Name: Dissection fine et globale de lépithélium sensoriel de loreille interne adultes poisson zèbre ( Danio rerio) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Découvrez la dissection fine de l'épithélium sensoriel de l'oreille interne chez Danio rerio adulte. Cette méthode permet d'isoler les tissus pour étudier la régénération des cellules ciliées chez les vertébrés.

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Cette recherche a été financée par le Programme de recherche intra-muros de la National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health.

Partie 1: Préparation du tissu <ol><li> Euthanasier le poisson zèbre adulte avec tamponné MS-222 (éthyl 3-aminobenzoate sel méthanesulfonate, 0,03%). </li><li> Décapiter le poisson. Coupez la mâchoire inférieure, placer la tête sur le pavé de dissection avec la face ventrale en place, et à immobiliser le tissu avec des épingles insectes. Enlever les tissus mous ventrale du crâne et du crack ouvrir la partie ventrale de la capsule crâne avec une paire de pinces fines sous un microscope de dissection. </li><li> Fixer la tête du poisson dans du paraformaldéhyde (4%) à 4 ° C pendant la nuit. </li><li> Rincez la tête du poisson fixés dans du PBS (Phosphate Buffered Saline, 1X) 3 fois, 5 minutes chaque fois. </li></ol> Partie 2: dissection brut de l&#39;oreille interne <ol><li> Placez la tête du poisson sur le pavé de dissection avec la place face ventrale. L&#39;immobiliser avec des épingles insectes. Toutes les étapes suivantes sont effectuées sous le microscope de dissection. </li><li> Avec une paire de pinces fines, enlever l&#39;os du crâne au cours de l&#39;oreille interne et retirez soigneusement les tissus oreille interne: saccules, lagenae, et utricules. Le saccule et Lagena sont étroitement attachent les uns aux autres et ainsi sortir ensemble tout l&#39;utricule (antérieur à la saccule et Lagena), va très probablement se détacher de l&#39;autre bout organes lors de la dissection. </li><li> Mettez les tissus oreille interne, dans du PBS (1X). Si aucune dissection amende supplémentaire est nécessaire, rincer le tissu 2-3 fois avec du PBS (1X) et il peut être utilisé pour d&#39;autres expériences, par exemple cryocoupes. </li></ol> Partie 3: la dissection fine de l&#39;épithélium sensoriel oreille interne <ol><li> La dissection fine peut être effectuée dans une goutte de PBS (1X) sur une lame de verre propre. </li><li> Retirer les otolithes utriculaire de l&#39;utricule avec deux paires de pinces fines, et, si désiré, couper le tissu non-sensorielle épithéliales et l&#39;innervation de l&#39;épithélium avec une paire de pinces fines et d&#39;une lame d&#39;aiguille. </li><li> Retirer les otolithes lagenar avant de se séparer et sacculaire lagenar épithélium alors essayez de garder le saccule toute aussi intact que possible. Placez le tissu dans la chute de PBS avec jusqu&#39;à la face ventrale. Utiliser la lame d&#39;aiguille à couper soigneusement entre les saccule et Lagena. Coupez l&#39;excès de non-sensorielle tissu épithélial et le innvervation avec des pincettes fine et la lame d&#39;aiguille, si désiré. </li></ol> Partie 4: coloration fluorescente des cellules ciliées sensorielles dans le épithélium <ol><li> Rincer l&#39;épithélium sensoriel avec PBT (1XPBS et 1% de Triton X-100) pour 3 fois, 5 minutes chaque fois. </li><li> Incuber avec l&#39;épithélium fluophore phalloïdine marquée (par exemple la farine Alexa 488 phalloïdine, la dilution 1:1000) pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Rincer l&#39;épithélium sensoriel avec PBT pour 3 fois, 10 minutes chaque fois. </li><li> Montez les épithélia sur une lame avec milieu de montage et de vérifier le tissu taché sous le microscope à fluorescence avec des filtres de longueur d&#39;onde appropriée. </li><li> Après dissection de succès et de la coloration, l&#39;épithélium intact avec coloration des cheveux forts ensemble de cellules peuvent être vus au microscope (fig. 1). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1211/fig1.png" alt="Figure 1" /> Figure 1. Les cellules ciliées de l&#39;épithélium sacculaire sensorielles ont été colorés avec Alexa Farine 488 phalloïdine (Vert). L&#39;échantillon de tissu a été disséqué et colorées comme mentionné dans le document. Plusieurs photos ont été prises à différentes positions de l&#39;échantillon et carrelée avec Adobe Photoshop 7.0. Barre d&#39;échelle = 150μm.

Dans ce protocole, nous avons décrit la dissection fine et globale de l&#39;épithélium sensoriel de l&#39;oreille interne de poisson zèbre adulte, ce qui nous permet de préparer l&#39;échantillon de tissu pour l&#39;étude des fonctions cellulaires et subcellulaires de l&#39;épithélium sensoriel. Afin de réaliser une dissection de succès, la toute première étape, la fixation, est très importante. Assurez-vous que vous utilisez toujours une solution de paraformaldéhyde fraîchement préparés par...

<table><tbody><tr><td>MS222 (sel de méthanesulfonate d'éthyle 3-aminobenzoate)</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solution saline tamponnée au phosphate, 10X)</td><td>Réactif</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 phalloidine</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI</td><td>Réactif</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Épingles à insectes</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-40</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Outil</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>Pincettes</td><td>Outil</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>Lame d’aiguille</td><td>Outil</td><td>Sharpoint</td><td>78-6810</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Microscope</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de dissection</td><td>Outil</td><td>eNasco</td><td>SB07840M</td><td></td></tr><tr><td>Poisson zèbre</td><td>Animal</td><td>Divers</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection fine et globale de l&#39;épithélium sensoriel de l&#39;oreille interne adultes poisson zèbre ( danio rerio)

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensoriels épithélium de l&#39;oreille interne sont les structures essentielles pour les fonctions de l&#39;ouïe et l&#39;équilibre. Par conséquent, il est important de comprendre les caractéristiques moléculaires et cellulaires de l&#39;épithélium, qui sont principalement composés de deux types de cellules: cellules ciliées (HC) et les cellules de soutien (SCS). Ici nous choisissons d&#39;étudier l&#39;épithélium sensoriel dans l&#39;oreille interne de poisson zèbre adulte, non seulement parce que les structures épithéliales sont hautement conservée chez tous les vertébrés étudiés, mais aussi parce que le poisson zèbre adulte est capable de régénérer HC, une capacité qui mammifères perdent peu après la naissance. Nous utilisons l&#39;oreille interne des poissons zèbres adultes comme un système modèle pour étudier les mécanismes de l&#39;oreille interne HC régénération dans les vertébrés adultes qui pourraient être utiles pour la thérapie clinique de l&#39;audition / équilibre des déficits dans l&#39;homme comme un résultat de la perte de HC. Ici, nous montrer comment faire des dissections globale et fine de l&#39;épithélium sensoriel dans l&#39;oreille interne de poisson zèbre adulte. La dissection brute supprime les tissus entourant l&#39;oreille interne et est utile pour préparer des coupes de tissus, ce qui nous permet d&#39;examiner la structure détaillée de l&#39;épithélium sensoriel. La dissection fines nettoie les tissus non-sensori-épithéliales de l&#39;épithélium de chaque individu et nous permet d&#39;examiner l&#39;hétérogénéité de l&#39;épithélium ensemble facilement dans l&#39;ensemble de montage des échantillons épithéliales.

L&#39;épithélium sensoriel de l&#39;oreille interne de poisson zèbre adulte est un bon modèle pour comprendre les mécanismes de la régénération des cellules de cheveux chez les vertébrés adulte. Ce protocole démontre la dissection fine de l&#39;épithélium, à travers lequel nous pouvons obtenir des échantillons de tissus pour étudier les événements de régénération au niveau cellulaire et subcellulaire.

Dissection fine et globale de l&#39;épithélium sensoriel de l&#39;oreille interne adultes poisson zèbre ( Danio rerio)

Les épithéliums neurosensoriels de l'oreille interne sont les structures cruciales pour les fonctions auditives et vestibulaires. Par conséquent, il est important de comprendre le...

Dans l'oreille interne du poisson zèbre, il existe trois paires de sacs, des organes terminaux semblables à des vésicules : l'utricule, le S et le Lana. L'utricule est situé le plus antérieurement, tandis que le S et le lega sont étroitement attachés l'un à l'autre et se trouvent postérieurement par rapport à l'utricule. Après une dissection macroscopique, le S et le lega restent attachés, et la structure pierreuse appelée otolithe peut être facilement observée dans chaque organe terminal lors de la dissection fine suivante. Le S et le lega sont séparés l'un de l'autre en coupant par la face ventrale.Les otolithes sont retirés et les tissus épithéliaux non sensoriels sont éliminés afin d'obtenir les tissus épithéliaux sensoriels provenant des trois organes sensoriels. Bonjour, je suis Jean Leon du laboratoire de Sean Burgess, section de génomique du développement à l'Institut national de recherche sur le génome humain. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une méthode de dissection fine et précise des épithéliums sensoriels de l'oreille interne chez le poisson zèbre adulte.Nous utilisons ce protocole dans notre laboratoire pour étudier l'expression génique dans les épithéliums sens

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Biologie

Ce protocole décrit une procédure pour identifier et disséquer les organes de l'zèbre adulte.

Dissection d&#39;organes sur le poisson zèbre pour adultes

Cet article décrit une approche pour le poisson-zèbre microdissect rétines avec et sans l'épithélium pigmentaire rétinien attachés, de un à trois embryons jours post-fécondation.

Microdissection de tissus embryonnaires Zebrafish Eye

Une méthode claire et standardisée pour la dissection et l'isolement du cœur poisson zèbre à de multiples stades de développement sont décrits. Techniques d'annotation et de quantification sont également discutés.

Dissection du cœur chez les larves, le poisson zèbre juvéniles et adultes, Danio rerio</em

Le but de cette vidéo est de montrer les procédures d'obtention de cellules saines intactes cheveux des organes de l'oreille interne du poisson zèbre adulte, puis de les utiliser pour les études de patch-clamp visant à caractériser les propriétés biophysiques de leurs canaux voltage-dépendants.

Les enregistrements de patch-clamp en cellules ciliées de l&#39;oreille Isolé du poisson zèbre

Ce document décrit comment un poisson zèbre adulte peut être immobilisé, intubé, et utilisé pour des expériences électrophysiologiques in vivo pour permettre des enregistrements et de la manipulation de l'activité neuronale chez un animal intact.

Enregistrement électrophysiologique dans le cerveau d&#39;Intact poisson zèbre adulte

Parce que de nombreux modèles de poisson zèbre de maladies neurologiques et non neurologiques sont étudiés dans les poissons adultes plutôt que l'embryon / larve, nous avons développé un dosage latéral de régénération de ligne quantitative qui peut être appliquée à des modèles de maladies de poisson zèbre adulte. Le dosage impliqué résolution au neuromastes 1) et 2) les niveaux cellulaires de cheveu.

Un test pour ligne latérale de régénération à l&#39;âge adulte de poisson zèbre

La microscopie électronique (EM) 2D à grande échelle, ou nanotomie, est l’application à l’échelle tissulaire de la résolution EM à l’échelle nanométrique. Nous décrivons ici une méthode universelle de nanotomie appliquée pour étudier le cerveau des larves de poisson-zèbre en bonne santé et lors de lésions cérébrales non invasives.

Numérisation Transmission à grande échelle Electron Microscopy (Nanotomy) de santé et de blessés Zebrafish cerveau

Nous présentons ici une série standardisée des protocoles d’observer le sillon oculaire supérieur, une structure récemment identifiés, évolutivement conservée dans le œil de vertébrés. À l’aide de larves de poisson zèbre, nous démontrons techniques nécessaires pour identifier les facteurs qui contribuent à la formation et la fermeture du sillon oculaire supérieur.

Visualisation du sillon oculaire supérieure durant l’embryogenèse Danio rerio

Nous présentons ici un protocole qui simplifie la mesure de lumière électrorétinogramme évoqués réponses des larve zebrafish. Une électrode roman éponge-pointe conique peut aider à rendre l’étude du développement visuel chez le poisson zèbre larvaire, à l’aide de l’électrorétinogramme ERG plus facile à réaliser avec des résultats fiables et à moindre coût.

Électrorétinogramme enregistrement chez le poisson zèbre larvaire, à l’aide d’électrode de pointe éponge en forme de cône de roman A

Un modèle de lésion cérébrale mécanique chez le poisson-zèbre adulte est décrit pour étudier les mécanismes moléculaires régulant leur capacité de régénération élevée. La méthode explique de créer une blessure par arme blanche dans le tectum optique de plusieurs espèces de petits poissons afin d’évaluer les réponses régénératives à l’aide d’immunomarquage fluorescent.

Modèle de blessure par arme blanche du tectum optique adulte à l’aide de poisson-zèbre et de Medaka pour l’analyse comparative de la capacité de régénération

L’article explique comment enlever chirurgicalement les yeux des larves vivantes de poisson zèbre comme première étape vers l’étude de la façon dont l’apport rétinien influence la croissance et le développement du tectum optique. En outre, l’article fournit des informations sur l’anesthésie larvaire, la fixation et la dissection cérébrale, suivies de l’immunohistochimie et de l’imagerie confocale.

Enlèvement des yeux chez les larves vivantes de poisson zèbre pour examiner la croissance et le développement du système visuel dépendants de l’innervation

Découvrez la dissection fine de l'épithélium sensoriel de l'oreille interne chez Danio rerio adulte. Cette méthode permet d'isoler les tissus pour étudier la régénération des cellules ciliées chez les vertébrés.

Dissection fine et globale de l'épithélium sensoriel de l'oreille interne adultes poisson zèbre ( Danio rerio)

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