Cellules d'imagerie à long terme des mammifères en utilisant la microscopie à champ large

En fait, ce que je vais faire, c'est d'abord le monter ici, puis vous remplacer. Donc maintenant, je vais aspirer en essayant d'être le plus doux possible. D'accord. Quelques secondes en maintenant en place. D'accord. Très bien.

Ainsi, les caractéristiques importantes de notre grille d'imagerie en conditions physiologiques sont les suivantes : il s'agit d'un microscope inversé, ce qui signifie que l'objectif, les échantillons situés ici par rapport à l'objectif sont en dessous. L'objectif est donc orienté vers le haut, et l'ensemble du microscope, ou pratiquement l'ensemble du microscope, y compris les objectifs et l'échantillon, se trouve à 37 degrés. Ainsi, tout ce qui se trouve dans cette boîte en plastique est maintenu à 37 degrés.

Et juste au-dessus de la platine, nous avons un mélange d'air et de CO2 à 5 %CO2. L'idée est que l'échantillon se trouve en réalité dans une enceinte à cellules, comme une incuabteur de cellules.

Et donc, voici notre mélangeur pour l'air et le CO₂, qui est ensuite humidifié et chauffé avant d'être acheminé vers l'échantillon placé sur la platine. Très bien. Aujourd'hui, nous allons simplement effectuer une détection de fluorescence en un seul canal, celle de la GFP. Voici le tuyau par lequel le CO₂, à 5 % de CO₂, entre, et qui s'insère simplement dans le support de la platine.

C’est important. Ensuite, nous pouvons fermer ceux-ci, les enlever, puis passer à notre première position. Ce que je vais faire, c’est passer au premier champ, qui est mon échantillon témoin, et je choisirai des positions en fonction de ce que je vois à l’écran.

Je m'assure donc de regarder effectivement dans le microscope pour chaque nouveau puits, car le plan de focalisation de chaque puits est différent ; en effet, le fond de la boîte n'est pas parfaitement plat. Vous devrez donc effectuer des réglages fins lorsque vous passez d'un puits à l'autre. Pour l'instant, je suis sur le premier puits ; ce que je vais faire, c'est régler la mise au point. J'ai simplement allumé, j'ai juste indiqué, j'ai simplement activé la lumière, la lumière transmise pour le microscope.

Et j'ai vérifié que toute la lumière est dirigée vers les oculaires. Je regarde alors simplement à l'intérieur pour m'assurer d'obtenir un champ net et propre. Ensuite, j'éteindrai cette lumière, j'allumerai la lumière de fluorescence et je vérifierai que les cellules observées semblent saines et ne sont pas en apoptose.

Et, et j'arrête cela. Ce que je fais ensuite, c'est d'envoyer ; maintenant, je vais commencer à sélectionner des positions, ce qui signifie que je dois envoyer le trajet de la lumière vers la caméra. C'est la caméra juste ici.

Je demande donc au microscope d'envoyer toute la lumière vers la caméra, de sorte que rien ne soit visible dans les oculaires. Ce que je fais ensuite, dans le logiciel de contrôle du microscope, c'est sélectionner le bon jeu de filtres, qui dans notre cas est le filtre psy, puis régler un temps d'exposition.

Et je connais très bien ces cellules et je sais qu'elles nécessitent un temps de pose de 0,2 seconde. Je le précise donc dans le logiciel. Ensuite, j'appuierai sur la mise au point.

Ceci est vivant, en quelque sorte. Une lumière s'allumera et vous pouvez, oh, je ne sais pas si vous pouvez voir les cellules, mais la raison pour laquelle ce champ est bon, c'est que toutes les cellules sont homogènes, même en termes de fluorescence. Il n'y a aucune cellule apoptotique. Les cellules apoptotiques ont tendance à être très brillantes, et il n'y a ni saleté ni débris dans le champ.

Et vous pouvez constater qu'en réalité, ceci est une cellule en métaphase et cela est une cellule en métaphase, tandis que celle-ci est probablement une cellule qui vient juste de terminer la mitose. Je peux l'affirmer car il semble que ces deux lots de chromatine soient très bien orientés l'un par rapport à l'autre, comme s'ils venaient juste de quitter une anaphase.

C’est donc un bon champ. Maintenant que je sais que le temps d’exposition et le jeu de filtres sont corrects (ceci dépend du logiciel), je vais enregistrer des positions, et le logiciel mémorisera alors la position X, Y, Z de ce champ. Ensuite, lorsque je choisirai un autre champ, eh bien, lorsque je sélectionne de nouveaux champs, mais dans le même échantillon, j’utiliserai le logiciel, je déplacerai la platine, j’activerai l’obturateur, j’ouvrirai l’obturateur et je regarderai ce que je vois à l’écran pour choisir les champs en fonction de cela, plutôt que d’observer directement dans l’oculaire.

Je ne vois donc aucun de mes toniques là-dedans. Mais encore une fois, même bien centrées, ces cellules traverseront mon PS. Je continue : voici un bon exemple. Voici un bon exemple de ce que je conseillerais d'éviter ; observez à quel point c'est lumineux ?

C’est très lumineux. C’est probablement un résidu de cellule apoptotique. La raison pour laquelle je l’éviterais est que, étant donné son intensité lumineuse, lorsque le logiciel effectue la mise au point automatique, il se concentrera uniquement sur cet élément et ne sera pas dans le même plan que toutes les autres cellules.

Et ainsi, je n'obtiendrai aucune information à partir de ce champ. Cela semble bien. Il y a, ceci est une prométaphase ici même, c'est une métaphase.

Donc, et je vais prendre trois positions par puits. C'était donc trois positions, et maintenant je vais passer à mon prochain puits. Vous pouvez ainsi, ce que je ferai probablement, prendre des images toutes les 10 minutes. C'est un compromis.

L'imagerie en conditions de vie est toujours un compromis, n'est-ce pas ? Vous devez réaliser l'imagerie tout en maintenant les cellules en bon état, particulièrement si vous vous intéressez à la mitose. Vous devez donc minimiser leur exposition à la lumière fluorescente.

Et, mais vous souhaitez obtenir des informations. Vous devez donc prendre des images, vous devez faire des compromis, vous devez choisir ce que vous voulez capturer, quel type d'information vous souhaitez obtenir. Pour nos besoins, la mitose dure généralement environ une heure.

Donc, si nous prenons des intervalles de 10 minutes, c'est assez bon. Nous observons la prophase, nous observons la métaphase, nous observons l'anaphase, et nous pouvons voir quand des traitements, des médicaments ou des ARNsi influencent ces stades spécifiques du cycle cellulaire. Ainsi, pour nos besoins, cela suffit, mais nous voulons toujours plus.

Nous souhaitons toujours plus de positions ou un temps et un intervalle plus fins, ou quelque chose de ce genre. C'est donc un compromis. Ensuite, j'appuierai sur démarrer.

Notre logiciel effectue donc un passage de mise au point automatique lors du premier passage. Dès que j'appuie sur démarrer, il commence la mise au point automatique et vous verrez l'obturateur s'ouvrir, s'ouvrir et se fermer entre chaque mise au point automatique. Je vais donc appuyer sur démarrer.

Voilà donc l'obturateur qui s'ouvre et se ferme. Le moteur Z se met en marche et tente en réalité de trouver le plan présentant le plus de contraste, qui sera celui le mieux mis au point. Vous pouvez effectivement voir à l'écran l'image entrer et sortir progressivement du meilleur plan de mise au point, ce qui pourrait sembler préoccupant.

Ce que cela fait, c'est déplacer le moteur Z afin de trouver le plan de mise au point optimal, celui qui offre la netteté maximale dans l'image. Ensuite, il prend une image à cet endroit précis, puis mémorise cette position en Z. Ensuite, nous utiliserons cette position en Z pour les 12 passes suivantes.

Ensuite, nous effectuerons à nouveau le passage de mise au point automatique. Quel type d'expériences réalisent-ils ? Très bien, donc notre laboratoire s'intéresse surtout à comprendre ce qui régule la progression mitotique, ou du moins, c'est ce qui m'intéresse particulièrement.

Ainsi, grâce à l'imagerie de cellules vivantes et en particulier à notre microscope à imagerie multiposition et à long terme, vous pouvez filmer des cellules pendant deux ou trois jours pendant qu'elles entrent en mitose, et vous pouvez observer plusieurs cycles mitotiques successifs afin de mieux comprendre. Ensuite, vous pouvez ajouter des médicaments, des ARN ou tout autre type de perturbation sur les cellules que vous souhaitez étudier. Vous pouvez ainsi déterminer comment ces médicaments ou ces gènes jouent un rôle important dans la régulation de la progression mitotique.

Étant donné qu'il ne s'agit ni de travaux sur des cellules fixées ni de travaux sur des cellules vivantes, vous pouvez comprendre quel type de perturbation est nécessaire pour affecter la mitose, ou à quel stade de la mitose cette perturbation agit. C'est donc particulièrement puissant à cet égard. Quels sont les principaux éléments techniques de ces expériences ?

Quels sont les problèmes possibles ? Eh bien, le plus grand problème, outre la mise en place du dispositif, est que cette mise en place n'est pas une tâche anodine. Beaucoup de personnes possèdent le dispositif, mais il est essentiel de s'assurer qu'il fonctionne correctement pour votre application.

L'élément financier n'est pas, vous savez, négligeable. Il y a donc la mise en place de l'appareil, puis, une fois les données recueillies, un véritable problème d'analyse des données. Prenez ces vidéos : si vous enregistrez 40 vidéos, chacune comportant 30 cellules, vous avez alors 40 champs que vous venez d'enregistrer, et chacun de ces champs contient 30 cellules. Vous devez alors vous asseoir devant chacune de ces vidéos et examiner chaque cellule présente dans la vidéo.

Il faut donc vraiment beaucoup de temps pour effectuer l'analyse des données. Ainsi, il vous faut une semaine pour analyser des données que vous avez collectées en deux jours. Cela constitue un obstacle très important en ce qui concerne l'acquisition de grandes quantités de données.

Il ne s'agit donc pas, malgré la collecte de données à haut débit, d'une analyse à haut débit. Que faudrait-il faire pour rendre cette expérience véritablement à haut débit ? Notre laboratoire est en train de développer un programme qui effectue automatiquement l'analyse des données.

Et c'est un programme plutôt bon. Il n'est pas parfait. L'œil humain est toujours meilleur, mais il s'en rapproche.

Quelles sont donc les applications intéressantes de cette expérience ? Y a-t-il d'autres domaines que vous pourriez mentionner, outre la division cellulaire ?

Vous voulez dire pour, oh, pour l'imagerie de cellules vivantes ? Oui. Eh bien, vous pouvez réaliser des tests de motilité cellulaire. Vous pouvez, selon la microscopie utilisée, observer comment les cellules se déplacent, ou même suivre le développement d'une tumeur si vous le souhaitez vraiment.

Mais là, vous, tant que vous disposez du bon dispositif d'imagerie, vous êtes pratiquement sans limitation en ce qui concerne tout paramètre. Notre microscope est simplement un modèle à champ large et nous utilisons un objectif 20 x 20. C'est donc un dispositif à assez faible résolution, mais cela suffit pour ce que nous devons observer.

Il existe donc des cas, mais il n’y en a certainement pas d’autres, où vous ne seriez pas limité. Toute expérience de nature dynamique, ce qui inclut la biologie, tirerait réellement profit de l’imagerie en conditions de vie. Ainsi, l’imagerie calcique, bien que vous ne puissiez pas la réaliser sur notre appareil, concerne des cellules vivantes.

Vous avez certainement besoin d'imagerie de cellules vivantes pour cela. Comme je l'ai dit, les tests sur des échantillons de patients, les tests de mobilité et ce genre d'analyses bénéficieraient grandement de l'imagerie de cellules vivantes. Souhaitez-vous dire quelques mots sur votre expérience antérieure ?

Depuis combien de temps travaillez-vous sur ces techniques ? Sur quoi avez-vous travaillé auparavant ? Incroyable. Alors, durant mon doctorat, je n'ai pas travaillé.

J'ai fait beaucoup de microscopie confocale, mais pas d'imagerie en conditions de vie. Ainsi, durant mon postdoctorat, j'ai aidé le Dr King à mettre en place cet appareil que nous avons utilisé pour préparer ces fragments et le faire fonctionner. Et donc, durant mon postdoctorat, j'ai acquis une grande expérience tant en microscopie grand champ avec imagerie en laps de temps sur notre microscope, qui est en grand champ, qu'en imagerie en laps de temps par microscopie confocale.

Et je dirais que c'est vraiment puissant. On obtient beaucoup d'informations, mais ce n'est pas facile à faire fonctionner parfaitement. Cela demande donc beaucoup d'attention et une grande rigueur dans les moindres détails à chaque petite étape du processus.

Et ensuite, vous avez toujours des problèmes. C'est donc une application délicate, mais vous pouvez vraiment obtenir, si c'est ce dont vous avez besoin pour étudier votre problème, votre problème scientifique, alors cela s'avère inestimable à cet égard, même si c'est difficile. Trouvez donc quelqu'un qui sait ce qu'il fait et faites appel à lui.

C'est mon conseil. Tellement bon.