Name: Propagation des souches embryonnaires humaines (ES) Cellules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Apprenez la culture et le maintien des cellules souches embryonnaires humaines H1 et H9 en utilisant la technique de clivage par collagénase. Cette méthode préserve l'intégrité cellulaire et évite la sélection de variants anormaux.

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<ol><li>Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28, 31-40 (2000).</li>
<li>Perrier, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).</li>
<li>Pruszak, J., Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons.</a> , John Wiley and Sons. (2007).</li>
<li>Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+and+methods+for+cell+sorting+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations.</a> Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).</li>
<li>Sonntag, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+yield+of+neuroepithelial+precursors+and+midbrain-like+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+using+the+bone+morphogenic+protein+antagonist+noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin.</a> Stem Cells. 25, 411-418 (2007).</li>
<li>Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dopaminergic+neurons+and+pigmented+epithelia+from+primate+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).</li>
<li>Ko, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursors+as+a+continuous%2C+stable%2C+and+on-demand+source+for+human+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons.</a> J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).</li>
<li>Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+precursors+derived+from+human+embryonic+stem+cells+maintain+long-term+proliferation+without+losing+the+potential+to+differentiate+into+all+three+neural+lineages%2C+including+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons.</a> J Neurochem. , (2007).</li>
<li>Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+subtype+specification+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neural subtype specification from embryonic stem cells.</a> Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).</li>
<li>Pankratz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li>
<li>Lazzari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+neural+rosettes+from+cloned+bovine+blastocysts%3A+a+model+of+early+neurulation+events+and+neural+crest+specification+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro.</a> Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).</li>
<li>Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+peripheral+sensory+and+sympathetic+neurons+and+neural+crest+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 923-930 (2005).</li>
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propagation des souches embryonnaires humaines (es) cellules

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation des souches embryonnaires humaines (ES) Cellules

Oui, je suis Lauren Deon. J'assure la direction du centre de cellules souches humaines AMGEN à l'IMH. Oui, je suis Lauren, je dirige le centre de cellules souches humaines AMGEN à l'IMH.Donc, je travaille avec des cellules souches humaines d'Amgen depuis plusieurs années maintenant, depuis que j'étais postdoctorant chez George De Lab, il y a quatre ans. Actuellement, nous disposons de deux lignées cellulaires, H1 et H9, provenant toutes deux de Y cell. La méthode que nous utilisons pour amplifier ou maintenir ces cellules en culture, du moins la manière dont nous les dissocions, consiste à utiliser de la collagenase.Ce que je fais habituellement, c'est que pour les premiers passages après avoir semé les cellules, j'utilise une technique consistant à sélectionner les colonies. Dans ce cas, je peux vérifier au microscope quelles colonies sont bonnes, bien différenciées et ont une forme régulière, puis je prélève uniquement ces colonies, je les coupe en plusieurs morceaux et je les remets dans une nouvelle boîte fraîche. Quant aux colonies qui semblent mal différenciées, je les laisse simplement en place.L'autre méthode pour passer les cellules consiste à utiliser la trypsine. Je n'utilise pas cette technique ici. Je pense que la collagénase est un peu plus sûre, car les cellules souches humaines n'aiment pas être individualisées ou rester seules.Donc, si vous utilisez de la trypsine pendant un peu trop longtemps, par exemple trois à quatre minutes, comme nous le faisons pour d'autres types de cellules, les cellules souches humaines deviendront individualisées et la plupart d'entre elles mourront, se différencieront ou ne s'attacheront pas au milieu. L'idée est donc de maintenir les cellules sous forme d'agrégats. Vous ne souhaitez pas qu'elles soient isolées dans le flacon.Ainsi, l'utilisation de la collagénase présente l'avantage de conserver les cellules telles quelles. En revanche, avec chipsy, vous sélectionnez uniquement les cellules capables de survivre à ce processus très, très agressif d'opsonisation. Ces cellules sont généralement très fortement prolifératives.Ainsi, vous pouvez adapter vos cellules à ce processus de trypsine. Le problème est que certaines cellules se comportent différemment et se divisent beaucoup plus rapidement. Un risque est d'obtenir des anomalies commerciales liées à ce processus de division très élevé.Vous affirmez donc que l'isation peut entraîner une sélection de cellules en culture, favorisant les cellules les plus prolifératives. Exact. Plus actives et probablement aussi dotées de taux de survie plus élevés que les autres cellules. Ainsi, après la prolifération, fondamentalement la culture, après la prolifération en tripsine, devient après plusieurs passages une culture différente, possédant ces propriétés différentes.Il est donc difficile de déterminer s’ils sont exactement identiques. Si vous effectuez le test, le test habituel, disons que vous vérifiez les marqueurs, les marqueurs habituels des cellules différenciées terminales comme OC4, Nanog, Oct4, SSEA4, CD3, toutes ces molécules pourraient encore être exprimées. Si vous mesurez la formation de la résistance transepithéliale (TER), ces cellules pourraient encore se différencier et se former comme des cellules normales.Si vous examinez le caryotype, vous pouvez observer une anomalie, mais vous pouvez également avoir un caryotype normal. L'avantage sélectif pourrait être dû à une simple mutation que l'on ne peut pas détecter par l'analyse d'un caryotype. Ainsi, le fait qu'elles se développent beaucoup plus rapidement est, en soi, je pense, un peu plus préoccupant.Et si nous voulons utiliser ces cellules pour une transplantation à un moment donné, je n'utiliserais certainement pas ce type de cellules. D'accord. Voudriez-vous donc m'expliquer quels sont les principaux problèmes techniques liés à l'utilisation de cette technique pour les passages cellulaires ? Donc, en utilisant S, oui.C’est juste un peu plus long et, comme les cellules ne se divisent pas aussi rapidement, cela prend beaucoup plus de temps pour obtenir un grand nombre de cellules afin de réaliser une expérience. C’est donc, dirais-je, moins pratique. Souhaitez-vous me parler en quelques mots des objectifs de votre expérience ?Comment utilise-t-on les cellules CS ? Bon, mon projet principal ici consiste à obtenir des cellules endothéliales à partir de cellules souches humaines AB. L'idée est de pouvoir fabriquer du sang.Nous collaborons beaucoup avec des laboratoires de bio-ingénierie tissulaire, dont l'un des objectifs est de fabriquer des tissus in vitro. Or, l'une des limitations à cela est l'absence de vaisseaux sanguins traversant ces tissus. Ainsi, si nous pouvons introduire des cellules endothéliales ou placer des cellules endothéliales dans ce tissu, nous obtiendrions une meilleure croissance de ce dernier.Ainsi, peu de sources cellulaires sont connues pour les cellules endothéliales, comme le sang de cordon ou le sang périphérique, mais il serait intéressant de disposer d'une autre source de cellules, telles que les cellules souches pluripotentes induites humaines. L'avantage est que, puisque ces cellules peuvent être amplifiées de manière quasi infinie, on pourrait les modifier, créer un système inductible et être en mesure de l'utiliser. Ensuite, dans votre produit final, vos cellules matérielles, dans ce cas précis.

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Dérivation des cellules souches embryonnaires humaines par Immunosurgery

La différenciation de l'ESC coïncide avec un type de cellule des changements spécifiques dans la structure et la composition de la chromatine. La détection de ces changements fournit de précieuses indications sur les mécanismes qui définissent stemcellness et la différenciation cellulaire. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) représente une méthode utile pour disséquer les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la différenciation des cellules souches.

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Cette vidéo montre comment maintenir la croissance de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) dans le chargeur sans cellules conditions et la manière de CSEh passage en continu dans le chargeur sans cellules conditions. Confirmation de CSEh pluripotence grandi dans le chargeur sans cellules par microscopie d'immunofluorescence conditions est également démontrée.

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Différenciation dirigée des CSEh dans des cellules spécifiques a suscité beaucoup d'intérêt en médecine régénérative. Nous fournissons un résumé concis, étape par étape pour déterminer le protocole...

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Malgré les progrès récents dans la modification génétique, la transfection de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) reste un processus capricieux. A notre connaissance, les méthodes systématiques et efficaces pour transfecter l'homme cellules souches pluripotentes induites (CISP) n'ont pas été signalés. Ici, nous décrivons les protocoles robustes pour transfecter efficacement et nucleofect iPSCs de l'homme.

Transfection et Nucleofecting homme cellules souches pluripotentes induites

Nous avons établi un protocole pour l'induction de neuroblastes direct pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines maintenues dans des conditions définies avec de petites molécules, qui permet la dérivation d'une offre importante de progéniteurs neuronaux humains et neuronale types de cellules dans le développement du SNC pour les neurones de réparation.

Dérivation efficace des ressources humaines progéniteurs neuronaux et des neurones à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

Un seul dosage de l'expression du gène cellulaire est nécessaire pour la compréhension des hétérogénéités de cellules souches.

Profilage individuel embryonnaires humaines Cellules souches par RT-PCR quantitative

des lignées cellulaires rapporteurs offrent un moyen de visualiser, de suivre et d'isoler des cellules d'intérêt à partir de populations hétérogènes. Cependant, le ciblage génique en utilisant une recombinaison homologue conventionnelle dans les cellules souches embryonnaires humaines est extrêmement inefficace. Ici, nous décrivons le ciblage CNS lieu mésencéphale spécifique Pitx3 facteur de transcription avec EGFP en utilisant doigt de zinc nucléase amélioré recombinaison homologue.

Doigt de zinc nucléase Gene meilleur ciblage dans embryonnaires humaines Cellules souches

Présenté ici est un protocole pour la génération d'une culture unicellulaire des cellules souches embryonnaires humaines et leur différenciation ultérieure en cellules progénitrices neurales. Le protocole est simple, robuste, évolutif et adapté aux applications de dépistage des médicaments et de médecine régénérative.

Différenciation neuronale efficace à l'aide de la culture monocellulaire des cellules souches embryonnaires humaines

Ici, nous montrons comment notre laboratoire gèle HUES humaine lignes de cellules souches embryonnaires.

La congélation des cellules ES humaines

Apprenez la culture et le maintien des cellules souches embryonnaires humaines H1 et H9 en utilisant la technique de clivage par collagénase. Cette méthode préserve l'intégrité cellulaire et évite la sélection de variants anormaux.

Propagation des souches embryonnaires humaines (ES) Cellules

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