congeler à -80 ° C. </li><li> Répétez l&#39;opération pour tous les points du temps, un flacon de récolte par point de temps. </li></ol> Partie 4: extraction d&#39;ARN des échantillons dans TRIzol <ol><li> À ce stade, vos échantillons doivent être remis en suspension dans du réactif Trizol et prêtes à être traitées. </li><li> Ajouter 200 ul de réactif PCA séparation de phase pour chaque 1 mL de Trizol dans chaque tube. Vous pouvez avoir besoin de transférer l&#39;échantillon à un plus grand tube, si vous êtes débutant avec une grande quantité de TRIzol. </li><li> Vortex ou secouer vigoureusement et incuber à température ambiante pendant 2-3 minutes. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 12 000 xg pendant 15 minutes. </li><li> Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube. La phase aqueuse est la couche claire sur le dessus. Vous devriez être en récupérer environ 600μL pour chaque 1 ml de Trizol vous avez commencé avec. </li><li> Faites une deuxième extraction phénol / chloroforme, en utilisant cette fois 500μL de chloroforme pour 1 ml TRIzol, au lieu de la BCP. </li><li> Vortex ou secouer vigoureusement et incuber à température ambiante pendant 2-3 minutes. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 12 000 xg pendant 15 minutes. </li><li> Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube. La phase aqueuse est la couche claire sur le dessus. </li><li> Ajouter 20 pg d&#39;acrylamide linéaire pour chaque échantillon. L&#39;acrylamide linéaire agit comme un transporteur et contribue à précipiter l&#39;ARN. </li><li> Ajouter 500 &amp; MiCRO; L d&#39;isopropanol pour 1 ml de Trizol vous avez commencé avec à chaque échantillon et bien mélanger. </li><li> Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes. </li><li> Centrifuger dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale pendant 10-15 minutes. </li><li> Le culot d&#39;ARN sera visible au fond du tube. Très soigneusement, éliminer le surnageant du tube, soit avec un aspirateur, ou manuellement par pipette. Ne pas perturber le culot. </li><li> Laver le culot avec 1 ml d&#39;éthanol à 70%. <ul style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Ajouter 1 ml d&#39;éthanol à 70% au culot. </li><li> Centrifuger à vitesse maximale 14 000 g pendant 5-7 minutes. </li><li> Très soigneusement, éliminer l&#39;éthanol à partir du tube, soit avec un aspirateur, ou manuellement par pipette. Vérifiez que la pastille est visible au fond du tube. </li><li> Jeter le surnageant. </li></ul></li><li> Répéter l&#39;étape de lavage. Après le surnageant est éliminé, marquer l&#39;endroit où culot est sur le tube. </li><li> Air culot sec pour pas plus de 5 minutes. Ne pas trop sécher, ou l&#39;ARN sera difficile à reconstituer! </li><li> Si vous souhaitez suivre le traitement optionnel DNase pour éliminer l&#39;ADN restant de l&#39;échantillon, resuspendre le culot dans 17μL d&#39;eau sans nucléase. Sinon, resuspendre le culot dans 20 pi d&#39;eau sans nucléase et continuer à l&#39;étape 22. </li><li> (Facultatif traitement à la DNase) Utilisation du Qiagen RNase-free DNase jeu, ajoutez 2μL tampon et 1 microlitre RDD reconstitué sans RNase DNase I de l&#39;ARN en suspension. Mélanger délicatement. </li><li> (Facultatif traitement à la DNase) Incuber à 37 ° C pendant 30 minutes. </li><li> (Facultatif traitement à la DNase) Ajouter 2μL de 2,5 mM d&#39;EDTA et incuber à 65 ° C pendant 5 minutes pour inactiver la DNase. Ne pas dépasser le temps d&#39;inactivation ou la température que plus les temps / températures élevées peut entraîner la dégradation de l&#39;ARN. </li><li> Vérifiez la concentration en ARN par spectrophotomètre. </li><li> Conserver l&#39;échantillon d&#39;ARN à -80 ° C. </li><li> (QC Facultatif) Vérifiez la qualité de l&#39;ARN en utilisant une BioAnalyzer Agilent, ou en exécutant l&#39;échantillon sur un gel dénaturant et en vérifiant les lectures de DO. (260 nm et 260/280 ratio) </li></ol>

<ol><li>KH, R. ubins, LE, H. ensley, GW, B. ell, Wang, C., EJ, L. efkowitz, PO, B. rown, DA, R. elman <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
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</ol>

Étapes critiques Partie 1 &amp; 2 Il ya plusieurs étapes essentielles à la mise en place d&#39;une infection synchrone de la vaccine, le premier en faisant attention de sonication (ou trypzinizing) du virus, afin de désagréger les particules virales. Vaccine est fortement sujette à l&#39;agrégation, et la perturbation des particules de virus est importante pour assurer même l&#39;infection de cellules. Afin d&#39;atteindre une infection synchrone, une MOI élevé (supér...

<table><tbody><tr><td>Réactif TRIzol</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Des réactifs similaires, tels que TriPure de Roche, fonctionnent également.</td></tr><tr><td>Réactif de séparation des phases BCP</td><td>Réactif</td><td>Molecular Research Center</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Kit d'ADNase sans RNase</td><td>Réactif</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>Le traitement par ADNase est une étape facultative.</td></tr></tbody></table>

infection virus de la vaccine et l&#39;analyse temporelle de l&#39;expression des gènes de virus: partie 1

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

La famille<em&gt; Poxviridae</em&gt; Se compose de grandes double-brin d&#39;ADN contenant des virus qui se répliquent exclusivement dans le cytoplasme des cellules infectées. Les membres de la<em&gt; Orthopoxvirus</em&gt; Genre comprennent la variole, l&#39;agent causal de la variole humaine, simienne, et la vaccine (ACC), le membre prototypique de la famille des virus. Dans le génome relativement importante (~ 200 ko) de la vaccine, trois classes de gènes sont encodés: précoce, intermédiaire et tardive. Alors que tous les trois classes sont transcrits par les ARN polymérases virale codée, chaque classe a une fonction différente dans le cycle de vie du virus. Les poxvirus utilisent de multiples stratégies pour la modulation de l&#39;environnement cellulaire de l&#39;hôte pendant l&#39;infection. Afin de comprendre la régulation de l&#39;hôte et l&#39;expression des gènes du virus, nous avons utilisé l&#39;échelle du génome des approches pour analyser l&#39;abondance transcription de deux virus et les cellules hôtes. Ici, nous démontrons infections cours du temps des cellules HeLa par le virus de la vaccine et de l&#39;ARN d&#39;échantillonnage à différents moments après l&#39;infection. Les deux hôtes et virales ARN total est isolé et amplifié pour que l&#39;hybridation des puces pour l&#39;analyse de l&#39;expression génique.

Protocole pour la vaccine infection de cellules HeLa et l&#39;analyse de l&#39;hôte et l&#39;expression des gènes viraux.

Infection virus de la vaccine et l&#39;analyse temporelle de l&#39;expression des gènes de virus: Partie 1

La famille des Poxviridae est composée de virus à ADN double brin de grande taille qui se répliquent exclusivement dans le cytoplasme des cellules infectées. Les membres de...

Les infections cinétiques de cellules HeLa à l'aide du virus de la vaccine commencent par la mise en place des infections virales, l'infection des cellules, puis la récupération de l'ARN à partir des cellules infectées à plusieurs points temporels après l'infection. Cet ARN peut ensuite être amplifié pour hybridation sur des puces à ADN afin d'analyser l'expression génique. Bonjour, je suis Judy Ann du laboratoire de Kate Irvins à l'Institut de recherche biomédicale Whitehead.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'infection en cours de temps avec le virus de la vaccine sur des cellules de mammifères, suivie de l'extraction d'ARN à partir des cellules infectées à différents moments après l'infection. Cette technique constitue une première étape d'un protocole plus vaste visant à extraire et amplifier l'ARN afin d'évaluer l'expression génique du virus durant l'infection, laquelle sera complétée dans deux autres vidéos de JoVE. Commençons donc. Pour préparer l'infection, faites croître des cellules HeLa dans des flacons et attendez que les cellules atteignent une confluence d'environ 80 %.Ensuite, assurez-vous de préparer suffisamment de milieu de croissance viral pour l'expérience. En utilisant un DMEM ordinaire contenant 2 % de FBS et sans antibiotiques ajoutés, l'infection peut être réalisée soit avec un stock de virus vaccinia recruté ayant un titre connu, soit avec un virus purifié par le saccharose ayant un titre connu. Si vous êtes préoccupé par l'expression des gènes de l'hôte et que vous utilisez un virus purifié par le saccharose, passez à la section suivante.Si vous utilisez un virus vaccinia brut, soniquez et aliquotez le virus juste avant l'infection, à l'aide d'un sonicateur à cuve contenant un bain principalement composé de glace et un peu d'eau, en utilisant environ 30 W pendant 20 secondes. Vortexez le tube et répétez la sonication trois fois, en ajoutant plus de glace si nécessaire pour maintenir la cuve bien remplie de glace et au frais ; veillez à effectuer un vortex entre chaque étape de sonication. Si vous ne disposez pas d'un sonicateur à cuve, mélangez un volume égal du stock de virus brut avec 25 milligrammes par millilitre.Agiter vigoureusement au vortex la trypsine, puis incuber le stock viral et mélanger dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Vortexer à des intervalles de cinq à dix minutes pour infecter les cellules. Calculez d'abord la quantité de particules virales nécessaire pour infecter la monocouche à la multiplicité d'infection souhaitée.Ou MOI. Typiquement, un MOI élevé compris entre cinq et 10 est utilisé pour les cinétiques d'infection. Ensuite, ajouter la quantité souhaitée de virus purifié par saccharose ou de virus brut traité à la trypsine au milieu de croissance viral préchauffé à 37 degrés Celsius et mélanger soigneusement.Vous devez utiliser suffisamment de milieu pour recouvrir juste le fond du flacon. 10 millilitres de milieu suffisent pour un flacon T 175. Retirez le milieu des cellules et rincez avec du PBS à température ambiante.Ajoutez le virus ou le milieu de croissance viral à chaque flacon pour un point temporel témoin à zéro heure. Ajoutez uniquement le milieu de croissance viral, sans virus, puis agitez doucement et inclinez les plaques. Incubez à 37 degrés Celsius dans un incubateur avec 5 % de CO2 pendant une heure. Veillez à incliner et agiter les plaques toutes les 15 minutes afin de répartir uniformément le virus et de maintenir les cellules humides.Après l'incubation, retirez le milieu contenant le virus et rincez trois fois avec du PBS à température ambiante. Ajoutez la quantité maximale de milieu de croissance viral dans chaque flacon.Par exemple, 30 millilitres de milieu pour un flacon T 175. Vous pouvez commencer à compter ce moment comme votre point temporel zéro au moment souhaité après l'infection. Vérifiez les cellules au microscope et notez tout effet cytopathogène ou ECP.Retirer le milieu et rincer les cellules avec 30 millilitres de PBS à température ambiante. Ensuite, ajouter 15 millilitres de trypsine aux cellules et incuber de deux à cinq minutes. À 37 degrés Celsius, vérifier au microscope le détachement des cellules et tapoter doucement le flacon pour détacher les cellules.Transférez les cellules à l’aide d’une pipette sérologique stérile dans un tube conique de 50 millilitres. Lavez le flacon avec un volume équivalent de milieu de croissance cellulaire et ajoutez le milieu aux cellules traitées à la trypsine dans le tube conique. Centrifugez les cellules à 500 G pendant cinq minutes à température ambiante.Après la centrifugation, retirez le milieu tryin du culot cellulaire, resuspendez le culot cellulaire, puis ajoutez soit le réactif triol soit le tampon de lyse de votre kit d'isolement d'ARN choisi. Si vous utilisez le triol, divisez l'échantillon en aliquots de un millilitre dans des tubes Eppendorf de 1,5 millilitre étiquetés et congélez à moins 80 degrés Celsius. Répétez pour tous les points temporels.Récolte d’un flacon par point temporel. À ce stade, votre échantillon doit être mis en suspension dans le réactif triol et prêt à être traité. Ajoutez 200 microlitres du réactif de séparation des phases BCP.Pour chaque millilitre de triol dans chaque tube, le BCP ou le bromo trois chloro propane est utilisé à la place du phénol. Pour réduire la contamination par l'ADN génomique, vous devrez peut-être transférer l'échantillon dans un tube plus grand. Si vous partez d'une grande quantité de triol, vortexez ou agitez vigoureusement, puis incubez à température ambiante pendant deux à trois minutes ; après l'incubation, centrifugez l'échantillon à 12 000 ×g pendant 15 minutes.Une phase acqueuse doit être visible comme une couche claire en surface. Transférez la phase acqueuse dans un tube propre. Vous devriez récupérer environ 600 microlitres pour chaque millilitre de triazole utilisé au départ.Réalisez une deuxième extraction au phénol-chloroforme. Cette fois, utilisez 500 microlitres de chloroforme par millilitre de triazole au lieu de BCP. La deuxième extraction au chloroforme permet d'éliminer toute trace de solvant organique provenant de l'extraction, car même des quantités infimes peuvent inhiber les étapes ultérieures d'amplification.Vortexez ou agitez vigoureusement, puis incubez à température ambiante pendant deux à trois minutes. Centrifugez l'échantillon à 12 000 ×g pendant 15 minutes après la centrifugation. Transférez la phase supérieure dans un tube propre.N'oubliez pas que la phase aqueuse est la couche claire supérieure. Ensuite, ajoutez 20 microgrammes d'acrylamide linéaire à chaque échantillon. L'acrylamide linéaire agit comme un porteur et aide à précipiter l'ARN.Ajouter 500 microlitres d'isopropanol par millilitre de triol utilisé initialement à chaque échantillon et mélanger. Incuber soigneusement les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes, puis centrifuger dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale pendant 10 à 15 minutes. Le culot d'ARN sera visible au fond du tube après la centrifugation.Retirez très soigneusement le surnageant du tube à l’aide d’un aspirateur à vide ou manuellement à l’aide d’une pipette. N’agitez pas le culot. Lavez le culot avec un millilitre d’éthanol à 70 % et centrifugez à vitesse maximale pendant cinq à sept minutes.Avec la plus grande précaution, retirez l'éthanol du tube soit à l’aide d’un aspirateur sous vide, soit manuellement à l’aide d’une pipette. Jetez le surnageant.Vérifiez que le culot est visible au fond du tube. Répétez cette étape de lavage après avoir éliminé le surnageant. Marquez l'emplacement du culot sur le tube.Laisser sécher l'air du culot pendant un maximum de cinq minutes. Ne pas trop sécher, sinon l'ARN sera difficile à reconstituer. Ensuite, si un traitement de l'ADN est prévu, suspendre le culot dans 17 microlitres d'eau exempte de nucléase.Si le traitement D'S n'est pas prévu, resuspendre dans 20 microlitres. Pour le traitement D'S, utiliser le kit KaiGen ADN sans ARN. Ajouter deux microlitres de tampon RDD et un microlitre d'ARNs sans ARN reconstitués.Incubez l'ADN à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes dans le mélange d'ARN resuspendu, en mélangeant délicatement. Ensuite, ajoutez deux microlitres d'EDTA 2,5 millimolaire et incubez à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour inactiver l'ADN, ne dépassez pas le temps ou la température d'inactivation, car des durées plus longues ou des températures plus élevées peuvent provoquer une dégradation de l'ARN.Vous avez maintenant terminé le traitement de l'ADN. Vérifiez la concentration en ARN à l'aide d'un spectrophotomètre. La présence de traces de phénol ou de BCP peut être détectée sous forme d'un pic à 270 nanomètres, en sus du pic standard à 260 nanomètres.Lors de la mesure de l'absorbance de l'ARN total après extraction, si une telle contamination apparaît, reprenez l'extraction de l'ARN en utilisant une méthode d'extraction par filtration ou par colonne avant de procéder à l'amplification. Vous pouvez conserver l'échantillon d'ARN à moins 80 degrés Celsius. Si vous le souhaitez, vous pouvez vérifier la qualité de l'ARN en utilisant un bioanalyseur Agilent ou en faisant migrer l'échantillon sur un gel dénaturant et en examinant les lectures d'OD sur le bioanalyseur.Une bonne qualité de l'ARN est indiquée par le nombre d'intégrité de l'ARN ou RIN. Le RIN repose sur un système de notation allant de un à dix, un correspondant au profil le plus dégradé et dix au profil le plus intact. Nous venons de vous montrer comment réaliser une infection en cours de temps avec le virus de la vaccine et comment extraire l'ARN des cellules infectées à différents points temporels après l'infection.Lors de cette procédure, il est important de garder à l'esprit qu'il existe plusieurs étapes critiques pour établir une infection synchrone par le virus vaccinal. Tout d'abord, une sonication soigneuse ou une trypsination du virus. Il est essentiel de désagréger les particules virales, car le virus vaccinia a une forte tendance à s'agréger, ce qui empêcherait une infection uniforme des cellules.Deuxièmement, afin d'obtenir une infection asynchrone, un taux de multiplicité d'infection (MOI) supérieur à deux doit être utilisé afin de garantir l'infection de chaque cellule. Un mélange de cellules infectées et non infectées entraînera plusieurs cycles d'infection, des mélanges hétérogènes de points temporels et des réponses transcriptionnelles virales et cellulaires asynchrones. Troisièmement, l'infection doit être réalisée avec des volumes minimaux de milieu afin de permettre une absorption maximale du virus par les cellules.En outre, un agitation régulière du flacon ou des boîtes de culture toutes les 10 minutes permet une répartition uniforme du virus dans le flacon et garantit que les cellules ne s'assèchent pas. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.Veillez à regarder les autres vidéos de cette série dans lesquelles nous montrons la procédure d'amplification linéaire des échantillons d'ARN ainsi que la préparation et la purification de l'ARN marqué par fluorescence.

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L&#39;infection ex vivo de tissus vivants avec des virus oncolytiques

Nous décrivons un protocole pour identifier les rôles clés des molécules de l'hôte de signalisation dans la réplication lytique d'un virus de l'herpès modèle, gamma herpèsvirus 68 (γHV68). L'utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées et des fibroblastes embryonnaires de γHV68 réplication lytique, le protocole permet à la fois la caractérisation phénotypique et moléculaire de l'interrogatoire interactions virus-hôte dans la réplication virale lytique.

Dissection hôte-virus interaction dans la réplication lytique d&#39;un virus de l&#39;herpès modèle

Procédé de traçage neurones connectés synaptique est décrit. On utilise la spécificité de la TVA une cellule amont pour sonder si une population cellulaire d'intérêt synaptique reçoit une entrée à partir de types de cellules génétiquement déterminées.

Viral traçage des circuits neuronaux génétiquement déterminées

Un protocole rapide et modulaire pour la génération de virus de vaccinia recombinants exprimant des protéines fluorescentement marquées simultanément utilisant la méthode de sélection dominante transitoire est décrit ici.

Méthodologie pour la génération efficace de protéines du virus de la vaccine marquées par fluorescence

Nous décrivons l'utilisation d'un virus de la vaccine rapporteur fluorescent qui permet la mesure en temps réel de l'infectivité virale et l'expression des gènes par le biais de l'expression spécifique au stade de fluorophores spectralement distincts rapporteurs. Nous détaillons une méthode basée plaque pour identifier avec précision l'étape à laquelle la réplication du virus est affecté en réponse à petite molécule inhibition.

Reporter vaccine virus pour quantifier la fonction virale à toutes les étapes de l&#39;expression des gènes

virus de la vaccine (VV) a été largement utilisé dans la recherche biomédicale et l'amélioration de la santé humaine. Cet article décrit une méthode simple, très efficace pour modifier le génome de VV en utilisant un système CRISPR-cas9.

Une approche simple et efficace de construire Mutant Vaccinia vecteurs de virus

Nous présentons ici les protocoles afin d’identifier les immunomodulateurs 1) virus codé qui favorisent la réplication arbovirus et facteurs de l’hôte 2) eucaryotes que restreignent la réplication des arbovirus. Ces méthodes à base de fluorescence et de luminescence aux chercheurs d’obtenir rapidement des afficheurs quantitatives de réplication arbovirus dans les essais simplistes avec des rapports signal sur bruit faibles.

Arbovirus Infections comme outils de dépistage pour l’Identification des virales facteurs antiviraux immunomodulateurs et hôte

ICP0 subit une translocation nucléaire-à-cytoplasmique au cours de l’infection par HSV-1. On ne connaît pas le mécanisme moléculaire de cet événement. Nous décrivons ici l’utilisation du microscope confocal comme un outil permettant de quantifier le mouvement ICP0 dans l’infection HSV-1, qui jette les bases pour l’analyse quantitative ICP0 translocation dans de futures études mécanistes.

Analyse temporelle de la Translocation nucléaire-à-cytoplasmique d’une Herpès Simplex Virus 1 protéine par microscopie confocale par immunofluorescence

Apprenez à infecter des cellules HeLa avec le virus vaccinia et à extraire l'ARN à différents points temporels pour analyser l'expression génique virale et de l'hôte.

Infection virus de la vaccine et l'analyse temporelle de l'expression des gènes de virus: Partie 1

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