Name: Infection virus de la vaccine et lanalyse temporelle de lexpression des gènes de virus: Partie 3 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Découvrez le marquage de l'ARN antisens par couplage amino allyle de colorants pour l'analyse d'expression génique par microarray. Cette méthode utilise des cellules HeLa infectées par le virus vaccinia.

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Partie 1: ARNa étiquetage: couplage allyliques aminés des colorants <ol><li> Ajouter 1 pg des échantillons dans des tubes à centrifuger ARNa 1.5ml. </li><li> Vide sécher les échantillons à feu doux jusqu&#39;à ce qu&#39;ils ou pas sont complètement secs. Cap chaque tube dès qu&#39;il est sec - ne pas trop sécher! </li><li> Ajouter 9μl tampon de couplage à chaque tube et remettre les ARNa par un léger vortex pendant 1 minute. Centrifuger brièvement pour prélever l&#39;échantillon dans le fond du tube, puis laisser l&#39;échantillon reposer sur la glace. </li><li> Ajouter 22μl de DMSO de haute qualité pour chaque tube de Cy3 ou Cy5 colorant. Un tube de colorant est suffisant pour deux échantillons. Le colorant Cy3 est pour l&#39;étiquetage de vos échantillons de référence, et le colorant Cy5 est pour l&#39;étiquetage de vos échantillons. </li><li> Vortex les colorants pour bien mélanger. Gardez les colorants dans l&#39;obscurité jusqu&#39;au moment de servir. Ne pas préparer de teinture plus tôt que 1 heure avant utilisation. Assurez-eau ne pénètre pas dans le mélange colorant / DMSO à tout moment. </li><li> Ajouter 11μl de DMSO préparées / Cy colorant pour chaque échantillon. Mélangez bien en vortexant doucement. </li><li> Incuber pendant 30-45 minutes à température ambiante. Couvrir les échantillons de papier d&#39;aluminium ou de les garder dans un tiroir pour minimiser l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Après l&#39;incubation, ajouter 4.5μl hydroxlyamine à chaque échantillon pour stopper la réaction. Mélangez bien en vortexant doucement. </li><li> Incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Couvrir les échantillons de papier d&#39;aluminium ou de les garder dans un tiroir pour minimiser l&#39;exposition à la lumière. </li></ol> Partie 2: Labeled ARNa nettoyage <ol><li> Vortex les perles liaison à l&#39;ARN brièvement pour obtenir un mélange homogène avant utilisation. </li><li> Préparer le ARNa Mix reliure à température ambiante. (Tableau 1) </li><li> Mélangez bien au vortex. </li><li> Aliquoter le tampon d&#39;élution ARNa dans un tube de 1,5 ml et incuber à 50-60 ° C pendant au moins 10 minutes. </li><li> Ajouter 70μl de l&#39;ARNa mélange de liant à chaque échantillon et bien mélanger par pipetage haut et en bas de 3-4 fois. </li><li> Transférer les échantillons de la plaque PCR de 96 puits à fond rond assiette. </li><li> Ajouter 50 pl de 100% d&#39;isopropanol à chaque échantillon et bien mélanger par pipetage haut et en bas de 3-4 fois. </li><li> Secouez doucement la plaque sur un agitateur orbital pendant au moins 2 minutes pour bien mélanger les échantillons. </li><li> Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Laisser la plaque sur le stand jusqu&#39;à ce que le mélange devient transparent et les perles à caractère contraignant ont granulés. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant. Le surnageant doit être soit un rose vif ou d&#39;un bleu vif à ce point à cause de molécules de colorant non constituées en société. </li><li> Retirer la plaque du socle magnétique. </li><li> Ajouter 100 ul Solution Laver ARNa dans chaque puits et agiter la plaque pendant 1 minute sur l&#39;agitateur orbital à vitesse modérée. Perles peut pas entièrement se dispersent à cette étape. </li><li> Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant. </li><li> Retirer la plaque du socle magnétique. </li><li> Répétez le laver une fois 2 ème avec 100 ul Solution Laver ARNa. </li><li> Après le lavage 2 ème, sécher les perles en secouant la plaque pendant 1 minute sur l&#39;agitateur orbital à la vitesse maximale. Ne pas trop sécher les échantillons! </li><li> Eluer la ARNa des billes en ajoutant 20 pi de tampon d&#39;élution préchauffé ARNa à chaque échantillon. </li><li> Secouez vigoureusement la plaque sur l&#39;agitateur orbital pendant 3 minutes, puis vérifiez que les billes magnétiques sont totalement dispersés. Sinon, continuez secouant. </li><li> Une fois que les billes magnétiques ont complètement dispersé, déplacer la plaque d&#39;un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Le surnageant contient les nettoyer, les échantillons ARNa étiquetés, et devrait être soit un rose pâle ou bleu pâle. </li><li> Soigneusement transférer le ARNa élué à une nouvelle plaque PCR (ou tubes PCR). </li><li> (Étape facultative) Vérifiez la concentration en ARN et la quantité de colorant dans les échantillons en mesurant 1.5μl sur un spectrophotomètre NanoDrop utilisant le module biopuces. </li><li> Immédiatement hybrider les ARNa étiquetés sur une plateforme biopuces de votre choix, ou, alternativement, vous pouvez stocker les ARNa étiquetés à -80 ° C jusqu&#39;à ce que vous êtes prêt pour l&#39;hybridation. </li></ol> Tableau 1 ARNa Mix reliure <table border="1"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Montant pour une réaction </td></tr><tr><td> Perles liaison à l&#39;ARN * </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> * Remise en suspension de billes Solution </td><td> 4μl </td></tr><tr><td> 100% d&#39;isopropanol ** </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> Concentré ARNa Binding Buffer </td><td> 50 pl </td></tr></tbody></table> * Mélanger les perles de liaison avec l&#39;ARNsolution de billes resuspension premier ** Ajouter l&#39;isopropanol et bien mélanger avant d&#39;ajouter le concentré de tampon de liaison ARNa.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Étapes critiques Lorsque vous effectuez le couplage aminé allyle, il est essentiel de remettre en suspension le colorant dans le DMSO sous peu (moins de 1 heure) avant l&#39;accouplement et s&#39;assurer eau ne pénètre pas dans le mélange colorant / DMSO, comme il va réagir avec le groupe actif sur le colorant. Ne pas trop sécher l&#39;ARN (peut être séché à 1-2UL plutôt que complètement à sec), et remettre ainsi dans le tampon de couplage. Pendant la réaction de couplage, garder la réaction d...

<table><tbody><tr><td>Kit de colorants réactifs CyDye après marquage</td><td>Réactif</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN5661</td><td>Contient les colorants Cy3 et Cy5</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre UV-VIS NanoDrop ND-1000</td><td>Autre</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>Ou spectrophotomètre équivalent</td></tr></tbody></table>

infection virus de la vaccine et l&#39;analyse temporelle de l&#39;expression des gènes de virus: partie 3

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

La famille<em&gt; Poxviridae</em&gt; Se compose de grandes double-brin d&#39;ADN contenant des virus qui se répliquent exclusivement dans le cytoplasme des cellules infectées. Les membres de la<em&gt; Orthopoxvirus</em&gt; Genre comprennent la variole, l&#39;agent causal de la variole humaine, simienne, et la vaccine (ACC), le membre prototypique de la famille des virus. Dans le génome relativement importante (~ 200 ko) de la vaccine, trois classes de gènes sont encodés: précoce, intermédiaire et tardive. Alors que tous les trois classes sont transcrits par les ARN polymérases virale codée, chaque classe a une fonction différente dans le cycle de vie du virus. Les poxvirus utilisent de multiples stratégies pour la modulation de l&#39;environnement cellulaire de l&#39;hôte pendant l&#39;infection. Afin de comprendre la régulation de l&#39;hôte et l&#39;expression des gènes du virus, nous avons utilisé l&#39;échelle du génome des approches pour analyser l&#39;abondance transcription de deux virus et les cellules hôtes. Ici, nous démontrons infections cours du temps des cellules HeLa par le virus de la vaccine et de l&#39;ARN d&#39;échantillonnage à différents moments après l&#39;infection. Les deux hôtes et virales ARN total est isolé et amplifié pour que l&#39;hybridation des puces pour l&#39;analyse de l&#39;expression génique.

Protocole pour la vaccine infection de cellules HeLa et l&#39;analyse de l&#39;hôte et l&#39;expression des gènes viraux. Partie 3 décrit le processus d&#39;étiquetage de l&#39;ARN par fluorescence amplifié à partir de l&#39;hôte et des échantillons viraux par le couplage d&#39;allyle aminés de colorants.

Infection virus de la vaccine et l&#39;analyse temporelle de l&#39;expression des gènes de virus: Partie 3

La famille des Poxviridae se compose de virus à ADN double brin de grande taille qui se répliquent exclusivement dans le cytoplasme des cellules infectées. Les membres de...

Bonjour, je suis Judy Y du laboratoire de Kate Rubins à l'Institut Whitehead pour la recherche biomédicale. Ici, nous démontrons comment marquer les échantillons d'ARN antisens prélevés à la fois sur des cellules HeLa infectées par le virus vaccinia et sur le virus lui-même, par couplage aminohexyl de colorants. Nous montrons ensuite comment purifier l'ARN marqué et le préparer en vue d'une hybridation destinée à l'analyse par puces à ADN de l'expression génique.Les vidéos précédentes de JoVE expliquent comment réaliser les étapes d'isolement de l'ARN total, d'amplification de l'ARN viral et d'amplification. Commençons donc. Pour commencer l'étiquetage de l'ARN, ajoutez d'abord un microgramme des échantillons d'ARN A dans des tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre.Séchez sous vide les échantillons à faible température ou sans chaleur jusqu'à ce qu'ils soient complètement secs. Boucher chaque tube dès qu'il est sec. Il est important de ne pas trop sécher les échantillons une fois qu'ils sont desséchés.Ajoutez neuf microlitres de tampon de couplage dans chaque tube et remettez l'ARN A en suspension par vortexage doux pendant une minute. Centrifugez brièvement pour ramener l'échantillon au fond du tube, puis laissez reposer sur de la glace. Ensuite, ajoutez 22 microlitres de DMSO de haute qualité dans chaque tube de colorant SCI trois ou S cinq ; un tube de colorant suffit pour deux échantillons. Le colorant S SI trois sert à marquer vos échantillons de référence et le colorant SCI cinq sert à marquer vos échantillons test.Vortexez les colorants pour bien les mélanger. N’oubliez pas de maintenir les colorants à l’abri de la lumière jusqu’au moment de leur utilisation. Ne préparez pas les colorants plus d’une heure avant de les utiliser et veillez à ce qu’aucune eau n’entre dans le mélange de colorant en DMSO à aucun moment.Ajouter maintenant 11 microlitres du mélange de colorant D-M-S-O-S préparé à chaque échantillon et bien mélanger par vortex. Incuber doucement pendant 30 à 45 minutes à température ambiante. Couvrir les échantillons avec du papier d’aluminium ou les conserver dans un tiroir afin de minimiser leur exposition à la lumière.Après l'incubation, ajouter 4,5 microlitres d'hydroxylamine à chaque échantillon pour arrêter la réaction, puis mélanger soigneusement par vortex. Incuber doucement pendant encore 15 minutes à température ambiante. Couvrir les échantillons avec du papier d'aluminium ou les conserver dans un tiroir afin de minimiser leur exposition à la lumière.Pour nettoyer l'étiquette, vortexez l'ARN avec les billes de liaison à l'ARN. Pour obtenir brièvement un mélange homogène avant utilisation, préparez le mélange de liaison à l'ARN A à température ambiante. Mélangez soigneusement le mélange de liaison par vortex, aliquotez le tampon d'élution de l'ARN A dans un tube de 1,5 millilitre et incubez à 50 à 60 degrés Celsius pendant au moins 10 minutes.Ajouter 70 microlitres du mélange de liaison A RNA à chaque échantillon et bien mélanger en pipetant de haut en bas trois à quatre fois. Après le mélange, transférer les échantillons de la plaque PCR vers une plaque à 96 puits en fond rond. Ensuite, ajouter 50 microlitres d’isopropanol à cent pour cent à chaque échantillon et bien mélanger en pipetant de haut en bas trois à quatre fois. Agiter doucement la plaque sur un agitateur orbital pendant au moins deux minutes.Pour bien mélanger les échantillons. Placer la plaque sur un support magnétique afin de capturer les billes magnétiques.Laissez la plaque sur le support jusqu'à ce que le mélange devienne transparent et que les billes de liaison se soient regroupées au fond. Aspirez soigneusement le surnageant à l'aide d'un aspirateur sous vide sans perturber les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette et jetez le surnageant.À ce stade, le surnageant doit être soit d'un rose vif, soit d'un bleu vif en raison des molécules de colorant non incorporées. Une fois le surnageant éliminé, retirez la plaque du support magnétique. Ajoutez ensuite cent microlitres d'une solution de lavage de l'ARN dans chaque puits et agitez la plaque pendant une minute sur l'agitateurboule à vitesse modérée.Les billes peuvent ne pas se disperser complètement à cette étape ; remettez la plaque sur un support magnétique afin de capturer les billes magnétiques. Aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’un aspirateur sous vide sans perturber les billes magnétiques.Alternativement, retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette et jetez le surnageant. Retirez la plaque du support magnétique. Répétez le lavage une deuxième fois avec 100 microlitres de solution de lavage A pour ARN.Après le deuxième lavage, séchez les billes en agitant la plaque pendant une minute sur l'agitatePour chaque échantillon, agiter vigoureusement la plaque sur l'agitateu rorbital pendant trois minutes. Vérifier ensuite que les billes magnétiques sont complètement dispersées. Si ce n'est pas le cas, poursuivre l'agitation.Une fois que les billes magnétiques sont complètement dispersées, déplacez la plaque sur un support magnétique afin de capturer les billes magnétiques. Le surnageant contient les échantillons d'ARN a marqués et purifiés et doit être soit rose pâle, soit bleu pâle. Ensuite, transférez soigneusement l'ARN a mentionné vers une nouvelle plaque PCR ou des tubes PCR.À ce stade, vous pouvez vérifier la concentration en ARN et la quantité de colorant dans les échantillons en mesurant 1,5 microlitre sur un spectrophotomètre NanoDrop. En utilisant le module de puces à ADN, hybriderez immédiatement l'ARN A marqué sur une plateforme de puces à ADN de votre choix. Sinon, vous pouvez conserver l'ARN A marqué à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce que vous soyez prêt pour l'hybridation.Il s'agit d'un exemple de lecture de spectrophotomètre et de tracé d'OD généré à l'aide du spectrophotomètre NanoDrop pour mesurer la concentration de l'échantillon et l'incorporation du colorant. On observe les pics d'OD à 260 nanomètres permettant de calculer la concentration des échantillons, ainsi que les deux pics situés aux alentours de 532 et 635 nanomètres, représentant respectivement les colorants S3 et SCI five. Nous venons de vous montrer comment marquer par fluorescence des échantillons d'ARN incorporant l'allèle immuno amplifié en vue d'une hybridation sur microréseau.Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de resuspendre le colorant dans le DMSO moins d'une heure avant la couplage et de s'assurer qu'aucune eau n'entre dans le mélange de colorant et de DMSO, car elle réagirait avec le groupe actif du colorant. Il est également important de ne pas trop sécher l'ARN si nécessaire. Les échantillons peuvent être séchés jusqu'à un à deux microlitres plutôt que complètement secs, puis bien resuspendus dans le tampon de couplage pendant la réaction de couplage.Gardez les réactions à l'abri de la lumière avec des agitations occasionnelles et centrifugez brièvement si désiré. Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.Veillez à regarder les autres vidéos de cette série dans lesquelles nous montrons comment réaliser une infection en cours de temps avec le virus de la vaccine, l'extraction de l'ARN des échantillons et la procédure d'amplification linéaire des échantillons d'ARN.

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