Mesure exocytose dans les neurones en utilisant un étiquetage FM
30 novembre 2006
La capacité de mesurer la cinétique de libération des vésicules peut aider à fournir un aperçu de certaines des bases de la neurotransmission. Ici nous avons utilisé l'imagerie en temps réel des vésicules étiquetés avec le rouge FM colorant fluorescent 4-64 pour mesurer le taux de libération des vésicules présynaptiques dans les cultures de neurones hippocampiques.
Je suis Jimmy Lynn. Je suis étudiant diplômé dans le programme de biologie moléculaire et cellulaire à Harvard. Je travaille actuellement au laboratoire Murphy, où nous étudions les neuro-hippocampes en laboratoire.
Et maintenant, je vais vous montrer comment réaliser des expériences de FM d. Nous allons donc maintenant procéder au montage du coverslip portant les neurones dans cette chambre sur mesure. Notre microscope est un CCD inversé ; veillez à bien sécher complètement le fond.
Ne va pas connecter les électrodes. Non. Maintenant, la perfusion est installée. Je vais la placer à une extrémité de la chambre.
Nous utilisons de l'argile afin de maintenir. Les responsables de HBS par expérience iront de l'avant et ajouteront tout cela. La fusion est configurée.
Vous souhaitez utiliser de l'argile pour maintenir ceci en place, je suppose, un peu comme ceci, là où se trouvent les corps cellulaires, car les membranes des corps cellulaires absorberont une grande quantité de colorant et seront très présentes au niveau de la synapse. Peut-être une zone adjacente ici, comme dans cette région que j'ai immédiatement eue et où nous allons. Et donc, photoblanchiment initial à partir des 10 premières images.
Et puis voici, je suis Jamil Newton. Je suis étudiant diplômant dans le programme de biologie moléculaire ici à Harvard. Je travaille actuellement dans un laboratoire de neurosciences avec Vinky Murphy comme directrice de recherche.
Et ce dont je veux vous parler aujourd'hui, c'est la réalisation d'expériences de FM. Quelle est votre intention, quel est l'objectif de votre expérience ? L'avantage du FM est qu'il s'agit d'un colorant fluorescent qui nous permet de suivre la cinétique de l'exocytose.
Nous nous assurons donc d'abord que le colorant est intégré dans la synapse en appliquant un stimulus de chargement. Ensuite, après une période de lavage, nous appliquons un stimulus de retenue au cours duquel le colorant est libéré des vésicules. Travaillez-vous sur un type spécifique de neurones ?
Ainsi, dans notre laboratoire, nous utilisons cette méthode pour les neurones de l'hippocampe et nous l'appliquons à des neurones en culture plutôt qu'en lyse. Quels sont les problèmes possibles liés à cette expérience ? Parmi les problèmes courants, citons l'utilisation de la stimulation électrique.
Parfois par le passé, pour une raison quelconque, des problèmes ont surgi lors de la mise en œuvre de la stimulation électrique. Je sais que d'autres laboratoires utilisent également une solution riche en potassium. Une solution riche en potassium peut donc constituer une alternative intéressante à l'utilisation d'un stimulus électrique en cas de difficultés.
Également, généralement, pour une raison quelconque pendant l'étape de lavage, il semble que vous n'obteniez pas un relâchement suffisant de la coloration non spécifique. J'ai souvent constaté qu'en augmentant simplement le débit, c'est-à-dire en passant de 0,5 ml à 1,5 ml par minute, et en prolongeant la durée du lavage de cinq minutes à dix minutes, les résultats s'améliorent considérablement. Quelles sont les applications possibles de cette expérience ?
Que souhaitez-vous réellement étudier ? Très bien, vous pouvez l'utiliser pour comparer des cellules témoins à des cellules ayant subi une manipulation quelconque. Par exemple, avec différentes lignées de souris, vous pouvez déterminer si les cinétiques de libération diffèrent d'une manière ou d'une autre, ou encore vérifier si l'ajout d'un médicament particulier affecte effectivement la cytose.
Merci.
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Aperçu
Cette étude porte sur la mesure de la cinétique de la libération des vésicules afin d'améliorer la compréhension de la neurotransmission. En utilisant l'imagerie en temps réel avec le colorant FM 4-64, la recherche examine les taux de libération des vésicules pré-synaptiques dans des cultures neuronales hippocampiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Neurotransmission
Contexte
- La neurotransmission est un processus essentiel dans la communication neuronale.
- La libération de vésicules est indispensable à la transmission des signaux entre les neurones.
- Les techniques d'imagerie en temps réel peuvent fournir des informations sur la dynamique des vésicules.
- Le FM 4-64 est un colorant fluorescent couramment utilisé pour marquer les vésicules.
Objectif de l'étude
- Mesurer la vitesse de libération des vésicules pré-synaptiques.
- Comprendre les mécanismes de la neurotransmission.
- Utiliser l'imagerie en temps réel pour observer la dynamique des vésicules.
Méthodes utilisées
- Imagerie en temps réel de vésicules marquées avec le FM 4-64.
- Utilisation de cultures neuronales d'hippocampe pour les expériences.
- Chambre sur mesure pour le montage de lamelles contenant des neurones.
- Configuration de microscope inversé pour l'imagerie.
Résultats principaux
- Mesure réussie des taux de libération des vésicules pré-synaptiques.
- Apport de connaissances sur la cinétique des dynamiques de libération vésiculaire.
- Démonstration de l'efficacité du FM 4-64 dans les études d'imagerie.
- Contribution à la compréhension des processus de neurotransmission.
Conclusions
- L'imagerie en temps réel est un outil précieux pour l'étude de la libération des vésicules.
- L'étude approfondit les connaissances sur les mécanismes de neurotransmission.
- Le FM 4-64 offre une méthode fiable pour visualiser les vésicules.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La mesure quantitative de l’exocytose des vésicules synaptiques par marquage avec des colorants FM fournit des informations exploitables sur les mécanismes de libération des neurotransmetteurs, soutenant la validation précoce des cibles dans la découverte de médicaments axée sur la neurobiologie. Cette approche permet une comparaison directe des cinétiques de libération des vésicules entre neurones modifiés génétiquement ou pharmacologiquement et témoins, apportant des éléments mécanistiques pour réduire les risques et renforcer la prévisibilité au moment critique de la découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'analyse des mécanismes de libération synaptique dans des cultures neuronales pertinentes pour les maladies.
- Permet la validation fonctionnelle de manipulations génétiques ou pharmacologiques affectant l'exocytose.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en quantifiant les modifications de la fonction présynaptique.
- Offre une confiance prédictive pour faire progresser les programmes de composés neuroactifs.
Développement de criblages et de tests
- Établit des lectures reproductibles et quantitatives de la libération de vésicules dans des cultures neuronales primaires.
- Permet la standardisation des tests pour comparer les synapses transfectées et les synapses témoins.
- Permet une évaluation évolutive des effets d'interventions pharmacologiques ou génétiques sur les taux d'exocytose.
- Prépare des systèmes validés pour le criblage en aval de modulateurs synaptiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les tests fonctionnels des synapses in vitro avec des modèles neuronaux pertinents pour la maladie.
- Assure une continuité entre la découverte mécanistique et la validation préclinique des cibles synaptiques.
- Permet la progression ajustée au risque des candidats neurothérapeutiques fondée sur des lectures fonctionnelles.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La mesure de l'exocytose basée sur les colorants FM s'intègre dans la continuité découverte-préclinique, reliant les premières études mécanistiques et la validation translationnelle dans les systèmes neuronaux.
- Biologie de la découverte : Quantifie la libération des vésicules synaptiques afin de tester des hypothèses concernant les mécanismes de neurotransmission.
- Triage : Fournit des résultats reproductibles et quantitatifs pour le criblage de composés ou de facteurs génétiques dans des cultures neuronales.
- Analytique : Permet des mesures cinétiques basées sur la fluorescence pour des comparaisons statistiques solides entre différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la fonction synaptique in vitro et les phénotypes pertinents pour les maladies dans des modèles précliniques.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme réutilisable pour évaluer diverses interventions neuroactives dans plusieurs programmes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles synaptiques.
- Valeur opérationnelle : Normalise et permet l'application à grande échelle d'essais quantitatifs d'exocytose afin de garantir une comparabilité entre études.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'aller/arrêt et améliore l'efficacité du capital dans les portefeuilles de neurobiologie.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des composés neuroactifs et des cibles génétiques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture neuronale et en imagerie de fluorescence sur cellules vivantes.
- Suppose l'accès à un microscope à fluorescence inversé et à des chambres de perfusion personnalisées.
- Exige des protocoles rigoureux de lavage et de stimulation pour assurer la reproductibilité du test.
- Doit adapter les débits et les durées de lavage afin d'optimiser l'élimination du colorant et la spécificité du signal.
- Les limitations pratiques incluent une variabilité potentielle de la stimulation électrique et de l'efficacité de la prise en charge du colorant.
