Name: Infection virus de la vaccine et lanalyse temporelle de lexpression des gènes de virus: Partie 2 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Découvrez la synthèse d'ADNc à partir d'ARN isolé de cellules HeLa infectées par le virus vaccinia. Cette méthode permet d'amplifier l'ARN viral pour l'analyse microarray de l'expression génique.

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Partie 1: synthèse de l&#39;ADNc de l&#39;ARN <ol><li> Avant d&#39;utiliser le Ambion Amino Allyl MessageAmp II kit, ajouter la quantité recommandée d&#39;éthanol à 100% pour les tampons de lavage. </li><li> Dans le tube de réaction PCR, ajouter entre 100 ng d&#39;ARN total de 5 ug et 1 microlitre de T7 oligo (dT) primer. Porter le volume à 12μl avec une eau sans nucléase. </li><li> Incuber les échantillons à 70 ° C pendant 10 min dans un thermocycleur. </li><li> Retirer les échantillons d&#39;ARN à partir de 70 ° C et centrifuger brièvement. Placez-le sur la glace. </li><li> Préparer le 1 er volet de synthèse master mix et de conserver à température ambiante (avec excédent de 10% pour le pipetage d&#39;erreur). (Tableau 1) </li><li> Mélanger délicatement la pipette ou feuilleter Maître de mélanger, puis centrifuger brièvement. </li><li> Transfert de l&#39;8μl Master Mix pour chaque échantillon d&#39;ARN. Mélanger par aspiration et refoulement 3-4 fois. </li><li> Incuber à 42 ° C pendant 2 heures dans un thermocycleur. </li><li> Centrifuger les échantillons brièvement et placer sur la glace. Procéder immédiatement à l&#39;étape suivante de la synthèse des ADN double brin. </li><li> Préparer le 2 ème volet maîtrise de synthèse mélange sur la glace (avec excédent de 10% pour le pipetage d&#39;erreur). (Tableau 2) </li><li> Mélanger délicatement la pipette ou feuilleter Maître de mélanger, puis centrifuger brièvement. </li><li> Transfert 80μl à chaque échantillon et mélanger délicatement par aspiration et refoulement 3-4 fois. </li><li> Incuber à 16 ° C pendant 2 heures dans un thermocycleur. </li><li> Après l&#39;incubation de 2 heures, procéder à l&#39;ADNc de nettoyage étape ou congeler immédiatement à -20 ° C. </li></ol> Partie 2: l&#39;ADNc double brin de nettoyage <ol><li> Retirez la pure ADNc du réfrigérateur et le laisser se stabiliser à la température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation. Agitez la bouteille pour bien remettre en suspension les perles magnétiques ADNc contraignante avant l&#39;utilisation. </li><li> Aliquoter eau sans nucléase dans un tube de 1,5 ml et incuber à 50-60 ° C pendant au moins 10 minutes pendant l&#39;incubation précédentes 2hr. </li><li> Ajouter 180μl de Pure ADNc de chaque échantillon, et bien mélanger par pipetage de haut en bas. Transférer les échantillons à un 96-même à fond rond assiette. </li><li> Continuer à mélanger les échantillons en agitant la plaque sur un agitateur orbital pendant au moins 2 minutes. </li><li> Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Laisser la plaque sur le stand pendant environ 6 minutes ou jusqu&#39;à ce que le mélange devient transparent et les perles à caractère contraignant ont granulés. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant. </li><li> Retirer la plaque du socle magnétique. </li><li> Ajouter 150μl de tampon de lavage d&#39;ADNc dans chaque puits et agiter la plaque pendant 1 minute sur l&#39;agitateur orbital à vitesse modérée. Perles va se dispersent pas à cette étape, en raison de la faible tension de surface du tampon de lavage. </li><li> Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant. </li><li> Retirer la plaque du socle magnétique. </li><li> Répéter le lavage une 2 ème fois avec 150μl de tampon de lavage d&#39;ADNc. </li><li> Après le lavage 2 ème, sécher les perles en secouant la plaque pendant 2 minutes sur l&#39;agitateur orbital à la vitesse maximale. Ne pas trop sécher! </li><li> Éluer l&#39;ADNc à partir des billes en ajoutant 18μl de l&#39;préchauffé eau sans nucléase à chaque échantillon. </li><li> Secouez vigoureusement la plaque pendant 3 minutes sur l&#39;agitateur orbital, puis vérifiez que les billes magnétiques sont totalement dispersés. Sinon, continuez secouant. </li><li> Une fois que les billes magnétiques ont complètement dispersé, déplacer la plaque d&#39;un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. </li><li> Soigneusement transfert de l&#39;ADNc élué (~ 16μl) d&#39;une nouvelle plaque PCR (ou tubes PCR). </li><li> Passez directement à l&#39;étape suivante, ou geler l&#39;ADNc à -20 ° C. </li></ol> Partie 3: transcription in vitro (IVT) <ol><li> Préparer le mélange maître IVT à température ambiante. (Tableau 3) </li><li> Délicatement la pipette du Master Mix ou à cran de se mélanger, et centrifuger brièvement. </li><li> Ajouter 24μl de chaque échantillon, et mélanger délicatement par aspiration et refoulement 3-4 fois. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 14 heures dans un thermocycleur, puis maintenez à 4 ° C jusqu&#39;au moment de l&#39;étape suivante. </li></ol> Partie 4: ARNa nettoyage après IVT <ol><li> Vortex les perles liaison à l&#39;ARN brièvement pour obtenir un mélange homogène avant utilisation. </li><li> Préparer le ARNa Mix reliure à température ambiante (tableau 4) Cela peut être fait à l&#39;avance -. Le mélange préparé contraignantes peuvent être stockés à température ambiante pendant jusqu&#39;à une semaine. </li><li> Mélangez bien au vortex. </li><li> Aliquoter le tampon d&#39;élution ARNa dans un tube de 1,5 ml et incuber à 50-60 ° C pendant au moins 10 minutes. </li><li> Ajouter 70μl de l&#39;ARNa mélange de liantà chaque échantillon et bien mélanger par pipetage haut et en bas de 3-4 fois. </li><li> Transférer les échantillons de la plaque PCR de 96 puits à fond rond assiette. </li><li> Ajouter 50 pl de 100% d&#39;isopropanol à chaque échantillon et bien mélanger par pipetage haut et en bas de 3-4 fois. </li><li> Secouez doucement la plaque sur un agitateur orbital pendant au moins 2 minutes pour bien mélanger les échantillons. </li><li> Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Laisser la plaque sur le stand jusqu&#39;à ce que le mélange devient transparent et les perles à caractère contraignant ont granulés. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant. </li><li> Retirer la plaque du socle magnétique. </li><li> Ajouter 100 ul Solution Laver ARNa dans chaque puits et agiter la plaque pendant 1 minute sur l&#39;agitateur orbital à vitesse modérée. Perles peut pas entièrement se dispersent à cette étape. </li><li> Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant. </li><li> Retirer la plaque du socle magnétique. </li><li> Répétez le laver une fois 2 ème avec 100 ul Solution Laver ARNa. </li><li> Après le lavage 2 ème, sécher les perles en secouant la plaque pendant 1 minute sur l&#39;agitateur orbital à la vitesse maximale. Ne pas trop sécher les échantillons! </li><li> Eluer la ARNa des billes en ajoutant 40μl de tampon d&#39;élution préchauffé ARNa à chaque échantillon. </li><li> Secouez vigoureusement la plaque sur l&#39;agitateur orbital pendant 3 minutes, puis vérifiez que les billes magnétiques sont totalement dispersés. Sinon, continuez secouant. </li><li> Une fois que les billes magnétiques ont complètement dispersé, déplacer la plaque d&#39;un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Le surnageant contient les ARNa nettoyé aminés allyle incorporé. </li><li> Soigneusement transférer le ARNa élué à une nouvelle plaque PCR (ou tubes PCR). </li><li> (Étape facultative) Vérifiez la concentration en ARN des échantillons en mesurant 1.5μl sur un spectrophotomètre NanoDrop. </li><li> Immédiatement continuer sur la prochaine étape, ou de stocker l&#39;ARNa à -80 ° C. </li></ol> Tableau 1: Volet 1 er ADNc Synthèse Mix Master <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Montant pour une réaction </td></tr><tr><td> Tampon 10X First Strand </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> Inhibiteur de la ribonucléase </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> Script tableau </td><td> 1 pl </td></tr></tbody></table> Tableau 2: ADNc 2 ème volet Maître Synthèse Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Montant pour une réaction </td></tr><tr><td> Eau sans nucléase </td><td> 63 ul </td></tr><tr><td> Tampon 10X deuxième brin </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> ADN polymérase </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> RNase H </td><td> 1 pl </td></tr></tbody></table> Tableau 3: IVT Mix Master <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Montant pour une réaction </td></tr><tr><td> aaUTP solution (75 mM) </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> ATP, CTP, GTP mélange (25 mM) </td><td> 12 ul </td></tr><tr><td> T7 UTP solution (75 mM) </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> Tampon de réaction 10X T7 </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> T7 Enzyme Mix </td><td> 4 pl </td></tr></tbody></table> Tableau 4: Mélanger ARNa reliure <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Montant pour une réaction </td></tr><tr><td> Perles liaison à l&#39;ARN * </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> * Remise en suspension de billes Solution </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> 100% d&#39;isopropanol ** </td><td> 6 pl </td></tr><tr><td> Concentré ARNa Binding Buffer </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table> * Mélanger les perles liaison à l&#39;ARN avec la solution resuspension premier talon. ** Ajouter l&#39;isopropanol et bien mélanger avant d&#39;ajouter le concentré de tampon de liaison ARNa.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Étapes critiques Un second tour de l&#39;amplification n&#39;est pas conseillé que des biais dans les données array ont été observées. Mélanger soigneusement à chaque étape enzymatique (1 er et 2 ème synthèse brin d&#39;ADNc, IVT) est essentielle à l&#39;obtention de rendements d&#39;amplification bon, tout comme l&#39;incubation de chaque étape enzymatique à la température appropriée. Un cycleur PCR avec couvercle chauffant réglable est préféré - les écarts, même aussi p...

<table><tbody><tr><td>Kit d'amplification d'ARNm Amino Allyl MessageAmp II</td><td>Réactif</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1753</td><td>Pour 20 réactions</td></tr><tr><td>Kit d'amplification d'ARNm Amino Allyl MessageAmp II</td><td>Réactif</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1821</td><td>Pour 100 réactions, au format 96 puits</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre UV-VIS NanoDrop ND-1000</td><td>Autre</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>Ou spectrophotomètre équivalent</td></tr></tbody></table>

infection virus de la vaccine et l&#39;analyse temporelle de l&#39;expression des gènes de virus: partie 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

La famille<em&gt; Poxviridae</em&gt; Se compose de grandes double-brin d&#39;ADN contenant des virus qui se répliquent exclusivement dans le cytoplasme des cellules infectées. Les membres de la<em&gt; Orthopoxvirus</em&gt; Genre comprennent la variole, l&#39;agent causal de la variole humaine, simienne, et la vaccine (ACC), le membre prototypique de la famille des virus. Dans le génome relativement importante (~ 200 ko) de la vaccine, trois classes de gènes sont encodés: précoce, intermédiaire et tardive. Alors que tous les trois classes sont transcrits par les ARN polymérases virale codée, chaque classe a une fonction différente dans le cycle de vie du virus. Les poxvirus utilisent de multiples stratégies pour la modulation de l&#39;environnement cellulaire de l&#39;hôte pendant l&#39;infection. Afin de comprendre la régulation de l&#39;hôte et l&#39;expression des gènes du virus, nous avons utilisé l&#39;échelle du génome des approches pour analyser l&#39;abondance transcription de deux virus et les cellules hôtes. Ici, nous démontrons infections cours du temps des cellules HeLa par le virus de la vaccine et de l&#39;ARN d&#39;échantillonnage à différents moments après l&#39;infection. Les deux hôtes et virales ARN total est isolé et amplifié pour que l&#39;hybridation des puces pour l&#39;analyse de l&#39;expression génique.

Protocole pour la vaccine infection de cellules HeLa et l&#39;analyse de l&#39;hôte et l&#39;expression des gènes viraux.

Infection virus de la vaccine et l&#39;analyse temporelle de l&#39;expression des gènes de virus: Partie 2

La famille des Poxviridae se compose de virus à ADN double brin de grande taille qui se répliquent exclusivement dans le cytoplasme des cellules infectées. Les membres de...

Bonjour, je suis Judy Yen du laboratoire de Kate Rubins à l'Institut Whitehead pour la recherche biomédicale. Après avoir infecté des cellules HeLa avec le virus de la vaccine et isolé l'ARN total, comme indiqué dans un protocole vidéo JoVE précédent, l'ARN viral peut être isolé et amplifié par transcription inverse et transcription in vitro. L'ARN amplifié sera ensuite utilisé dans une analyse par puces à ADN de l'expression des gènes viraux et de l'hôte. Commençons donc.Pour commencer cette synthèse d'ADNc à partir de l'ARN, ajoutez le volume recommandé d'éthanol à cent pour cent aux tampons de lavage avant d'utiliser le kit ambient amino allele message AMP deux dans un tube de réaction PCR. Ajoutez entre 100 nanogrammes et cinq microgrammes d'ARN total et un microlitre d'amorce oligo T sept. Ajustez le volume à 12 microlitres avec de l'eau sans nucléase. Incubez les échantillons à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes dans un thermocycleur.Ensuite, retirez les échantillons d'ARN du centrifugeuse à 70 degrés Celsius. Brièvement, après la centrifugation, placez les échantillons sur de la glace. Préparez le mélange maître de synthèse du brin complémentaire avec un excès de volume de 10 % pour compenser les erreurs de pipetage.Laissez-le à température ambiante, pipetez délicatement le mélange maître ou agitez doucement pour homogénéiser, puis centrifugez brièvement. Après la centrifugation, transférez huit microlitres du mélange maître dans chaque échantillon d'ARN en mélangeant par aspiration et expulsion trois à quatre fois, puis incubez à 42 degrés Celsius pendant deux heures dans un thermocycleur. Après l'incubation, centrifugez brièvement les échantillons et placez-les immédiatement sur de la glace. Passez sans délai à l'étape suivante de la synthèse de l'ADN double brin (dsADN).Préparez le mélange maître pour la synthèse du brin complémentaire sur de la glace avec un excès de volume de 10 % pour compenser les erreurs de pipetage ; pipetez délicatement le mélange maître ou agitez doucement le tube, puis centrifugez brièvement. Transférez 80 microlitres dans chaque échantillon et mélangez délicatement en aspirant et en rejetant la solution trois à quatre fois. Incubez à 16 degrés Celsius pendant deux heures dans le thermocycleur.Après une incubation de deux heures, procédez à l'étape de purification de l'ADNc ou congélez immédiatement à moins 20 degrés Celsius. Pour commencer la purification de l'ADNc double brin, sortez d'abord le réactif ADNc pur du réfrigérateur et laissez-le équilibrer à température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation. Secouez le flacon pour redisperser complètement les billes magnétiques de liaison à l'ADNc avant usage. Aliquotez de l'eau sans nucléase dans un tube de 1,5 millilitre et incubez à 50 à 60 degrés Celsius pendant au moins 10 minutes.Au cours de l'incubation précédente de deux heures, ajouter 180 microlitres de CD NA pure à chaque échantillon et mélanger soigneusement en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Transférer les échantillons dans une plaque de 96 puits à fond rond. Une fois les échantillons transférés dans la plaque, continuer à les mélanger en agitant doucement la plaque sur un agitateur orbital pendant au moins deux minutes.Déplacez la plaque sur un support magnétique afin de capturer les billes magnétiques. Laissez la plaque sur le support pendant environ six minutes ou jusqu’à ce que le mélange devienne transparent et que les billes de liaison soient regroupées au fond. Aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’un aspirateur sous vide sans perturber les billes magnétiques.Alternativement, retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette et jetez le surnageant. Une fois le surnageant éliminé, retirez la plaque de l’aimant. Ajoutez ensuite 150 microlitres de tampon de lavage d’ADNc dans chaque puits et agitez la plaque pendant une minute sur l’agitateurboule à vitesse modérée.Les billes ne se disperseront pas à cette étape en raison de la faible tension superficielle du tampon de lavage. Après agitation, remettez la plaque sur un support magnétique. Pour capturer les billes magnétiques, aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’un aspirateur sous vide sans perturber les billes magnétiques.Ou retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette et jetez le surnageant. Retirez la plaque du support magnétique. Répétez le lavage une deuxième fois avec 150 microlitres de tampon de lavage d’ADNc.Après le deuxième lavage, séchez les billes en agitant la plaque pendant deux minutes sur l'agitateurboule à vitesse maximale. Il est important de ne pas laisser les billes trop sécher. Ensuite, éluerez l'ADNc des billes en ajoutant vigoureusement 18 microlitres d'eau sans nucléase préchauffée à chaque échantillon.Agiter la plaque pendant trois minutes sur l'agitateurboule. Vérifier ensuite que les billes magnétiques sont complètement dispersées. Si ce n'est pas le cas, poursuivre l'agitation.Une fois que les billes magnétiques sont complètement dispersées, déplacez la plaque sur un support magnétique. Pour capturer les billes magnétiques, transférez soigneusement l'ADN éludé vers une nouvelle plaque PCR ou des tubes PCR. Vous devriez récupérer environ 16 microlitres de l'éluant par échantillon.Passer directement à l'étape suivante ou congeler l'ADNc à moins 20 degrés Celsius. Préparer le mélange maître d'IVT à température ambiante. Mélanger délicatement le mélange maître à l'aide d'une pipette ou par légères secousses, puis centrifuger brièvement.Après la centrifugation, ajouter 24 microlitres à chaque échantillon et mélanger doucement en pipetant de haut en bas trois à quatre fois, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant 14 heures dans un thermocycleur. Ensuite, conserver à 4 degrés Celsius jusqu'au moment de passer à l'étape suivante. Vortexer brièvement les billes de liaison à l'ARN pour obtenir un mélange homogène avant utilisation. Préparer le mélange de liaison A à l'ARN à température ambiante.Cela peut être fait à l'avance. Le mélange de liaison préparé peut être conservé à température ambiante pendant jusqu'à une semaine. Mélanger soigneusement par vortex, aliquoter le tampon d'élution d'ARN A dans un tube de 1,5 millilitre et incuber à 50 à 60 degrés Celsius pendant au moins 10 minutes.À présent, ajoutez 70 microlitres du mélange de liaison A RNA à chaque échantillon et mélangez soigneusement en aspirant et en rejetant trois à quatre fois à l’aide d’une pipette. Transférez les échantillons depuis la plaque PCR vers une plaque à 96 puits en fond rond. Ensuite, ajoutez 50 microlitres d’isopropanol à cent pour cent à chaque échantillon et mélangez soigneusement en aspirant et en rejetant trois à quatre fois à l’aide d’une pipette.Agiter doucement la plaque sur un agitateur orbital pendant au moins deux minutes. Pour mélanger complètement les échantillons, déplacer la plaque sur un support magnétique afin de capturer les billes magnétiques.Laisser la plaque sur le support jusqu'à ce que le mélange devienne transparent et que les billes de liaison se soient regroupées au fond. Une fois les billes regroupées, aspirer soigneusement le surnageant à l’aide de l’aspirateur sous vide sans perturber les billes magnétiques. Sinon, retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette et jeter le surnageant.Retirer la plaque du support magnétique. Ensuite, ajouter 100 microlitres d'une solution de lavage de l'ARN dans chaque puits et agiter la plaque pendant une minute sur l'agitateuse orbitale à vitesse modérée, sans que les billes aient besoin de se disperser complètement. À cette étape, déplacer la plaque vers un support magnétique.Pour capturer les billes magnétiques. Aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’un aspirateur sous vide sans perturber les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette et jetez le surnageant.Une fois le surnageant éliminé, retirez la plaque du support magnétique. Répétez le lavage une deuxième fois avec 100 microlitres d'une solution de lavage pour ARN. Après le deuxième lavage, séchez les billes en agitant la plaque pendant une minute sur l'agitateurmagnétique à vitesse maximale.N'oubliez pas de ne pas trop sécher les échantillons. Éluerez l'ARN A des billes en ajoutant 40 microlitres du tampon d'élution d'ARN A préchauffé à chaque échantillon. Agitez vigoureusement la plaque sur l'agitateurbouleuse pendant trois minutes. Vérifiez ensuite que les billes magnétiques sont complètement dispersées.Sinon, poursuivez l'agitation. Une fois que les billes magnétiques sont complètement dispersées, déplacez la plaque sur un support magnétique afin de capturer les billes magnétiques. Le surnageant contient l'allèle amino purifié, incorporant un ARN.Transférez soigneusement l'ARN élué vers une nouvelle plaque PCR ou des tubes PCR. À ce stade, vous pouvez vérifier la concentration en ARN des échantillons en mesurant 1,5 µL sur un spectrophotomètre NanoDrop. Poursuivez immédiatement avec l'étape suivante ou conservez l'ARN à −80 °C.Nous venons de vous montrer comment marquer par fluorescence des échantillons d'ARN incorporant l'allèle immuno amplifié pour l'hybridation sur microréseaux. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler qu'un deuxième cycle d'amplification n'est pas recommandé. Comme des biais et des données de puces ont été observés, il est également important de bien mélanger soigneusement à chaque étape enzymatique, y compris pour la première et la deuxième brin.La synthèse d'ADNc, ou l'étape de transcription in vitro (IVT), est cruciale pour obtenir de bons rendements d'amplification, tout comme l'incubation de chaque étape enzymatique à la température appropriée. Un thermocycleur doté d'un couvercle chauffant réglable est préférable, car même des écarts aussi faibles que deux à trois degrés pendant la transcription in vitro dans un four d'hybridation à air ou un bain d'hybridation à eau peuvent affecter significativement le rendement du produit amplifié.Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences. N'hésitez pas à regarder les autres vidéos de cette série, dans lesquelles nous montrons comment réaliser une infection en cours de temps avec le virus de la vaccine, l'extraction d'ARN à partir des échantillons, ainsi que la préparation et la purification d'ARN marqué par fluorescence.

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Protocole pour la vaccine infection de cellules HeLa et l'analyse de l'hôte et l'expression des gènes viraux.

Infection virus de la vaccine et l&#39;analyse temporelle de l&#39;expression des gènes de virus: Partie 1

Protocole pour la vaccine infection de cellules HeLa et l'analyse de l'hôte et l'expression des gènes viraux. Partie 3 décrit le processus d'étiquetage de l'ARN par fluorescence amplifié à partir de l'hôte et des échantillons viraux par le couplage d'allyle aminés de colorants.

Infection virus de la vaccine et l&#39;analyse temporelle de l&#39;expression des gènes de virus: Partie 3

Facteurs de l'hôte roman impliqués dans l'infection virale peuvent être identifiés par la cellule basée échelle du génome perte de fonction ARNi dépistage.

Dépistage ARNi pour les facteurs de l&#39;hôte impliqués dans Vaccine</emVirus Infection> aide Drosophile Cellules

Les virus oncolytiques sont prometteurs pour traiter le cancer. La capacité de vérifier l'infectabilité des échantillons de tissus provenant de patients vivent avant le traitement est un avantage unique de cette approche thérapeutique. Ce protocole décrit comment traiter les tissus pour...

L&#39;infection ex vivo de tissus vivants avec des virus oncolytiques

Nous décrivons un protocole pour identifier les rôles clés des molécules de l'hôte de signalisation dans la réplication lytique d'un virus de l'herpès modèle, gamma herpèsvirus 68 (γHV68). L'utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées et des fibroblastes embryonnaires de γHV68 réplication lytique, le protocole permet à la fois la caractérisation phénotypique et moléculaire de l'interrogatoire interactions virus-hôte dans la réplication virale lytique.

Dissection hôte-virus interaction dans la réplication lytique d&#39;un virus de l&#39;herpès modèle

Procédé de traçage neurones connectés synaptique est décrit. On utilise la spécificité de la TVA une cellule amont pour sonder si une population cellulaire d'intérêt synaptique reçoit une entrée à partir de types de cellules génétiquement déterminées.

Viral traçage des circuits neuronaux génétiquement déterminées

Un protocole rapide et modulaire pour la génération de virus de vaccinia recombinants exprimant des protéines fluorescentement marquées simultanément utilisant la méthode de sélection dominante transitoire est décrit ici.

Méthodologie pour la génération efficace de protéines du virus de la vaccine marquées par fluorescence

Nous décrivons l'utilisation d'un virus de la vaccine rapporteur fluorescent qui permet la mesure en temps réel de l'infectivité virale et l'expression des gènes par le biais de l'expression spécifique au stade de fluorophores spectralement distincts rapporteurs. Nous détaillons une méthode basée plaque pour identifier avec précision l'étape à laquelle la réplication du virus est affecté en réponse à petite molécule inhibition.

Reporter vaccine virus pour quantifier la fonction virale à toutes les étapes de l&#39;expression des gènes

Nous présentons ici les protocoles afin d’identifier les immunomodulateurs 1) virus codé qui favorisent la réplication arbovirus et facteurs de l’hôte 2) eucaryotes que restreignent la réplication des arbovirus. Ces méthodes à base de fluorescence et de luminescence aux chercheurs d’obtenir rapidement des afficheurs quantitatives de réplication arbovirus dans les essais simplistes avec des rapports signal sur bruit faibles.

Arbovirus Infections comme outils de dépistage pour l’Identification des virales facteurs antiviraux immunomodulateurs et hôte

ICP0 subit une translocation nucléaire-à-cytoplasmique au cours de l’infection par HSV-1. On ne connaît pas le mécanisme moléculaire de cet événement. Nous décrivons ici l’utilisation du microscope confocal comme un outil permettant de quantifier le mouvement ICP0 dans l’infection HSV-1, qui jette les bases pour l’analyse quantitative ICP0 translocation dans de futures études mécanistes.

Analyse temporelle de la Translocation nucléaire-à-cytoplasmique d’une Herpès Simplex Virus 1 protéine par microscopie confocale par immunofluorescence

Découvrez la synthèse d'ADNc à partir d'ARN isolé de cellules HeLa infectées par le virus vaccinia. Cette méthode permet d'amplifier l'ARN viral pour l'analyse microarray de l'expression génique.

Infection virus de la vaccine et l'analyse temporelle de l'expression des gènes de virus: Partie 2

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